臺蘭ISSR-PCR反應體系的建立與優化

王朝雯，王云艷，肖春宏，孫小琴，楊柏云

(1.臨滄師范高等?？茖W校數理系，云南臨滄677000;2.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西南昌330031)

臺蘭(Cymbidium floribundum var.pumilum)又名蜜蜂蘭、蜂子蘭、金棱邊、蒲蘭等，為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)多年半地生性蘭科植物。蘭花的種質資源是選種育種的基礎，種質資源一旦滅絕，無法再造，從這一意義上來說，野生蘭花若再不加以保護，將會對世界蘭花的育種、研究造成不可彌補的損失，并將會直接威脅到我國蘭花經濟的持續發展。目前，關于蘭科植物的研究主要集中在形態學、分類學、生理學、孢粉學、區系地理學和繁殖生物學等方面［1－2］，而關于居群遺傳學的研究則很少。

近年來，應用ISSR-PCR分子標記技術對植物進行遺傳多樣性研究已有較多報道［3－5］，而采用ISSR技術對野生臺蘭的遺傳多樣性和居群遺傳結構進行的研究鮮有報道。筆者以采自江西省贛州市齊云山的臺蘭作為試驗材料，對臺蘭ISSR-PCR反應體系進行優化，以建立比較完善的反應條件，以期為建立為進一步利用ISSR分子標記技術進行臺蘭遺傳多樣性研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗樣品采自江西省贛州市齊云山的一個自然居群，每個居群采集15～20個樣本。記錄采集樣品的經緯度、海拔和生境，同時對每個居群采集憑證標本供研究用。采集完成后用硅膠干燥法進行處理、保存，備用。

1.2 基因組DNA的提取 采用改良的CTAB法提取臺蘭基因組DNA，步驟如下:①取0.05 g硅膠干燥的臺蘭葉片材料，置于1.5 ml離心管中加液氮研磨成粉末后，加入0.75ml 65 ℃預熱的2×CTAB 抽提緩沖液(pH8.0)，20μlβ-硫基乙醇，輕輕搖動使溶液分散均勻，65℃水浴1 h，水浴過程每隔10 min輕輕搖動。②冷卻至室溫，加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混合均勻，12 000 r/min離心10 min。③吸取上層液相轉入新的1.5 ml離心管，加等體積氯仿異戊醇，搖勻。④12 000 r/min離心10min。取上層液相，加1/10體積3mol/L的冰醋酸鈉，2倍體積－20℃的無水乙醇，－20℃保存20 min。⑤勾出DNA。⑥加70%乙醇洗滌2次，用無水乙醇洗滌1次，風干。⑦用40μl 0.1TE溶解 DNA，－20℃長期保存備用。

1.3 DNA樣品的檢測 用1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA質量;用分光光度計測定其純度和濃度，DNA純度以OD260/OD280的比值來估算，濃度估算法為:DNA濃度(ng/μl)=OD260×50×稀釋倍數。計算DNA獲得率(DNA量/所用葉片量×100%)為1.8%。

1.4 ISSR-PCR 擴增反應

1.4.1 ISSR-PCR 條件篩選。反應體系為25 μl，其中10×buffer 2.5 μl，引物濃度為 0.4 μmol/L，雙蒸水 15.78 μl。為確定PCR反應中其他4項因素(DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs)的最佳水平，試驗用引物對ISSR-PCR反應的這4項影響因素逐個進行5個水平的研究，各反應參數變化量見表1。反應總體積為25μl(含2.5μl10×buffer和15.78 μl ddH2O)。

表1 ISSR-PCR反應體系各成分優化試驗設計

1.4.2 ISSR引物篩選。ISSR引物根據加拿大British Columbia大學公布的序列設計，由上海生物工程技術服務有限公司合成，編號為UBC 808～UBC ISSR22，共96條引物。每次試驗選擇Tm值接近的12個引物，具體見表2。

表2 ISSR引物及其序列

1.4.3 PCR 擴增步驟及參數。取1.5 ml已滅菌 eppendorf管，依擴增的樣本數計算各成分的量，依次加入ddH2O→10×buffer→dNTPs→Taq酶，混勻后分裝到各擴增薄壁管中，依次加入模板，按循序放入PCR擴增儀樣本中，按以下程序進行擴增。擴增完畢，將樣本取出，置于4℃ 冰箱保存，等待電泳。反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸50 s，共40個循環;72℃延伸7min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并回收純化目的條帶。

