黃芪減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠血管重塑

裴 芳，王新全，岳榮川，黃 驥，黃 婕，王旭開，于長青*

(1.中國人民武裝警察部隊 重慶市總隊醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 重慶 400061； 2.第三軍醫(yī)大學(xué) 大坪醫(yī)院 野戰(zhàn)外科研究所 心血管內(nèi)科 重慶市心血管病研究所，重慶 400042)

血管重塑與高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、支架術(shù)后再狹窄等多種疾病密切相關(guān)[1]。因此，尋找有效干預(yù)血管重塑過程的藥物并闡明其機(jī)制，將對上述疾病的防治起關(guān)鍵作用。黃芪是傳統(tǒng)中藥，近年研究發(fā)現(xiàn)黃芪對心血管系統(tǒng)有多種有益作用[2]，但其對血管重塑的影響尚不清楚。本研究擬探討黃芪對血管重塑的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑

SPF級雄性8周齡、體質(zhì)量(20±2)g C57BL/6小鼠[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2013- 0001]。AngⅡ、 Losartan(氯沙坦)及Masson染色試劑盒(Sigma-Aldrich公司)。黃芪注射液(粗提物；每mL含黃芪甲甙不少于1.0 mg，相當(dāng)于含生藥2 g，即黃芪濃度相當(dāng)于2 g/mL)(成都地奧制藥有限公司)。PCR引物(大連寶生物公司合成)。RNA提取試劑Trizol及RT-PCR試劑盒(Promega公司)。兔抗血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)及血管緊張素Ⅱ 1型受體(angiotensin Ⅱ type Ⅰ receptor, AT1R)多克隆抗體及小鼠抗β-actin單克隆抗體(Abcam公司)。HRP標(biāo)記的抗兔及小鼠二抗(Jackson ImmunoResearch公司)。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥：動物實驗獲得第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。將40只小鼠隨機(jī)均分為對照組、Ang Ⅱ組，Ang Ⅱ+氯沙坦和Ang Ⅱ+黃芪(astragalus membranaceus)組。其中，對照組每天灌胃0.2 mL 0.9%氯化鈉注射液1次；Ang Ⅱ 組采用背部埋微滲透泵的方法，以200 ng/(kg·min)的劑量持續(xù)泵入AngⅡ；AngⅡ+ 氯沙坦組在AngⅡ處理的同時，以10 mg/(kg·d)的劑量每天灌胃1次；AngⅡ+黃芪組在AngⅡ處理的同時，以20 g/(kg·d)的劑量每天灌胃1次。藥物作用的總時長為14 d。

1.2.2 小鼠血壓測定：采用尾套法，用小鼠血壓儀每天上午8點左右測定靜息和清醒狀態(tài)下小鼠收縮壓。每2天測量1次。

1.2.3 血管形態(tài)及纖維化程度檢測：取第14天小鼠升主動脈，并進(jìn)行HE染色和Masson染色，檢測血管形態(tài)和血管纖維化程度。

1.2.4 RT-PCR檢測Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)：用去RNA酶的剪刀在冰浴條件下將收集的主動脈剪碎，加入Trizol研磨，進(jìn)行酚氯仿抽提和乙醇沉淀獲得RNA。將RNA溶于去RNA酶的水中并測定濃度。以1 μg RNA為模版，采用RT-PCR試劑盒合成cDNA。以等體積cDNA為模版，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增Ⅰ型膠原蛋白及內(nèi)參GAPDH。Ⅰ型膠原蛋白正、反向引物序列為：正向引物5′-GTGAACCTGGCA AACAAGGT-3′；反向引物5′-CTGGAGACCAGAGAA GCCAC-3′。GAPDH正、反向引物序列為：正向引物 5′-ACATCATCCCTGCATCCACT-3′；反向引物5′-CC TGCTTCACCACCTTCTTG-3′。退火溫度均為58 ℃，擴(kuò)增25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢樣，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并用Quantity One軟件對電泳條帶進(jìn)行吸光度分析。Ⅰ型膠原蛋白與內(nèi)參GAPDH的吸光度比值作為各組的相對表達(dá)量。

1.2.5 Westerm blot檢測ACE2及AT1R蛋白表達(dá)：提取主動脈組織的總蛋白，用BCA檢測試劑盒測定蛋白濃度。各組取50 g等量蛋白煮沸變性后，用10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳。半干法將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h。兔抗ACE2一抗(1∶1 000)、兔抗AT1R一抗(1∶1 000)及小鼠抗β-actin一抗(1∶2 000)4 ℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的抗兔及小鼠二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h。采用ECL發(fā)光試劑盒在暗室中膠片成像。掃描后采用Quantity One分析條帶吸光度值。目的蛋白與內(nèi)參β-actin的吸光度比值作為各組的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪對收縮壓的影響

對照組及未經(jīng)任何處理小鼠收縮壓約為105 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。給予AngⅡ后，收縮壓隨時間延長逐漸升高，第10天以后維持在165 mmHg左右；氯沙坦可以完全對抗AngⅡ?qū)ρ獕旱挠绊懀稽S芪在給藥第6天開始可以顯著降低AngⅡ引起的血壓升高(P<0.05)，且該作用一直持續(xù)到第14天。與氯沙坦治療組相比，黃芪組的血壓在第6～14天之間仍然較高(P<0.05)(圖1)。

