CX37基因1019C/T多態性與腰椎間盤突出癥及臨床分型的關系

陳 思，陳劍峰，程 力，3*

(1.南京醫科大學，南京210046;2.無錫市中醫醫院，江蘇 無錫214000;3.無錫市人民醫院，江蘇無錫214000)

間隙性連接蛋白37(connexins37，CX37)的作用是在細胞膜上形成間隙連接通道供細胞間直接信息交流，它的異常與炎性介導的疾病相關。研究發現，CX37基因多態性與動脈粥樣硬化、心血管病密切相關［1］，而中樞神經系統也有 CX37 的表達［2］。對于CX37在椎間盤組織的分布及腰椎間盤突出癥發病的潛在影響，相關研究并不多。因此，本文擬初步探討CX37基因多態性與腰椎間盤突出癥的關系，篩選腰椎間盤突出癥的易感基因，為其臨床預防提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選擇2013年12月—2014年4月在我院脊柱脊髓科住院的腰椎間盤突出癥患者191例，均符合國際腰椎研究會(ISSLS)的診斷標準。根據影像學表現分為膨出型64例，突出型98例，脫出型29例，其中男96例，女95例，年齡36～78歲，平均年齡54.4歲;對照組187例，男92例，女95例，年齡41～70歲，平均年齡52.7歲。腰椎間盤突出癥臨床分型包括膨出型、突出型、脫出型(后縱韌帶下和后縱韌帶后)以及游離型，此研究將游離型一并納入脫出型。同期選擇健康人群187例作為對照組。

1.2 基因型判定

1.2.1 標本采集及DNA的抽取 所有患者均取清晨空腹外周血5 mL，加入有EDTA-Na2的抗凝管中，搖勻，提取基因組DNA，-20℃冰箱保存待用。

1.2.2 聚合酶鏈反應(PCR)擴增已提取的基因組DNA:Connexin37 C1019T位點引物序列如下。正義:5＇-CCTCCTCAGACCCTTACACGG-3＇，反義:5＇-CATCCCAGGCAGCCAGACT-3＇。20 μL PCR 反應體系中 含:10 μL 2 ×mix，1.0 μL 正義引物(10 pmol)，1.0 μL 反義引物(10 pmol)，2 μL 模板 DNA(如果濃度過低，調整為4.0 μL)，6 μLddH2O。PCR 反應條件為:94 ℃ 預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環，72℃最后延伸7 min，然后在-4℃保存。

1.2.3 基因測序 PCR產物取5 μL于2%瓊脂糖凝膠，180 V電壓電泳10 min，然后經過凝膠成像系統分析。

1.3 統計學分析 統計分析均由SPSS 13.0軟件包完成。基因型和等位基因頻率通過基因計數法計算。χ2檢驗判斷基因型的 Hardy-Weinberg平衡符合程度，組間基因型和等位基因頻率比較用四格表χ2檢驗和R×C例聯表χ2檢驗，組間數據比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CX37基因1019C/T的基因型 分析結果表明，CX37基因位點1019C/T多態性分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。根據基因測序結果，2組人群CX37基因型都出現3種，分別為CC型、TT型及TC型。

2.2 對照組與膨出型組CX37基因型、等位基因頻率分布比較 CX37基因型(CC型，CT型、TT型)在對照組和膨出型組中分布頻率無統計學意義(P＞0.05)。C、T等位基因頻率在上述2組中的對比亦無顯著統計學意義(P＞0.05)。同時在2組的性別亞分組中間也未發現有統計學意義。

2.3 對照組與突出組CX37基因型、等位基因頻率分布比較 CX37基因型(CC型，CT型，TT型)在突出型組中分布頻率分別為48.0%，32.6%，19.4%優于對照組中的16.6%，34.2%，49.2%(P＜0.05)。突出型組的C等位基因(CC+CT)頻率(60.8%)顯著高于對照組(37.8%)，P＜0.05。在性別亞分組分析比較中，男性人群的CC基因型和C等位基因頻率在突出型組中明顯高于對照組(P＜0.05)，而在女性中突出型組與對照組比較無統計學意義，見表1。

