響應面法優化大麥苗葉綠素提取工藝

張 輝，張娜娜，馬 麗，唐 堅，喬勇進*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海市農業科學院農產品保鮮加工研究中心，上海 201403；3.上 海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234）

響應面法優化大麥苗葉綠素提取工藝

張 輝1,2，張娜娜3，馬 麗1，唐 堅3，喬勇進2,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海市農業科學院農產品保鮮加工研究中心，上海 201403；3.上 海師范大學生命與環境科學學院，上海 200234）

為優化大麥苗葉綠素的提取工藝，試驗以乙醇-水為溶劑對大麥苗葉綠素進行浸漬提取。采用Plackett-Burman試驗設計篩選影響大麥苗葉綠素提取量的顯著因素，通過中心組合試驗設計優化其提取工藝參數。結果表明：液料比、乙醇體積分數及提取時間是影響葉綠素提取量的顯著因素。優化所得最佳提取工藝參數為液料比31∶1、乙醇體積分數92%、提取時間112 min。 在此條件下，葉綠素提取量為13.622 mg/g，與預測值13.646 mg/g較一致。故響應面法可用于優化大麥苗葉綠素的提取工藝，且其優化工藝參數可為大麥苗葉綠素工業化生產提供參考。

Plackett-Burman試驗設計；中心組合試驗設計；大麥苗葉綠素；提取工藝優化

大麥嫩苗因富含葉綠素、類黃酮、維生素、抗氧化酶及蛋白質等多種功能營養成分，其資源的開發、利用已逐漸受到廣泛關注，如麥綠素、麥汁等相關產品的研制[1-2]。葉綠素屬卟啉類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、消炎、預防癌癥等多種生理功能[3]。葉綠素及其衍生物作為天然色素在食品、醫藥及日用化工領域已得到廣泛應用[4]。此外，隨著對葉綠素生理功能研究的不斷深入，以葉綠素為主要原料的功能性食品種類及數量也逐漸增多[5-6]。目前，天然葉綠素主要提取原料為蠶沙[7]、菠菜[8]及生物土壤結皮[9]等。以大麥苗為原料進行葉綠素定向提取并對其提取工藝參數進行響應面法優化的研究未見報道。大麥苗因其原料具有種植周期短、成本低、產量大及易加工等優點，可作為葉綠素提取的優選原料。Castle等[10]通過研究丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亞砜對生物土壤結皮葉綠素a的提取效果，發現乙醇和二甲基亞砜的雙萃取具有較好的提取效果。也有研究表明乙醇-丙酮的混合溶液因具有協萃作用，從而得到更高的葉綠素提取率[11]。但二甲基亞砜和丙酮均具有一定毒性，對人體具有危害性。Macías-Sánchez等[12]采用超臨界流體和微波輔助法對鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）葉綠素a進行提取，發現二者均優于傳統溶劑浸提法。但超臨界流體萃取、微波輔助提取等新興物理提取技術均存在投資成本高，難以實現規模工業化生產等缺陷。本實驗以乙醇-水為提取溶劑，對大麥苗進行常溫浸漬提取，采用Plackett-Burman試驗設計、中心組合試驗設計（central composite design，CCD），探討了提取大麥苗葉綠素的顯著影響因素及其最佳工藝條件，以期為拓寬葉綠素提取原料的來源，進一步提高大麥嫩苗資源利用率及大麥苗葉綠素規模工業化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六葉期大麥苗（品種：大中88-91），采收于上海市農業科學院試驗田；無水乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultrospec 3300 pro紫外分光光度計 美國安瑪西亞公司；D37520 Osterode 高速冷凍離心機 德國Biofuge公司；KK29E-18T1型冰箱 德國Siemens公司；BP301S型電子天平 德國賽多利斯公司；FW-400A高速粉碎機、ZHWY-2102C雙層恒溫搖床 上海智成分析儀器制造有限公司；Modul YOD-230真空冷凍干燥機 美國Thermo Savant公司。

1.3 方法

1.3.1 葉綠素提取工藝流程

大麥苗鮮樣→挑選、清洗、瀝干→真空冷凍干燥（預凍溫度：－45 ℃；冷阱溫度：－37 ℃；升華溫度：25 ℃；真空度：170 Pa）→粉碎（100目）→浸提→過濾→減壓濃縮成膏狀（水浴溫度：30 ℃；真空度：110 Pa）。

1.3.2 Plackett-Burman試驗設計

表1 Plackett-Burman 設計因子水平及編碼值Table1 Coded levels for independent variables used in Plackett-Burman experimental design

Plackett-Burman試驗設計可通過較少的試驗次數從多因素系統中篩選出顯著的影響因素[13]。根據前期單因素試驗結果，采用Plackett-Burman試驗設計（表1），以乙醇體積分數、液料比、提取時間、提取溫度、提取次數和搖床轉速共6個因素和5個虛擬變量為試驗因子，篩選影響大麥苗葉綠素提取量的顯著因素。所有因子均設高（＋）、低（－）兩個水平，共12次試驗，每次試驗進行3組平行試驗。其中虛擬變量的設計用于估計試驗總體偏差。

