重組的脂聯素調節肝細胞系L02基質金屬蛋白酶- 9表達及活性

陶冬英， 王 云，倪晶晶，楊菊林，范任華

(1.寧波衛生職業技術學院 人體形態教研室， 浙江 寧波 315104； 2.寧波市第二醫院 外科， 浙江 寧波 315100；3.長沙市中心醫院 檢驗科， 湖南 長沙 410004)

肝纖維化是各種肝細胞毒性物質對肝臟慢性損傷所引起的肝臟病理改變，日前研究認為，肝星狀細胞(hepatic stellaate cell，HSC)激活是肝纖維化的中心環節[1]。 脂聯素(adiponectin)是一種脂肪組織特異性分泌的蛋白質，它具有促進血漿游離脂肪酸氧化、抗動脈粥樣硬化等多種生物學功能[2]。近來研究發現脂聯素具有一定的抗肝纖維化作用，但脂聯素抗纖維化機制還未完全闡明，本研究擬構建人全長脂聯素真核表達質粒，轉染L02肝細胞檢測其表達，旨在為進一步研究脂聯素在肝纖維化中的作用及機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

L02細胞(東南大學病理教研室饋贈)，pEGFP-C1(Clontech公司)，Trizol reagent、Adiponectin、MMP- 9、內參β-Actin 引物、RT-PCR試劑盒、限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ(Takara公司)，脂質體Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，明膠(Sigma公司)，復性液、孵育液均購自Bio-Rad公司，Anti-Adiponectin鼠抗人抗體(Abcam公司)，HRP標記山羊抗鼠二抗(中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1 構建重組載體和轉染肝細胞：以人脂肪細胞總mRNA為模板，用RT-PCR方法擴增adiponectin基因外顯子全長DNA片段,引物見表1。經過限制性內切酶消化基因adiponectin，酶消化的PCR產物插入pEGFP-C1獲得重組綠色熒光蛋白載體adi-pEGFP-C1質粒。重組載體經酶消化鑒定和基因測序驗證重組載體構建成功。重組載體轉化到大腸桿菌JMl09中擴增，裂解細菌抽提純化重組載體質粒。然后，重組質粒用脂質Lipofectamine2000穩定轉染的L02細胞, 熒光顯微鏡計數熒光分布均勻的細胞，數500個細胞得出其中有熒光的細胞155個，轉染效率為31%， 用300 μg/mL的G418的篩選，獲得穩定的adi-pEGFP-C1/L02細胞系。細胞分組：未轉染肝細胞組(a組)、轉染空載體的肝細胞組(b組)、轉染重組脂聯素載體肝細胞組(c組)，用MTT法檢測各組的生存率，實驗重復3次(n=3)(圖1)。

1.2.2 RT-PCR檢測MMP- 9 mRNA表達：用Trizol reagent 提取上述各組L02總RNA，取1 μg進行反轉錄。反應體系如下：無RNAse H2O 7.5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL,10×緩沖液 2 μL,dNTP 2UL, 寡核苷酸 dT 1 μL，AMV 1 μL, RNAse 抑制劑 0.5 μL,RNA 1 μg，補水至20 μL，42 ℃反應60 min，95 ℃ 5 min；取4 μL反轉錄產物，依次加入5×緩沖液2.0 μL，上下游引物各2.8 μL，5 U/μL TqE 0.25 μL，25 mmol/L MgCl20.4 μL,dNTP 0.4 μL，加入滅菌的雙蒸水至反應總體積20 μL。擴增反應條件(表1)，擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，復日Smart生物電泳圖像分析儀掃描，進行吸光度分析，半定量比較，以每個標本的目的條帶與該標本β-actin條帶吸光度的比值，作為該標本目的基因的相對表達量，所有實驗重復3次(n=3)(圖2)。

表1 引物及產物條件Table 1 Primers and product conditions

A.L02 cell; B.L02/pEGFP-C1; C.L02/adi-pEGFP-C1;*P<0.05 compared with A and B圖1 MTT檢測重組載體轉染肝細胞生存率Fig 1 The survival rate of liver cells transfected with the recombinant vectors was detected by MTT assay

A. 1:L02 cell, 2:L02/pEGFP-C1, 3:L02/adi-pEGFP-C1; B.1:L02 cell, 2:L02/pEGFP-C1, 3:L02/adi-pEGFP-C1; *P<0.01 compared with A and B圖2 反轉錄聚合酶鏈反應檢測MMP- 9 mRNA表達水平Fig 2 The expression levels of MMP- 9 mRNA was detected by Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)

1.2.3 明膠酶譜法檢測MMP- 9活性：用明膠酶譜法檢測各分組MMP- 9的活性。用含1 mg/mL明膠的8% SDS-PAGE澆制電泳板。等量的條件培養基加等量的加樣緩沖液混合，上樣。電壓80～150 V，電泳5～6 h，取出凝膠，用1×酶譜復性緩沖液(1×zymogram renaturation buffer)漂洗2×15 min, 1×酶譜孵育緩沖液(1×Zymogram development buffer)孵育過夜，以上加樣緩沖液、復性液和孵育液，考馬斯亮藍G- 250染色2 h，脫色至藍色背景有透明條帶出現為止。MMP- 9降解的明膠條帶吸光度用Scio Image軟件掃描，MMP- 9活性大小用A值:條帶面積×吸光度(absorbance×area)表示，所有實驗重復3次(n=3)(圖3)。

