干擾素α通過P204和P21誘導(dǎo)大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞凋亡

龍向淑，吳 強(qiáng)，宋 方，黃 晶，張林軍

(貴州省人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 貴州 貴陽 550002)

細(xì)胞凋亡、增殖及分化等均是維持生物體動(dòng)態(tài)平衡必需的細(xì)胞活動(dòng)。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖增多及凋亡減少是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及血管成形術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病的主要發(fā)病機(jī)制。干擾素(interferon，IFN)與相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)一系列IFN刺激反應(yīng)基因(IFN stimulated genes，ISGs)表達(dá)而發(fā)揮其抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用[1- 3]。P204是IFN誘導(dǎo)蛋白P200家族的鼠類蛋白成員，研究顯示，IFN-α可誘導(dǎo)P204表達(dá)而抑制大鼠VSMCs及血管外膜成纖維細(xì)胞增殖[4- 6]，P21表達(dá)變化與P204呈一致性趨勢，提示P21可能參與P204對VSMCs增殖的調(diào)控[4]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN可誘導(dǎo)腫瘤及病毒感染細(xì)胞凋亡[1- 2]，但I(xiàn)FN對VSMCs凋亡的影響及其機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究用IFN-α和/或P204 siRNA處理大鼠原代VSMCs，觀察VSMCs凋亡及P204和P21表達(dá)的變化，為IFN及ISGs在血管增殖性疾病領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑(盒)

清潔級SD大鼠(雌性1只，雄性2只)，年齡約5周齡，體質(zhì)量120 ～140 g[第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：SCXK(渝)2012- 0003]。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)；DMEM高糖型細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(均Hyclone公司)；α-SMA單克隆抗體(BM0002)、即用型SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒(均武漢博士德公司)；四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](Sigma 公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1063)和Tubulin抗體(碧云天公司)；Trizol總RNA提取試劑(DP405)、2×Taq PCR MasterMix(KT201)和100 bp DNA Ladder(均北京天根公司)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；PCR擴(kuò)增引物由寶生物工程有限公司合成(大連)(表1)；P204抗體(Santa Cruz公司)；p21抗體(ab92675)(Abcam公司)。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

按文獻(xiàn)[7]的方法培養(yǎng)VSMCs。取4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分4組：非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組設(shè)為對照組(control)、IFN-α干預(yù)組(IFN)、IFI204 siRNA轉(zhuǎn)染組及IFI204 siRNA轉(zhuǎn)染+IFN-α干預(yù)組(siRNA+ IFN)。IFN組用終濃度為2×106U/L IFN-α干預(yù)6 h，siRNA組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA干預(yù)6 h，siRNA+IFN組先瞬時(shí)轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA干預(yù)6 h，后與IFN組同步加IFN-α干預(yù)6 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 RT-PCR檢測mRNA表達(dá)

按Trizol 總RNA提取試劑盒說明提取總RNA，取1 μg 按RT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取產(chǎn)物3 μL進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，UVP800型凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)

按文獻(xiàn)[8]的方法檢測蛋白表達(dá)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1063)說明書檢測細(xì)胞凋亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)因素對P204 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，IFN組P204 mRNA和蛋白表達(dá)增加，siRNA組P204 mRNA和蛋白表達(dá)減少，siRNA+IFN組P204 mRNA和蛋白表達(dá)減少(P<0.01)；與IFN組比較，siRNA組及siRNA+IFN組P204 mRNA和蛋白表達(dá)減少(P<0.01)(圖1，表2)。

2.2 IFN-α對VSMCs凋亡的影響

與對照組比較，IFN組細(xì)胞凋亡增多，siRNA組細(xì)胞凋亡減少，siRNA+IFN組細(xì)胞凋亡增多(P<0.01)；與IFN組比較，siRNA組細(xì)胞凋亡減少(P<0.01)；與siRNA組比較，siRNA+IFN組細(xì)胞凋亡增多(P<0.01)(圖2，表2)。