1.5 電泳與拍照 PCR擴增結束后，以 GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus(上海生物工程公司產品SM0321)為分子量標記，用含有0.1%EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳(0.6 g瓊脂糖，40ml1×TAE緩沖液)，電泳緩沖液為1×TAE電泳緩沖液100 V穩壓100mA電泳45～60min，凝膠成像儀下成像拍照并保存。

2 結果與分析

2.1 Taq DNA聚合酶對 ISSR-PCR反應的影響 試驗設計了 Taq DNA 聚合酶5 個濃度梯度為0.18、0.20、0.22、0.25和0.28 U，同時對 5 個引物 18291、18294、18295、18297 和18298進行篩選。圖1表明，當Taq DNA聚合酶濃度為0.18和0.20 U 時，擴增譜帶模糊不清;濃度為 0.20、0.25、0.28 U時，擴增譜帶較弱，且數量相對較少;濃度為0.22 U時擴增條帶較多且較亮，效果最好，故確定為最佳濃度。同時可以看出引物18257和18297的條帶較為清晰而且數量較多，篩選出效果較好的引物為18257和18297。

圖1 Taq DNA聚合酶對ISSR擴增的影響

2.2 dNTPs濃度對ISSR-PCR反應的影響 圖2表明，當濃度為0.3 mmol/L時，幾乎無擴增產物;在0.4 mmol/L時，雖有擴增產物，但譜帶較弱不易辨認;濃度為0.5～0.7 mmol/L時，均能擴增出清晰的譜帶，但在0.6～0.7 mmol/L，擴增產物不穩定且有非特異性擴增;在0.6 mmol/L時，擴增譜帶較弱或一些大的片段擴增缺失?？紤]到結果的穩定性和減少試驗成本，選用0.5 mmol/L的dNTPs濃度，在此濃度下，擴增產物穩定、重復性強。同時對引物18262、18265、18266、18268和18269進行篩選，得出18265和18269擴增效果較好。

2.3 M g2+濃度對 ISSR-PCR反應的影響 圖3表明，Mg2+濃度對反應體系影響不是很明顯，除濃度為2.0 mmol/L時擴增條帶稍亮些以外，其他濃度電泳出的條帶數目及清晰度基本類似。由此可見，臺蘭基因組DNA的ISSR擴增反應對Mg2+濃度不敏感，Mg2+含量許可范圍較大，但考慮到結果的穩定性和可重復性，選用2.0mmol/L為最佳濃度，同時篩選出較好的引物為18264和18267。

圖3 Mg2+濃度對ISSR擴增的影響

2.4 模板DNA濃度對ISSR-PCR反應的影響 圖4表明，模板DNA濃度對臺蘭ISSR-PCR擴增效果有一定的影響。臺蘭ISSR反應對模板DNA濃度不甚敏感，模板含量許可范圍較大。在25μl反應體系中，除了濃度400 ng幾乎沒有擴增條帶，濃度在40～200 ng均能獲得比較清晰的譜帶，但在100 ng時擴增出的條帶最多且清晰，又考慮到結果的穩定性和可重復性，因此選用100 ng作為適宜的模板濃度。同時對引物18249、18270、18315、18320 和18333 進行篩選，選出效果較好的引物為18249和18315。

圖2 dNTPs濃度對ISSR擴增的影響

2.5 臺蘭優化體系的建立 通過對以上各種影響因素的分析優化，建立了反應穩定、重復性好的臺蘭ISSR-PCR反應體系:在25 μl反應體系中含 2.5 μl 10 ×buffer，0.5 mmol/L dNTPs，2.0mmol/LMgCl2，0.4 μmol/L 引物，0.22 U Taq DNA聚合酶，100 ng模板DNA，雙蒸水15.78μl。PCR擴增程序:94℃預變性5min;94℃變性30 s，50～60℃退火(退火溫度隨引物不同而定，根據各引物的Tm值略低1～2℃)30 s，72℃延伸50 s，40個循環;72℃延伸7 min，4℃保存。

為了檢測優化的效果，試驗利用建立的優化體系，選用UBC822引物，在復性溫度為50℃條件下，對12個篩選的引物進行批量擴增。圖5表明，優化后的反應體系是比較理想的。