2.4 對照組與脫出組CX37基因型、等位基因頻率分布比較 CX37基因型(CC型，CT型、TT型)在脫出型組中分布頻率分別為58.6%，27.6%，13.8%優于對照組中的16.6%，34.2%，49.2%(P＜0.05)。突出型組的C等位基因(CC+CT)頻率(67.6%)顯著高于對照組(37.8%)，P＜0.05。在性別亞分組分析比較中，男性人群的CC基因型和C等位基因頻率在突出型組中明顯高于對照組(P＜0.05)，而在女性中突出型組與對照組比較無統計學意義，見表2。

表1 對照組與突出型組CX37基因型、等位基因頻率分布 例(%)

表2 對照組與脫出型組CX37基因型、等位基因頻率分布 例(%)

3 討論

腰椎間盤突出癥是骨科臨床常見病和多發病。造成腰椎間盤突出癥的病因復雜，包括生物力學異常、外傷、自身免疫改變、遺傳因素等［3-4］。然而，治療的最優化并未帶來療效的最佳化［5］。究其原因，腰椎間盤退變或突出后引起疼痛的機制尚不清楚。傳統觀點認為的機械性壓迫學說并不能滿意地解釋所有臨床和病理現象。研究提示，椎間盤突出附近的神經根常有充血、水腫、炎癥變化。國內外大量學者研究認為突出的髓核物質中所含的內源性化學炎癥介質會引起炎癥，產生疼痛［6］。而突出后的髓核組織還會有新生的血管增生和巨噬細胞的浸潤，突出髓核局部的炎癥物質聚集與疼痛癥狀的產生密切相關［7-8］。最近，基于基因學的研究開始得到廣泛關注，其中Cx蛋白家族與許多相關疾病的聯系成為熱點。

Cx蛋白家族廣泛存在于脊柱動物，并組成細胞間的通訊結構。Cx基因在人類可能有21種，這種通訊方式與機體多種疾病密切相關，因此成為近年來研究的熱點。不同的氨基酸序列造成Cx有著各不相同的功能。研究發現Cx32在肝臟、胃、宮頸等組織中的表達，與癌癥的發病有著密切的聯系［9］;而神經系統中，Cx36是Cx家族中目前唯一被證明構成哺乳動物腦神經元之間間隙連接的蛋白。心血管系統中的Cx主要是 Cx37，Cx40，Cx43，Cx45，Cx46，并且分布在心臟的不同區域，在調節心臟傳導速度方面起著重要的作用［10-11］。其中，Cx37基因C1019T多態性直接影響了間隙連接蛋白三級結構的形成，進而影響蛋白質的合成、轉運、加工以及信號轉導過程［12］，并常存在于脈管系統(如內皮細胞、平滑肌細胞)和炎癥細胞中(如單核細胞、巨噬細胞)。目前研究大多集中在其與心血管疾病發生發展的關聯，而對CX37基因C1019T多態性與椎間盤突出癥發病的研究鮮有報道。本研究采用病例—對照研究方法，顯示了Cx37基因C1019T多態性不僅跟腰椎間盤突出癥的發生有關，而且在各型(膨出型、突出型和脫出型)之間以及性別上也存在著差異。腰椎間盤突出癥的發生與Cx37的CC基因型和C等位基因頻率(CC+CT)增高有關，但在膨出型患者中未見明顯統計學意義，其與患者突出癥狀不嚴重，纖維環并未有破裂有關，提示CC基因型和C等位基因頻率(CC+CT)增高可能與突出的髓核物質中所含的內源性化學炎癥介質有關。男女組間的比較，提示男女間腰椎間盤突出癥的發生存在遺傳學機制上的差異，男性表現明顯，同時也為該基因研究在腰椎間盤突出癥群體中(尤其男性)篩查高危人群提供了可能依據。

研究結果體現出了Connexin37基因C1019T多態性與腰椎間盤突出癥之間的關聯性，但由于本研究中各組樣本例數偏少，同時腰椎間盤突出癥本身也是一種多因素的疾病，單一致病因素可能在疾病的發生發展中影響較小，Connexin37基因C1019T多態性與腰椎間盤突出癥之間的確切關系尚有待于大樣本的進一步研究。

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