細胞自噬緩解氧-糖剝奪誘導原代培養小鼠腦皮質神經元缺血損傷

陳璐勔，羅艷琳，趙 麗，韓 松，李淑娟，李俊發*

(首都醫科大學1.神經生物學系 北京腦重大疾病研究院，北京100069；2.附屬北京朝陽醫院神經內科，北京 100020)

自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴性降解途徑，并被認為是細胞進行自我保護的一種重要機制[1]。關于自噬在腦缺血和缺血再灌注過程中的作用一直存在爭議，一些研究者認為自噬在腦缺血損傷中起到保護作用；而另一些學者則認為自噬加重腦缺血損傷。究其原因，可能主要與研究者所選擇的實驗模型有關，即缺血/低氧或再灌注時間的差異可能造成不同的實驗結果。如在大鼠腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型與原代培養皮質神經元中發現，自噬在缺血/再灌注中起保護作用，且這種保護作用不因再灌注時間的長短而改變[2- 4]。然而，其他研究者在不同實驗條件下發現，隨著氧-糖剝奪(oxygen glucose deprivation, OGD)時間的延長，自噬逐漸對細胞起損害作用[5- 6]。這些研究結果提示，缺血/低氧程度可能對于研究細胞自噬在腦缺血性損傷中作用有重要意義。據此，本實驗擬利用原代培養小鼠腦皮質神經元OGD模擬離體缺血模型，選擇不同OGD強度并利用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(BafA1)，探討細胞自噬在OGD誘導神經元缺血損傷中作用，并為深入研究神經元在不同缺血強度狀態下，自噬的具體細胞信號激活機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級， 出生24 h內的C57BL/6J乳鼠，雌雄不拘。購于首都醫科大學動物部，SCXK(京)2012- 0001。

1.2 主要試劑

NeurobasalTM、B27、谷氨酰胺、雙抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)和無糖DMEM(Gibco公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Pierce公司)，兔源性LC3多克隆抗體，Bafilomycin A1(Sigma-Aldrich公司)，兔源性Beclin- 1多克隆抗體和鼠源性β-actin單克隆抗體(Proteintech公司)，CytoTox 96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒(Promega公司), 3-(4,5-二甲基噻唑-2)- 2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Applichem公司)。

1.3 神經元氧-糖剝奪(OGD)模型制備

選用培養8 d生長狀態良好的神經元，更換為無糖培養基，放入37 ℃、通有混合氣體(5% CO2, 2% O2和93% N2)的低氧培養箱。分別于15、30、60、90和120 min后取出，更換為正常培養液，并置于37 ℃、5% CO2飽和的常氧培養箱中繼續培養24 h。為明確自噬在神經元OGD損傷中的作用，自噬抑制劑BafA1在細胞進行OGD前即刻加入，并在細胞培養基中保持終濃度為100 nmol/L。

1.4 Western blot檢測

蛋白樣品制備、SDS-PAGE和Western blot參照文獻[14]。提取全細胞蛋白、BCA法定量。取30 g蛋白樣品，進行電泳(12% SDS-PAGE,4 ℃,20～30 mA)和轉膜(PVDF膜,400 mA,1 h)。先后用兔源性抗Beclin- 1(1∶1 000)、LC3(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗(1∶4 000)進行免疫雜交；然后用ECL發光，X-線片曝光、顯影、定影。Western blot結果用Quantity One軟件進行定量分析。

1.5 MTT比色法

將細胞接種于96孔板，經OGD處理后加入MTT，并避光37 ℃溫浴4 h。MTT可被線粒體內脫氫酶還原生成結晶狀深紫色產物甲臜(formazan)，用DMSO將其完全溶解后，通過酶標儀測定490 nm波長的吸光度(A490)，來計算細胞存活率。

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率

在96孔板接種細胞，按照CytoTox 96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒規定步驟，定量測量(A490)細胞LDH漏出率，來確定細胞損傷水平。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 OGD處理對原代培養腦皮質神經元內自噬相關蛋白Beclin- 1表達水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響

經15～120 min OGD/復糖復氧(R)24 h處理后，原代培養神經元內Beclin- 1蛋白表達水平隨OGD處理時間延長顯著升高，且于30 min達到峰值1.80±0.08倍 (P<0.05) (圖1)。同樣，代表自噬水平的LC3Ⅱ/Ⅰ比值在OGD處理后15～120 min的變化趨勢與Beclin- 1蛋白表達水平相似，均在30 min OGD處理后達到峰值1.60±0.02倍 (P<0.05) (圖2)。