3 結論與討論

3.1 ISSR反應體系主要成分對ISSR-PCR反應穩定性的影響 ISSR是基于PCR反應的一種分子標記技術，具有DNA用量少、操作簡單、快速靈敏、成本低等優點［6］，但ISSRPCR擴增反應容易受許多因素的影響，如:Taq DNA聚合酶、Mg2+濃度、dNTPs用量、DNA模板的濃度和純度等，而且這些因素之間存在相互作用。因此，不同物種的最佳擴增條件各有不同，為確保ISSR分析結果的可靠性和重復性，獲得較高的ISSR-PCR擴增譜帶，提高分析的準確性，針對不同物種相應的反應體系中各種影響因子進行優化，篩選出最適宜的ISSR-PCR擴增反應條件非常重要。

圖4 模版DNA濃度對ISSR擴增的影響

圖5 引物UBC822的擴增結果

在ISSR-PCR反應體系中，Taq DNA聚合酶的用量直接決定著實驗的成功與否，量多不僅增加試驗成本而且容易產生非特異性擴增產物;量少則會使酶過早地消耗完，產物合成效率低［7］。試驗中Taq DNA聚合酶用量低于0.22 U時條帶數量少且比較暗，用量多于0.22 U時條帶雖然沒有減少，但是出現了非特異性擴增產物，結果表明0.22 U是臺蘭ISSR-PCR反應的最佳條件。

dNTPs是ISSR-PCR反應的原料，通常dNTPs濃度范圍為 0.02 ～0.20mmol/L［8］。dNTPs為 Taq DNA 聚合酶提供底物，使產物得以延伸。當dNTPs濃度過高，則導致Taq DNA聚合酶的錯誤摻入，會導致PCR錯配，從而使擴增出現非特異性擴增，影響擴增的準確性;濃度過低，又會影響合成效率，甚至會因過早的消耗而使產物單鏈化，影響擴增效果［9］。試驗中dNTPs濃度為0.3和0.4 mmol/L時，因濃度太低而擴增產物過少，濃度為0.5、0.6 和0.7mmol/L 時都有較多擴增產物，但后兩者非特異性擴增相對較多，結果表明0.5 mmol/L為dNTPs最佳濃度。

Mg2+濃度是影響ISSR-PCR結果的一個重要因素，Mg2+濃度不僅影響Taq酶的活性［10］，還能與反應液中的dNTPs、模板DNA及引物結合，影響引物與模板的合效率、模板與產物的解鏈溫度以及產物的特異性和引物二聚體的形成［11］。試驗中Mg2+濃度對反應無明顯影響，所設置的幾個濃度都有較多擴增產物，但濃度為2.0 mmol/L時條帶較亮，結果表明2.0mmol/L為Mg2+最佳濃度。

DNA模板濃度也是影響ISSR-PCR擴增效果的因素之一，濃度過低，擴增產物不穩定或無擴增產物;濃度過高，又會相應增加非特異性產物的擴增。最佳的模板濃度范圍取決于研究的物種和模板純度，在DNA模板不純的情況下，寧可使用有效濃度范圍內的最低濃度，使抑制Taq DNA聚合酶的影響降到最小。試驗中隨著DNA模板濃度升高，擴增產物也相應增加，但同時非特異性產物也在增加，因此，考慮到穩定性和節約成本，試驗采用的最佳DNA模板濃度為100 ng/L。

3.2 擴增程序對ISSR-PCR反應穩定性的影響 PCR程序設計中，重要的是復性溫度的制定，引物的退火溫度也極大地影響著ISSR反應的進行，由于引物堿基序列長短不同使得引物的退火溫度也不盡相同。即使同一引物，在不同的植物樣品中的退火溫度也不一樣。在同一PCR反應系統中，退火溫度不同，產生錯配的程度也不同，通常較低的溫度在保證引物與模板結合穩定性的同時，也會使引物與模板之間為完全配對的一些位點間得到擴增，即產生一定的錯誤擴增［12］。因此，在允許的范圍內，選擇較高的退火溫度可減少引物與模板之間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性［13］。通過試驗表明復性溫度最好比引物TM值略低1～2℃，這個溫度復性效果比較好。

PCR循環數對擴增產物量有明顯的影響，選擇適宜的循環次數將會獲得良好的擴增圖譜。從理論上說，循環次數少，產物量少;循環次數越多，擴增產物產率越高。但實際上，次數太多，達到反應平臺后，循環不會使產物明顯增加，反而引起非特異性擴增［14］。

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