Shh促進BMP9誘導的小鼠間充質干細胞C3H10T1/2的成骨分化

李 麗，董 謙，馮巧靈，王玉鳳，何通川，羅進勇

(重慶醫科大學 檢驗醫學院 檢驗醫學教育部重點實驗室 重慶市重點實驗室， 重慶 400016)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有極強的增殖能力和多向分化潛能，常作為種子細胞修復、重建受傷或發生病變的多種組織器官，目前在骨再生研究中應用廣泛[1- 2]。

MSCs在定向成骨分化過程中受多種細胞因子調控，其中骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)家族發揮了重要作用。BMPs屬于轉化生長因子β(transform growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一，目前已分離和鑒定出20余種，其中BMP2和BMP7已應用于臨床[1,3]。本實驗前期研究發現：BMP2-BMP15中，BMP9誘導MSCs成骨分化的能力最強[3]。

Shh是由SHH (Sonic Hedgehog)編碼的一種分泌型糖蛋白，可與細胞膜上跨膜受體Patched結合活化另一跨膜受體Smoothened，進而調控細胞內Gli轉錄因子的活性而激活SHH信號通路。有研究報道在脊椎動物的生長過程中BMP2和BMP4可與SHH共同調控骨骼的形成[4- 5]。然而對于Shh是否可以調控BMP9誘導的MSCs成骨分化的作用目前并不清楚。因此，本研究旨在觀察Shh對BMP9誘導MSCs成骨分化的影響，并初步探討其可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

腺病毒Ad-Shh和Ad-RFP(本實驗室構建)，Ad-BMP9和p12SBE-luc(芝加哥大學醫學中心何通川教授惠贈)；C3H10T1/2和HCT116 細胞(本實驗室保存)；DMEM高糖培養基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，ALP定量檢測試劑盒(BD公司)；Naphthol AS-MX 堿性磷酸酶溶液、Fast Blue RR Salt、茜素紅S、β-磷酸甘油和維生素C(Sigma公司)；Lipofectamin2000TM(Invitrogen公司)；熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司)；PCR引物(上海百力格公司)；一抗β-actin、OPN、OCN、Runx2、DLX5、BMP9和總Smad1/5/8(Santa Cruz公司)，一抗Phosphor-Smad1/5/8(Cell Signaling公司)；其他試劑為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：C3H10T1/2和HCT116細胞用含10%胎牛血清和100 mmol/L的青霉素以及100 g/L的鏈霉素的DMEM高糖培養基培養于37 ℃，含5% CO2的細胞培養箱。

1.2.2 條件培養基的制備：接種HCT116細胞于60 mm的細胞培養皿中，待細胞匯合至70%～80%時感染適當滴度的Ad-BMP9，4～6 h后換為無血清無雙抗的DMEM高糖培養基培養，分別收集24和48 h的上清液[6]。

1.2.3 C3H10T1/2細胞的分化誘導：將C3H10T1/2細胞接種于24孔板中，待細胞匯合至30%～40%時加入適當滴度的 Ad-Shh或Ad-RFP，24 h后加入BMP9條件培養基，培養適當時間進行ALP和鈣鹽沉積實驗(鈣鹽誘導時需加入50 mg/L的維生素C和10 mmol/L的β-磷酸甘油)。

1.2.4 ALP活性的測定和染色：C3H10T1/2細胞成骨分化誘導5或7 d，棄去培養基，加入裂解液后離心取上清，按試劑盒說明進行ALP活性測定。棄去培養基后加入0.1 g/L色酚AS-MX(Naphthol AS-MX)堿性磷酸酶溶液和0.6 g/L 固牢藍(Fast Blue RR Salt)混合液200 μL進行ALP染色，避光30 min后觀察染色結果。

1.2.5 鈣鹽沉積實驗：C3H10T1/2細胞成骨分化誘導14 d后棄去培養基，PBS清洗兩次，每孔加入0.4%的戊二醛固定10 min后雙蒸水(ddH2O)終止并加入0.4%茜素紅S染液300 μL，待出現紅色鈣鹽物質沉積時棄去染液，ddH2O終止反應并洗滌，在顯微鏡下觀察鈣鹽結節并成像。

1.2.6 熒光素酶活性的檢測：C3H10T1/2細胞接種于T25細胞培養瓶中，待細胞匯合至30%時換為無血清無雙抗的改良Eagle培養基(DMEM高糖培養基)，同時用Lipofectamin2000TM轉染p12SBE-luc質粒3 μg，4～6 h后換為新鮮培養基培養過夜，將細胞接種于24孔板中，待貼壁后加入處理因素，分別檢測24和36 h的熒光素酶活性。

1.2.7 RT-PCR：C3H10T1/2細胞接種于60 mm的細胞培養皿中，待細胞匯合至50%時加入處理因素，在所需時間點提取細胞RNA，反轉錄反應制備成cDNA，小鼠GAPDH基因作為內參照，RT-PCR檢測基因表達。引物序列見表1。

1.2.8 Western blot：C3H10T1/2細胞接種于60 mm的細胞培養皿中，加入處理因素后在所需時間點提取細胞總蛋白，按步驟進行Western blot檢測。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The sequence of primers for RT-PCR

