菊芋提取液的皮狀絲孢酵母發酵產油脂試驗研究

汪倫記 糾 敏 吉艷青 尤曉顏

(河南科技大學食品與生物工程學院1, 洛陽 471023)(洛陽市第四職業高中2, 洛陽 471000)

生物柴油(Biodiesel)是指以植物油脂、動物油脂和廢餐飲油等為原料，通過酯交換工藝制成的甲酯或乙酯燃料。作為可替代石化柴油的清潔生物燃料，生物柴油的生產成本和使用性能都與現用石化柴油基本相當，且具有良好的環境特性和可生物降解性，具有廣闊的發展前景[1-2]。在生物柴油的生產中，原料成本占生產成本的75%以上，是制約生物柴油工業化生產的主要因素。美國主要采用豆油，歐洲采用菜籽油，印度尼西亞和日本分別采用棕櫚油和廢油生產生物柴油[3]。我國人口眾多，耕地資源匱乏，若直接利用菜籽油或豆油等食用油脂生產生物柴油，由于原料和經濟原因，不具備經濟性。

微生物油脂發酵技術是生物柴油生產的一個研究發展方向。微生物油脂的脂肪酸組成與植物油相近，以C16和C18系脂肪酸為主[4]。微生物發酵產油具有發酵周期短，可連續生產等優點；而且產油微生物菌種資源豐富，能利用和轉化各種農林廢棄木質纖維素原料，對中國這樣一個農業占較大比重的國家具有特殊意義。

目前，對培養產油微生物碳源的研究主要集中在葡萄糖基原料、淀粉質原料和纖維素原料。但采用這3種原料作為生物柴油生產的碳源，原料成本仍然是制約生物柴油產業化的關鍵因素。因此，一種果糖基新型能源植物——菊芋，正日益受到關注。菊芋是一種多年生的草本植物，其塊莖富含菊糖，占其干重的68%～83%。菊糖是由D-呋喃果糖經β-2,1-糖苷鍵聚合而成的一種果聚糖，呈直鏈結構，末端含有一個葡萄糖基[5]。與淀粉和纖維素相比，菊糖更易被水解成果糖和葡萄糖[6]，而且，菊芋具有適應性強，耐貧瘠，耐寒，耐旱等特點，特別適合在沙漠、灘涂、鹽堿荒地等非農業耕地種植，且產量高，價格低廉。基于以上這些優點，菊芋已成為生產燃料乙醇、乳酸、琥珀酸、丁醇等生物質能源、食品和化工原料可供選擇的廉價碳源之一[7-11]。目前對以菊芋為原料生產生物柴油報道不多，因此本試驗對皮狀絲孢酵母發酵菊糖提取液生產油脂進行了研究，為以菊芋為原料制備生物柴油奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菊芋粉：鮮菊芋塊莖購自洛陽，經切片、曬干、粉碎(100 目)，4 ℃冷藏備用。蛋白胨、酵母膏、蔗糖、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、瓊脂粉、氯仿、甲醇等試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 菌種

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.3 菌種培養

1.3.1 培養基

斜面培養基(g/L)：新鮮黃豆芽100，蔗糖50，瓊脂30。配制后121 ℃滅菌20 min備用。種子培養基(g/L)：新鮮黃豆芽100，蔗糖50。配制后121 ℃滅菌20 min備用。

1.3.2 菌種培養

斜面培養：挑取1～2 環皮狀絲孢酵母接種于斜面培養基，置入30 ℃恒溫培養箱中培養 72 h，培養結束后，斜面放入4 ℃保藏備用。

種子培養：挑取斜面上菌種 2～3 環接種于液體種子培養基中，放入恒溫搖床中，30 ℃振蕩培養72 h，使其處于對數生長中后期。

1.4 菊糖提取試驗

稱取定量的菊芋粉溶于蒸餾水中，經一定的溫度和時間處理后，4 000 r/min離心10 min除去沉淀，取上清液，測定總糖和還原糖含量，計算菊糖得率。除特別指明外，初始菊芋粉濃度為60 g/L，提取溫度為70 ℃，提取時間80 min。

1.5 皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂試驗

先對制備好的菊糖提取液進行酶解。酶解條件：菊糖外切酶添加量為20 U/g菊糖，55 ℃保溫8 h。酶解后酶解液115 ℃滅菌30 min備用。

將培養好的皮狀絲孢酵母接入菊糖提取液中，除特別提出外，初始接種量為8%，初始pH值為5.0，初始培養溫度為30 ℃，150 r/min，恒溫培養72 h。培養結束后，培養液4 000 r/min離心15 min，棄上清，取沉淀進行油脂提取。

1.6 生物量的測定

發酵結束后，取一定量的發酵液于離心管中，4 000 r/min離心15 min，棄上清液，得到濕菌體，將濕菌體于105 ℃干燥箱中烘至恒重，菌體的生物量以g(干菌)/L發酵液表示[12]。