A:1.L02 cell, 2.L02/pEGFP-C1, 3.L02/adi-pEGFP-C1; B.1.L02 cell, 2.L02/pEGFP-C1, 3.L02/adi-pEGFP-C1;*P<0.05 compared with A and B圖3 凝膠酶譜檢測穩定轉染adi-pEGFP-C1/L02的 培養上清液中MMP- 9活性Fig 3 The activity of MMP- 9 in culture supernatant of L02 cells transfected with adi-pEGFP-C1 was analyzed by Gel zymography

1.2.4 Western blot檢測脂聯素蛋白表達：待細胞生長至90%匯合時，胰蛋白酶消化收集各分組的細胞，蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品，將蛋白樣品行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS.PAGE)后，用濕轉方法轉移到NC膜上，膜以封閉液(50 mmol/L Tris, pH 8.0, 2 mmol/L 氯化鈣 0.01%消泡劑(Antifoam A), 0.05%吐溫- 20(Tween- 20), 5%疊氮鈉(NaN3),脫脂奶粉，室溫振蕩封閉2 h，加入以封閉液稀釋的一抗(1∶400)4 ℃冰箱過夜，TPBS洗滌10 min,1∶5 000稀釋的二抗于室溫孵育2 h，TPBS洗滌10 min，加發光液進行化學發光顯影，顯影的目的及內參條帶吸光度用Scio Image軟件掃描，用A值:條帶面積×吸光度(absorbance×area)表示相對表達量的大小，所有實驗重復3次(n=3)(圖4)。

1.3 統計學分析

A:pEGFP-C1/L02 cells(left) and adi-pEGFP-C1/L02 cells(right)(×200); B:the protein and β-actin in L02 cells were detected using Western blot analysis, 1.L02 cells, 2.L02/pEGFP-C1, 3.L02/adi-pEGFP-C1; C:the relative levels of adiponetin protein in L02 cells were exhibited, 1.L02 cells, 2.L02/pEGFP-C1, 3.L02/adi-pEGFP-C1;*P<0.05 compared with 1 and 2

圖4Westernblot檢測脂聯素蛋白表達
Fig4TheexpressionofadiponectininL02cellstransfectedwithadi-pEGFP-C1wasanalyzedbyWesternblotanalysis

2 結果

2.1 MTT檢測重組載體轉染肝細胞生存率

未轉染肝細胞存活率比轉染空載體及重組載體肝細胞高(P<0.05)，且轉染空載體及重組載體肝細胞存活率無差異。

2.2 反轉錄聚合酶鏈反應(RT- PCR)

檢測MMP- 9mRNA表達水平，整合adi-pEGFP-C1/L02細胞的MMP- 9 mRNA與空白對照組相比表達上調(P<0.01)。

2.3 凝膠酶譜結果

顯示穩定轉染adi-pEGFP-C1/L02的培養上清液中MMP- 9活性上調(P<0.05)。

2.4 成功構建adi-pEGFP-C1綠色熒光載體

穩定轉染到人肝細胞系L02細胞中，Western blot檢測穩轉細胞顯示adiponectin表達上調(P<0.05)。

3 討論

脂聯素(adiponectin，APN)是由脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性蛋白質[2],具有抗動脈粥樣硬化、保護心血管系統、改善胰島素抵抗、調節脂質代謝及抗炎等多種功能[3- 5]。

近來研究發現脂聯素與肝纖維化密切相關。研究報道肝臟受損時，分泌大量的TGF-β1、TNF-α、PDGF、CTGF和IL- 6等因子，刺激間質HSC增殖、活化，并促使活化的HSC遷移、聚集于炎性反應受損區，合成大量ECM沉積于肝細胞間質，進而發生肝纖維化[6]。在大鼠HSC培養過程中發現，靜息的HSC可以表達合成脂聯素，脂聯素可以減少α-SMA和PCNA的表達而抑制活化的HSC增殖及遷移，并促進活化的HSC凋亡以抑制肝纖維化的發生發展[7]。有研究報道非酒精性肝病患者血漿中脂聯素水平隨著肝臟炎癥及纖維化的加重明顯下降，提示脂聯素與肝纖維化進程存在某種關聯。有研究顯示CCl4復制早期肝損害小鼠模型RT-PCR檢測脂聯素的mRNA表達明顯上調，并表明脂聯素可能作為一種抗炎蛋白參與早期肝細胞與組織損傷的修復。

基質金屬蛋白酶- 9(MMP- 9)在肝纖維化疾病中亦扮演重要角色。有研究報道CCl4大鼠肝纖維化動物模型中MMP- 9在肝纖維化早期表達上調，隨肝纖維化加重，其表達量下調[8]。也有報道DC在CCl4誘導小鼠肝纖維化降解作用的過程中，發現DC調節肝纖維化作用部分依賴于MMP- 9，當小鼠缺失MMP- 9基因時，遷移的DC不能有效促進肝纖維化的降解[9]。在復方861治療病毒性肝炎肝纖維化中MMP- 9表達量下調,表明在肝纖維化消退過程中降解膠原的MMP- 9也隨之下調[10]。然而，鮮有報道脂聯素與MMP- 9之間的關系[11]。本研究發現，重組的脂聯素載體轉染L02肝細胞系(圖4)，重組表達的脂聯素能上調MMP- 9 mRNA的表達(圖2)和活性(圖3)，MMP- 9表達及活性上調能降解星狀細胞激活合成大量IV型膠原，提示上調脂聯素調節MMP- 9的表達及活性在阻抑肝纖維化進程有潛在的研究價值。當然，在動物模型及臨床試驗方面的深入研究脂聯素的作用是十分必要的。

總之，脂聯素抗肝纖維化的具體機制等方面仍需要進一步深入研究，對其機制的深入探討也許是揭示肝纖維化逆轉新的切入點。

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