2.2 黃芪對主動脈壁厚度及纖維化的影響

與對照組相比，AngⅡ處理14 d后，主動脈管壁厚度明顯增加并發(fā)生嚴(yán)重纖維化，引起明顯的血管管重塑。與AngⅡ處理組相比，氯沙坦治療組幾乎完全抑制AngⅡ?qū)е碌墓鼙谠龊窈屠w維化，黃芪治療也可顯著降低AngⅡ引起的管壁增厚和纖維化(圖2)。

#P<0.05 compared with control and AngⅡ+Losartan group; *P<0.05, **P<0.01 compared with AngⅡ group圖1 黃芪對AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠血壓升高的影響Fig 1 Effect of astragalus on AngⅡ induced elevation of blood pressure in mice

AngⅡ處理組Ⅰ型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著升高，氯沙坦可將其降低到對照組水平，而黃芪治療組表達(dá)水平介于二者之間(圖3)，與Masson染色結(jié)果相一致。

2.3 黃芪對ACE2及AT1R蛋白表達(dá)的影響

AngⅡ處理后可以顯著下調(diào)ACE2的表達(dá)并顯著上調(diào)AT1R的表達(dá)。氯沙坦治療幾乎完全逆轉(zhuǎn)上述改變，而黃芪則部分逆轉(zhuǎn)ACE2的下調(diào)和AT1R的上調(diào)(圖4)。

圖2 黃芪對AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠主動脈增厚及纖維化增強(qiáng)的影響Fig 2 Effect of astragalus on AngⅡ induced thickening and increased fibrosis of aorta in mice (×10)

#P<0.05 compared with control and AngⅡ+Losartan group; *P<0.05 compared with AngⅡ group 圖3 黃芪對AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠主動脈Ⅰ型膠原蛋白轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響Fig 3 Effect of astragalus on AngⅡ induced transcriptional expression of collagen Ⅰ of aorta in mice

#P<0.05 compared with control and AngⅡ+Losartan group; *P<0.05 compared with AngⅡ group 圖4 黃芪對AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠主動脈ACE2及AT1R蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of astragalus on AngⅡ induced protein expression of ACE2 and AT1R of aorta in mice

3 討論

ACE2是降解AngⅡ?qū)蛊洳±碜饔玫年P(guān)鍵酶[3]，而AT1R是介導(dǎo)AngⅡ病理作用的關(guān)鍵受體[4]。本研究采用皮下埋微滲透泵持續(xù)泵入AngⅡ的方法建立血管重塑模型，結(jié)果顯示：AngⅡ使主動脈管壁明顯增厚、纖維化增強(qiáng)，收縮壓顯著增高，表明模型建立成功[5]；AT1R拮抗劑-氯沙坦幾乎可以完全逆轉(zhuǎn)AngⅡ引起的管壁增厚、纖維化和血壓升高；當(dāng)AngⅡ升高時，ACE2表達(dá)受抑制，而AT1R表達(dá)增加，這與既往研究的結(jié)果一致[6- 7]，進(jìn)一步證實了本研究血管重塑模型的可靠性。

黃芪是傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)氣固表、利水消腫及斂瘡生肌之功效。黃芪的化學(xué)成分十分復(fù)雜，包括皂甙類、黃酮類、多糖類以及各種微量元素，因此，其藥理作用也十分廣泛。研究表明，在心血管系統(tǒng)，黃芪具有降低血壓、保護(hù)心肌、對抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮舒張功能、對抗動脈粥樣硬化等作用[8- 12]。但是，黃芪對血管重塑的影響尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪口服液灌胃可以顯著抑制AngⅡ引起的血壓升高和血管重塑，起到相當(dāng)于氯沙坦一半的效果。氯沙坦是AT1R的特異性阻斷劑，因此可以完全對抗AngⅡ的作用。黃芪部分對抗AngⅡ的作用提示其發(fā)揮作用的機(jī)制可能是間接的。進(jìn)一步檢測ACE2及AT1R證實，黃芪可以部分上調(diào)ACE2并下調(diào)AT1R，其調(diào)控二者表達(dá)的水平與其治療作用相關(guān)。因此，黃芪可能通過調(diào)控ACE2及AT1R的表達(dá)對抗AngⅡ誘導(dǎo)的血管重塑。本研究采用的黃芪注射液為黃芪粗提物，包含黃芪皂甙、黃酮、多糖等多種成分。既往研究表明，黃芪皂甙及黃芪總黃酮對缺血缺氧心肌具有保護(hù)作用，而黃芪多糖在調(diào)節(jié)免疫及抗衰老方面可能發(fā)揮更大作用。在本研究中，粗體物中的哪一種或哪幾種成分、通過與哪些分子結(jié)合起到調(diào)控ACE2及AT1R表達(dá)的作用尚不清楚，有待采用黃芪的單一提取物做進(jìn)一步研究。此外，黃芪不完全對抗AngⅡ的作用提示黃芪可能具有較小的副作用。探討聯(lián)合其他作用溫和的藥物，達(dá)到最大療效及最小副作用的目的，也是未來研究的方向之一。

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