2.2 自噬抑制劑BafA1對OGD處理神經元內自噬相關蛋白表達和缺血損傷的影響

選取自噬最為活躍的時間點，OGD 30和60 min/R 24 h，觀察神經元損傷情況。MTT結果(圖3A)示，30和60 min OGD/R 24 h神經元的存活率分可使神經元死亡率分別為(33.1±1.9)%和(39.9±1.4)%。然而，在終濃度100 nmol/L自噬抑制劑BafA1作用下，60 min OGD/R 24 h處理的神經元存活率下降為(49.3±1.5)%，較單純60 min OGD/R 24 h處理神經元的存活率顯著下降(P<0.05)，同樣，LDH漏出率結果顯示，BafA1抑制自噬后，30和60 min OGD/R 24 h處理神經元死亡率分別增加至(36.8±0.6)%和(51.2±1.5)%，且60 min OGD/R 24 h組神經元死亡率顯著增加 (P<0.05) (圖3B)。此外，進一步明確了BafA1對OGD處理神經元存活率和死亡率的影響是通過對細胞自噬的抑制作用(P<0.05) (圖4)。

A.the typical result of Western blot showed the changes of Beclin- 1 (60 ku) expression in primary cultured cortical neurons with oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment; B.the results of quantitative analysis demonstrated that the Beclin- 1 expression increased;*P<0.05 conpared with 0 min OGD (normoxic control)

圖1不同OGD處理時間對原代培養小鼠腦皮質神經元內Beclin-1表達水平的影響
Fig1EffectofOGDexposuretimeonBeclin-1expressionlevelinprimaryculturedcorticalneuronsofmice(n=6)

A.the typical result of Western blot showed the changes of LC3Ⅰ (17 ku) and LC3Ⅱ (14 ku) expressions in primary cultured cortical neurons with OGD treatment; B.the results of quantitative analysis demonstrated that the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ increased significantly with OGD exposure time；*P<0.05 compared with 0 min OGD (normoxic control)

圖2不同OGD處理時間對原代培養小鼠腦皮質神經元內LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響
Fig2EffectofOGDexposuretimeonLC3Ⅱ/Ⅰratioinprimaryculturedcorticalneuronsofmice(n=6)

3 討論

細胞自噬在腦缺血病理生理變化中扮演著重要的角色，明確自噬在腦缺血中發揮的作用是挽救缺血性腦卒中患者生命的關鍵[7- 10]。OGD致離體細胞缺血模型可解決整體動物實驗難以解決的問題，并避免了諸多體內因素的干擾，非常便于觀察藥物的作用， 以及進一步探討保護或損傷的細胞分子機制。

A.the results of MTT(cell survival); B.LDH(cell death) assaies demonstrated that autophagy inhibitor BafA1could significantly aggravate 60 min OGD/24 h R-induced ischemic injury in primary cultured cortical neuron of mice;*P<0.05 compared with normoxia;#P<0.05 compared with 60min OGD without BafA1treatment

圖3自噬抑制劑BafA1對30～60minOGD處理神經元缺血性損傷的影響

Fig3EffectofautophagyinhibitorBafA1on30～60minOGD-inducedischemicinjuriesinprimaryculturedcorticalneuronofmice(n=6)

The results of typical Western blot and quantitative analysis showed that the autophagy inhibitor BafA1, which is a specific inhibitor of vacuolar H+ ATPase to prevent the fusion between autophagosomes and lysosomes, could significantly induce the accumulation of LC3II in primary cultured cortical neurons after 60 min OGD/24 h R;*P<0.05 compared with normoxia;#P<0.05 compared with 60 min OGD

圖4自噬抑制劑BafA1對60minOGD處理神經元內LC3Ⅱ/Ⅰ比值的影響

Fig4EffectofautophagyinhibitorBafA1ontheLC3Ⅱ/Ⅰrationinprimaryculturedcorticalneuronsafter60minOGDtreatment(n=6)

因此，原代培養小鼠腦皮質神經元OGD模型，可研究缺血/缺氧時神經元自噬是否被激活及其激活程度，更重要的是能更直接地研究神經元自噬在缺血/缺氧性損傷中作用，為深入研究腦缺血/低氧性損傷和適應機制打下了良好基礎[11- 14]。本研究結果表明，離體培養神經元經OGD/24 h R處理后， OGD1 5 min即可誘發原代培養小鼠腦皮質神經元的自噬發生，OGD 30 min即可使神經元內自噬水平達到峰值，然而隨著時間的延長，神經元自噬水平略微下降，損傷情況加重，提示神經元的損傷方式可能已發生了改變，即凋亡和壞死途徑被觸發。而細胞自噬可緩解OGD致小鼠腦皮質神經元的缺血性損傷，并在60 min OGD/R 24 h的保護作用更明顯。

總之，本實驗在原代培養神經元的缺血性損傷中證實，自噬可以對抗OGD致神經元的損傷作用，且這種作用與時間密切相關，隨著OGD時間的延長，其他細胞死亡方式被觸發，自噬的保護作用被削弱。提示臨床上治療缺血性腦卒中不僅要在合適的時間點發揮自噬的保護作用，還要注意抑制其他細胞死亡方式的發生。總之，OGD可誘發原代培養小鼠腦皮質神經元自噬發生，且細胞自噬可緩解OGD處理腦皮質神經元的缺血損傷。

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