1.7 油脂提取

酸熱提取法[13]。出油率根據下面的公式計算。

1.8 菊糖與發酵液中總糖和殘糖含量的測定

菊糖含量測定：采用總糖含量減去還原糖含量的方法。

總糖和還原糖測定：DNS比色法。總糖測定以還原糖計，定量待測樣品于0.05 mol/L HCl 中，沸水浴中回流水解1 h，用0.05 mol/L NaOH 調成中性[14]。

1.9 菊糖酶酶活測定

菊糖外切酶酶活測定[15]：0.5 mL酶液(若必要，適當稀釋)加入到4.5 mL 2%的蔗糖溶液(0.2 mol/L pH 4.6醋酸緩沖液配制)，55 ℃反應10 min，沸水滅活，DNS法測還原糖含量。酶活力定義為：以蔗糖為底物，每分鐘水解1 μmol蔗糖所需的酶量為一個酶活力單位。

1.10 菊芋粉組分分析

總氮含量：凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003)[16]；粗纖維含量：《植物類食品中的粗纖維測定》(GB/T 5009.10—2003)[17]；礦物質元素含量：原子吸收光譜法；Mg2+、Fe3+、Mn2+測定：GB/T 5009.90— 2003[18]；K+、Na+測定：GB/T 5009.91—2003[19]；Ca2+測定：GB/T 5009.92—2003[20]；磷的測定：GB/T 5009.87—2003[21]；灰分：灼燒法[22]。

水分含量測定：取定量樣品放入105 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，干燥前和干燥后質量之差即為水量的質量。

1.11 脂肪酸成分的測定

氣相色譜法[12]。

2 結果與分析

2.1 菊芋粉的成分分析

菊芋粉中主要成分為菊糖，占其干重的73.36%，還原糖為3.12%，這兩部分總量大于76%，除此之外，還含有一定量的粗纖維、氮素和無機鹽成分(表1)。

表1 菊芋粉的組成成分

2.2 菊芋粉中菊糖浸提條件的優化

菊芋是一種碳含量很高的能源植物，可以用作皮狀絲孢酵母菌發酵產油脂的原料。但直接采用菊芋做原料進行微生物發酵產油脂，則在離心收獲菌體時，粗纖維也一起沉淀下來，給后續的油脂提取帶來麻煩。因此，考察了浸提時間、溫度和菊芋粉濃度對菊糖提取率的影響。

2.2.1 浸提時間對菊糖提取率的影響

隨著浸提時間的延長，菊糖的提取率也逐漸增大，當浸提時間為80 min時，提取率達到了95%以上，但隨著浸提時間繼續延長，提取率提高不顯著(表2)。因此，綜合考慮提取率和經濟性的因素，選擇浸提時間為80 min。

表2 提取時間對菊糖提取率的影響

2.2.2 浸提溫度對菊糖提取率的影響

隨著溫度的升高，菊糖的提取率也逐漸增大，當浸提溫度達到85 ℃時，提取率達到了95%以上，隨著溫度繼續升高，提取率提高不顯著(表3)。因此，綜合考慮提取率和能耗的因素，選擇浸提溫度為85 ℃。

表3 溫度對菊糖提取率的影響

2.2.3 菊芋粉濃度對菊糖提取率的影響

由表4可知，菊芋粉濃度越低，菊糖的提取率越高，但菊芋粉濃度較低時，提取液中可發酵糖含量較低，影響皮狀絲孢酵母的生物量和油脂產量；濃度太高時，提取液可發酵糖含量提高，但提取率下降，而且過高的可發酵糖含量也影響皮狀絲孢酵母的生物量和油脂產量，因此，選擇菊芋粉濃度為70 g/L為最適提取濃度。在此濃度下，菊糖的提取率達95%以上。

表4 菊芋粉濃度對菊糖提取率的影響

2.3 皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂的試驗

2.3.1 pH對皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂的影響

pH值是微生物生長和代謝活動的一項重要的指標，對菌體的生長和油脂的積累的影響非常大。因此，選擇pH值4、4.5、5、5.5、6、6.5進行試驗，結果見圖1。當初始pH值為5.5時，皮狀絲孢酵母的生物量、出油率和油脂得率達到最大，分別為14.04 g/L、35.17%和5.11 g/L。

2.3.2 接種量對皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂的影響

接種量對菌體油脂的積累也有重要影響。當接種量過少時，培養基中豐富的營養使菌體大量繁殖，從而減少了油脂的積累，使出油率過低；當接種量過多時，培養基中的營養成分將成為菌體生長的限制因素，對微生物群體生長和油脂積累產生不利的影響。因此，選擇2%、4%、6%、8%、10%和12%6種接種量進行試驗。由圖2可知，當接種量為10%時，生物量、出油率和油脂得率達到最大，分別為14.11 g/L、35.19%和5.04 g/L。隨著接種量的增加，生物量和出油率呈現下降的趨勢。