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Shh不影響C3H10T1/2細胞中內源性BMP9的表達

Ad-Shh感染C3H10T1/2細胞(圖1A)，感染24 h時Shh的mRNA表達量增加(P<0.05)(圖1B)，48 h時，內源性BMP9的mRNA及蛋白的表達無明顯變化(圖1C，D)。

2.2 Shh促進了BMP9誘導的C3H10T1/2細胞早期成骨分化

5和7 d時，Shh促進了BMP9誘導的早期成骨指標ALP的活性(P<0.05)(圖2A)，ALP染色明顯增強(圖2B)。

2.3 Shh促進了BMP9誘導的C3H10T1/2細胞晚期成骨分化

14 d時，Shh促進了BMP9誘導的晚期成骨指標鈣鹽沉積(圖3A)。Shh促進了BMP9誘導的晚期成骨指標OPN和OCN的mRNA(9 d)及蛋白(11 d)的表達(P<0.05)(圖3B，C)。

2.4 Shh促進了BMP9誘導的成骨相關基因的表達

1和3 d時，Shh增強了BMP9誘導的Id1、Id2、Id3、Runx2和CTGF的mRNA水平(P<0.05)(圖4A)。48 h時，Shh可增強BMP9誘導的Runx2及DLX5的蛋白表達(P<0.05)(圖4B，C)。

2.5 Shh對BMP9誘導的經典Smad信號通路的影響

Shh使BMP9誘導的熒光素酶活性增強(P<0.05)(圖5A)。30min時，Shh并未影響BMP9誘導的Smad1/5/8的磷酸化(圖5B)。

3 討論

本實驗前期研究發現BMP9誘導MSCs成骨分化的能力最強[3]。大量研究表明，經典Smad、核受體PPARγ、經典Wnt/β-catenin、Notch和TGF-β等信號通路在BMP9誘導的MSCs成骨分化過程中都發揮著重要作用， 形成復雜的信號傳導網絡[7- 8]。有研究報道SHH也可調控成骨分化和骨形成[4- 5]，但具體作用并不清楚。所以本實驗主要研究Shh是否可調控BMP9誘導的MSCs成骨分化。

A.Ad-Shh can infect C3H10T1/2 cells(×100); B.expression of Shh detected by RT-PCR,*P<0.05 compared with Ad-RFP group; C, D.endogenous expression of BMP9 detected by RT-PCR and Western blot

圖1Shh不改變內源性BMP9的表達
Fig1ShhdonotchangeendogenousexpressionofBMP9

A.ALP activity determined by ALP quantitative assay, *P<0.05 compared with RFP+BMP9 group; B.ALP staining assay 圖2 Shh促進BMP9誘導的C3H10T1/2細胞早期成骨分化Fig 2 Shh enhances BMP9-induced early osteogenic differentiation of C3H10T1/2 cells

A.calcium depositon detected by Alizarin Red S(×100); B, C.expressions of OPN and OCN detected by RT-PCR and Western blot,*P<0.05 compared with BMP9 group

圖3Shh促進BMP9誘導的C3H10T1/2細胞晚期成骨分化
Fig3ShhenhancesBMP9-inducedlaterosteogenicdifferentiationofC3H10T1/2cells

實驗發現Shh促進了BMP9 誘導的C3H10T1/2細胞的早期成骨指標ALP和晚期成骨指標OPN、OCN的表達以及鈣鹽沉積，也促進了BMP9 誘導的成骨相關基因Id1、Id2、Id3、CTGF、DLX5和Runx2的表達。質粒p12SBE-luc在報告基因前插入了12個連續的Smad蛋白結合元件(Smad binding element，SBE)， Smad經典途徑激活后可啟動熒光素酶的表達[6]。觀察機制時發現Shh增強了BMP9誘導的Smad的熒光素酶活性，但并未改變其磷酸化水平，這可能是由于SHH下游轉錄因子Gli直接作用于Smad所致。因此后續將通過IP實驗檢測Gli與Smad之間的作用。

A.expressions of Id1, Id2, Id3, Runx2 and CTGF detected by RT-PCR,*P<0.05 compared with BMP9 group; B,C.expressions of Runx2 and DLX5 detected by Western blot,*P<0.05 compared with BMP9 group

圖4Shh促進BMP9誘導的成骨相關基因的表達
Fig4ShhenhancesBMP9-inducedexpressionofosteogenesisrelatedgenes

A.SBE luciferase activity detected at 24 and 36 hours,*P<0.05 compared with BMP9 group; B.Shh did not change the phosphorylated form of Smad1/5/8 determined by Western blot

圖5Shh對BMP9誘導的經典Smad信號通路的影響
Fig5EffectofShhonBMP9-inducedactivationofcanonicalSmadpathway

有研究報道Hedgehog信號通路可通過Gli2調控成骨關鍵轉錄因子Runx2的表達從而調節成骨分化[9]，接下來將通過染色質免疫共沉淀實驗探討Gli與BMP9下游成骨基因之間的關系。另外，還將構建Shh和Gli的干擾腺病毒，通過體內外實驗對Shh調控BMP9誘導的MSCs成骨分化的作用及其機制進行更深入的分析。

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