1.3.3 中心組合試驗設計

根據Plackett-Burman試驗結果，選擇乙醇體積分數、液料比和提取時間為試驗因子，采用3因素5水平，20次試驗的CCD對大麥苗葉綠素提取工藝參數進行優化，試驗按隨機順序進行。因子水平編碼表見表2。根據試驗結果，可建立二次非線性回歸模型，式（1）[14]。

式中：Y為葉綠素提取量預測值；Xi、Xj為試驗因素的編碼值；β0、βii、βij為截距及回歸常數；其中，式中Xi為無量綱的編碼值，xi為變量i的實際值，xi0為變量i的零水平實際值。Δxi為變量i的步長實際值，即編碼值變化一個單位所對應的實際變化值。

采用F檢驗考察回歸模型顯著性；最小二乘法估計 回歸模型系數，t檢驗法分析模型系數顯著性。因子貢獻率采用式（2）計算[15]：

式中：SSj為因子平方和；SST為模型總平方和。

表2 中心組合試驗設計因子及編碼水平Table2 Coded levels for independent variables used in central composite experimental design

1.3.4 指標測定

將干燥后的大麥苗用高速粉碎機粉碎，過100目篩。稱取樣品約2.00 g置于250 mL錐形瓶中，按一定液料比加入乙醇溶液提取溶劑，用封口膜將錐形瓶密封并置于搖床中以一定轉速恒溫搖晃浸提，提取完成后將提取液10 ℃、10 000 r/min離心15 min，取2 mL上清液用相應體積分數的乙醇溶液定容至50 mL容量瓶中，采用紫外分光光度法測定葉綠素含量[16]；葉綠素提取量采用式（3）進行計算。

式中：Y為大麥苗葉綠素提取量/（mg/g）；m為提取液中葉綠素含量/（mg/mL）；M為提取樣品質量/g。

1.4 數據處理

Plack ett-Burman試驗數據處理采用Minitab 16.0，CCD試驗數據處理采用Desi gn-Expert 8.0.6.1、SAS 9.2，Origin 8.0繪制主效應圖。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結果

表3 Plackett-Burman 試驗設計矩陣及響應值Table3 Plackett-Burman design matrix and responses

對PB試驗結果采用Lenth[17]法識別顯著效應，得到了因素標準化效應的半正態概率效應圖（圖1a）以及因素標準化效應的帕累托圖（圖1b）。由圖1a可看出，因素x1、x2、x3的標準化效應點離擬合線較遠，位于圖右側偏上，故其為顯著影響因素（P＜0.05），即影響大麥苗葉綠素提取率的顯著因素是乙醇體積分數、液料比、提取時間。其他因素標準化效應點均較小且接近零，為不顯著影響因素（P＞0.05）。標準化效應的帕累托圖（圖1b）進一步確定了效應的量值和重要性。此外，其還表明所有因素均為正效應因素。對于影響葉綠素提取量不顯著的因素，在后續試驗中均維持其在低水平，以減少資源浪費。

圖1 葉綠素提取量的顯著影響因素Fig.1 Factors having a significant influence on chlorophyll extraction yield

2.2 CCD試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立

本試驗共設20次試驗，其中包括8次全因子試驗、6次星號點試驗及6個中心點試驗。所有試驗均進行3組平行試驗，取其平均值作為響應值。試驗方案及結果見表4。

表4 CCD設計矩陣及響應值Table4 Central Composite Design matrix and responses

利用Design-Expert 8.0軟件對表4結果進行統計分析，并建立三元二次回歸方程式（4）：

2.2.2 回歸模型的統計檢驗

表5 回歸模型顯著性檢驗結果Table5 Results of significance test for the fitted regression model

由表5可知，判定系數（R2）為0.993 8說明模型相關性較好，試驗因子對響應值有較大影響。校正判定系數（）為0.988 1，表明98.81%的試驗數據的變異性可用此回歸模型來解釋。變異系數（variation coefficient，CV）為0.67%，表示試驗的可信度和精確度較好。精密度是有效信號與噪音的比值，其值大于4.0視為合理，本試驗精密度為43.923，表明其為一個適宜的信號。模型F值為176.86，表明其達到極顯著水平（P＜0.01）。即乙醇體積分數、液料比、提取時間等全部解釋變量對被解釋變量的共同影響具有差異極顯著性，且模型一次項、二次項均達到顯著水平（P＜0.05）。此外，失擬項F值為1.273 6（P＝0.398 6＞0.05），表明失擬值和純誤差沒有顯著性關系，即回歸模型在被研究的整個回歸區域不失擬。