圖1 不同初始pH對皮狀絲孢酵母發酵菊糖 提取液產油脂的影響

圖2 接種量對皮狀絲孢酵母發酵菊糖 提取液產油脂的影響

2.3.3 溫度對皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂的影響

溫度對油脂的脂肪酸成分有直接的影響，脂肪酸的相對含量會隨發酵溫度的高低的變化而發生相應的變化。因此，考察了不同溫度對皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂的影響，結果見圖3。28 ℃時，出油率最高，達35.41%，但當溫度為30 ℃時，生物量最高，達14.08 g/L，而且培養溫度為30 ℃時，出油率也較高，為35.12%，綜合生物量和出油率兩方面因素，選擇30 ℃作為皮狀絲孢酵母菌發酵的最適溫度。

2.3.4 氮素對皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂的影響

氮素對酵母的生長、繁殖和油脂積累有重要的影響。氮素能加快細胞的生長，促進細胞的增殖。因此，培養前期為獲得大量菌體，要求培養基碳氮比低，而培養后期為了積累更多油脂，要求培養基的碳氮比高。

菊芋中的氮素多以蛋白和氨基酸的形式存在，不含無機氮，且總氮質量分數只有5.69%。因此，考察了補加無機氮和有機氮對皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂的影響。在產脂培養基中分別添加無機氮源硝酸銨、硝酸鉀、NH4Cl、(NH4)2SO4和尿素；有機氮源牛肉膏、蛋白胨作為補充氮源，添加量為2 g/L，進行皮狀絲孢酵母菌發酵菊糖提取液產油脂試驗。試驗結果見圖4。

圖3 溫度對皮狀絲孢酵母發酵菊糖提取液產油脂的影響

圖4 氮源對皮狀絲孢酵母發酵菊糖提取液產油脂的影響

由圖4可知，補充添加有機氮源和無機氮源對皮狀絲孢酵母生長有一定的促進作用，但生物量增加不顯著；補充添加有機氮源能較顯著提高生物量，但出油率偏低。究其原因是由于豐富的有機氮源促進細胞的大量增殖，而導致油脂積累少。這表明，菊芋中含有氮素能滿足酵母的生長需求，補充添加氮素不能顯著提高油脂得率。

2.4 皮狀絲孢酵母分批發酵菊糖提取液產油脂放大試驗

在前期試驗的基礎上，對皮狀絲孢酵母發酵菊糖提取物產油脂分批放大進行研究。5 L發酵罐裝液量為2.7 L，發酵液總糖含量為54 g/L，初始pH值5.5，接種量10%，培養溫度30 ℃，定期取樣測其總糖含量、生物量和油脂得率，結果見圖5。在5 L發酵罐中，皮狀絲孢酵母分批發酵菊糖提取液產油脂能達到較高的生物量和油脂得率，72 h，發酵結束后，生物量和油脂得率分別達到13.93 g/L和4.89 g/L，出油率為34.73%。

圖5 5L發酵罐皮狀絲孢酵母發酵菊糖提取液產油脂

2.5 皮狀絲孢酵母的脂肪酸組分分析

皮狀絲孢酵母菌油脂脂肪酸組分分析結果見表5。皮狀絲孢酵母所產生的脂肪酸主要是C16和C18系列脂肪酸，含6種成分。其中以油酸為主，其次為棕櫚酸和亞油酸，棕櫚油酸、硬脂酸和亞麻酸含量較低。其中80.2%以上是C16∶0、C18∶1 和C18∶2，尤其是C18∶1(43.0%)。皮狀絲孢酵母菌的脂肪酸組分分析結果表明，其油酸、棕櫚酸和亞油酸占總脂肪酸組成上和植物油脂非常接近。因此，皮狀絲孢酵母發酵菊糖生產的油脂可作制備生物柴油的替代原料。

表5 皮狀絲孢酵母脂肪酸組分及含量

3 結論

對菊芋粉的成分分析表明：菊芋中的碳主要以菊糖的形式存在，質量分數高達73.36%，還原糖和粗纖維的含量非常低，只有3.12%和5.55%，除此之外，還含有少量的氮和微量的鉀、鈉、磷、鈣、鎂、鐵和錳等無機鹽。與淀粉質原料相比，菊糖更易于被降解成單糖，因此，菊芋作為果糖基的能源植物，日益受到廣泛關注。

菊糖的最優浸提條件為：菊芋粉質量濃度為70 g/L、提取溫度為85 ℃、提取時間為80 min。在此優化條件下，菊糖提取率可達95%以上。

皮狀絲孢酵母發酵菊糖的最佳培養條件為：初始pH值5.5、接種量10%、培養溫度30 ℃。在此優化條件下，5 L發酵罐分批擴大培養，其生物量、出油率和油脂得率分別達到13.93 g/L、34.73%和4.89 g/L。補充添加氮源對生物量、出油率和油脂得率的提高不顯著。

采用氣相色譜法對皮狀絲孢酵母油脂的脂肪酸成分進行分析，結果顯示其脂肪酸成分主要是C16和C18系列脂肪酸，其中80.2%以上是C16∶0、C18∶1和C18∶2，尤其是C18∶1(43%)，其油酸、棕櫚酸和亞油酸占總脂肪酸組成上和植物油脂非常接近。因此，皮狀絲孢酵母發酵生產的油脂可作制備生物柴油的替代原料。

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