2.3 干預(yù)因素對P21 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，IFN組P21 mRNA及蛋白表達(dá)增加，siRNA組P21 mRNA及蛋白表達(dá)減少，siRNA+IFN組P21 mRNA及蛋白表達(dá)增加(P<0.01)；與IFN組比較，siRNA組P21 mRNA及蛋白表達(dá)減少(P<0.01)；與siRNA組比較，siRNA+IFN組P21 mRNA及蛋白表達(dá)增加(P<0.01)(圖3，表2)。

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA.siRNA transfaction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group圖1 干預(yù)因素對大鼠VSMCs P204 mRNA及 蛋白表達(dá)的影響Fig 1 Effect of intervention factor on expression of P204 mRNA and protein in VSMCs in rats

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA.siRNA transfaction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group

圖2 干預(yù)因素對大鼠VSMCs凋亡的影響Fig 2 Effect of intervention factor on cell apoptosis in VSMCs of rats

▲P<0.01 compared with control;*P<0.01 compared with IFN group；#P<0.01compared with siRNA group.

control.control group; IFN.IFN-α induction group; siRNA.siRNA transfaction group; siRNA+IFN.IFI204 siRNA transfaction and IFN-α induction group圖3 干預(yù)因素對大鼠VSMCs P21mRNA及蛋白 表達(dá)的影響Fig 3 Effect of intervention factor on expression of P21 mRNA and protein in VSMCs in rats

3 討論

物理損傷、化學(xué)刺激及炎性反應(yīng)等因素導(dǎo)致VSMCs過度增殖而凋亡減少是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及血管成形術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，因此，有效促進(jìn)VSMCs凋亡是防治上述疾病的措施之一。

IFN與相應(yīng)受體結(jié)合誘導(dǎo)一系列蛋白表達(dá)而發(fā)揮其抗病毒、影響細(xì)胞生長和分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及抑制腫瘤細(xì)胞，如肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等功能[1- 2, 9- 11]。P204是IFN誘導(dǎo)蛋白P200家族的鼠類蛋白成員之一，IFN-α可促進(jìn)P204表達(dá)而抑制大鼠VSMCs增殖及其部分機(jī)制已明確[4- 5]，但I(xiàn)FN-α對VSMCs凋亡有何影響？本結(jié)果顯示， IFN-α干預(yù)后P204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致VSMCs凋亡增加，進(jìn)一步證實(shí)P204表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的IFN-α誘導(dǎo)性，提示IFN-α可誘導(dǎo)P204表達(dá)而促進(jìn)VSMCs凋亡。P21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子的CIP/KIP家族成員，其啟動(dòng)子上有P53的結(jié)合位點(diǎn)，是P53調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的靶基因。P53能促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)分子，如Apaf- 1、Bax、Noxa和PUMA等的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡刺激的敏感性而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。本研究表明，單純IFN-α干預(yù)可誘導(dǎo)P204 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，伴P21 mRNA及蛋白表達(dá)增多，促進(jìn)VSMCs凋亡；轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA后P204 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，P21 mRNA及蛋白表達(dá)亦下調(diào)，VSMCs凋亡減少，提示P21表達(dá)變化與P204呈一致性趨勢，在IFN-α促進(jìn)VSMCs凋亡過程中，P21可能作為P204的下游蛋白而發(fā)揮其作用。除P204途徑外，是否尚存在IFN-α影響VSMCs P21表達(dá)的其他機(jī)制？本研究證實(shí)，轉(zhuǎn)染IFI204 siRNA后再加IFN-α干預(yù)，P204 mRNA和蛋白表達(dá)減少，而P21 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡增多，提示抑制VSMCs P204表達(dá)對IFN-α上調(diào)P21表達(dá)及促進(jìn)VSMCs凋亡的作用無明顯影響，除P204途徑外，IFN-α尚存在影響VSMCs P21表達(dá)的其他機(jī)制。

綜上所述，IFN-α可誘導(dǎo)VSMCs凋亡，該效應(yīng)可能與IFN-α促進(jìn)P204及P21表達(dá)有關(guān)，P204是作為P21的上游蛋白而發(fā)揮其作用，P204途徑僅為IFN-α影響P21表達(dá)調(diào)控VSMCs凋亡的機(jī)制之一。

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