表6 回歸模型系數顯著性檢驗結果及置信區間Table6 Significance test results and confidence interval of coefficients of the regression model

回歸模型系數t檢驗結果（表6）表明，各一次項、二次項和交互項X2X3均對葉綠素提取量影響極顯著（P＜0.01），交互項X1X2、X1X3對葉綠素提取率影響達顯著水平（P＜0.05）。此外，回歸模型各項系數的置信區間均較窄，說明模型系數值離真實值較近，其精確度高。綜上可知，該模型能用于指導試驗。

2.3 模型效應分析

2.3.1 主效應分析

由于模型存在交互效應，故不宜用回歸系數的絕對值大小來直接比較二次項、交互項作用的大小。因此，本試驗均采用因子貢獻率來衡量各因子對葉綠素提取量的影響大小。圖2表明，一次項效應＞二次項效應＞交互項效應。模型各項間乙醇體積分數的二次效應影響最顯著，其次是其一次項效應，而液料比和乙醇體積分數的交互作用對葉綠素提取率影響最小。3個試驗因素的效應大小依次為乙醇體積分數＞液料比＞提取時間。

圖2 因子貢獻率Fig.2 Percentage contributions of factors

2.3.2 單因素效應分析

將回歸模型（式4）中的兩個因素固定在零水平，得到液料比（X1）、乙醇體積分數（X2）、提取時間（X3）的單因素模型，分別為式（5）～（7）。在－1～＋1水平間可得到各因子的單因素軌跡圖（圖3）。

圖3 單因素軌跡圖Fig.3 Perturbation of single factors

由圖3可看出，各因子對葉綠素提取量的影響趨勢，并可由曲線的走向及彎曲程度看出各因子與響應值的關系。增加液料比，傳質動力增加，有助于葉綠素溶出，故前期響應值增加較快。但液料比大于25∶1后，大麥苗中葉綠素已基本溶出，而呈現平穩趨勢。葉綠素提取量伴隨乙醇體積分數和提取時間的變化均呈下開口拋物線趨勢，但二者的上升、下降幅度不同，其中乙醇體積分數變化幅度較大，說明乙醇體積分數對葉綠素提取量影響較大。

2.3.3 兩因素效應分析

圖4 葉綠素提取量響應面圖及等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour plots for chlorophyll extraction yield

由圖4a可知，葉綠素的提取量隨液料比的增加呈現先快速增長而后增長緩慢的趨勢。增加液料比可增加傳質動力，有助于葉綠素的溶出，但當液料比達到一定程度時，已溶出大部分葉綠素，若再增加液料比，則葉綠素提取量增加緩慢。圖4b表明乙醇體積分數對葉綠素提取率的影響較顯著，表現為其曲線較陡。此外，由其還可看出，葉綠素提取率隨著乙醇體積分數的增加呈現先增大后減小的趨勢。這可能是由于乙醇極性較弱，體積分數增大減小了提取液極性，使其更接近于葉綠素的極性，從而增加了葉綠素的溶出。但由于部分葉綠素是以和蛋白質結合的形態存在于植物細胞中，故乙醇體積分數過高會減少此部分的葉綠素溶出。液料比與乙醇體積分數的等高線圖為橢圓形狀，表明二者交互效應顯著，與方差分析結果一致。最優點較接近于液料比為30∶1和乙醇體積分數為92%處，并在這兩點附近達到最大值。此外，還可看出，葉綠素提取量對液 料比的變化比對提取時間變化更為敏感。圖4c表明葉綠素提取率隨提取乙醇體積分數的增大和提取時間的延長呈先上升后下降的趨勢，且二者有明顯的交互作用。

2.4 反應條件的優化與模型驗證

規范分析[18]能求出響應面的拐點并判斷其類型（最大值點、最小值點、馬鞍形點）。對試驗結果進行規范分析（表7），得到葉綠素提取的一個穩定點，該點處理論響應值為13.646。由于特征值均為遠離零值的負數，且穩定點在可試驗區域內，故一般認為此穩定點為最大值點，無需進行嶺脊分析?？紤]到實際工作的便利，將浸提工藝修正為液料比31∶1、乙醇體積分數92%、提取時間112 min。采用修正后的工藝參數進行3次平行驗證實驗，測得葉綠素提取量為13.622 mg/g，與模型預測值相差不大。此外，其顯著高于已報道的其他植物葉綠素提取含量，如桑葉[19]（5.376 mg/g，干質量）、蠶沙[7]（2.68 mg/g，干質量）等。范燕青等[20]以水為溶劑，采用正交試驗設計，在提取溫度25 ℃、時間2 h、料液質量比1∶3、提取次數2次的工藝條件下得到的大麥苗葉綠素提取量為12.80 mg/g，低于本實驗工藝條件下的結果。這可能是因為葉綠素極性較弱，在水溶液中較難滲出。此外響應面試驗設計能夠探尋出試驗因素在整個區域水平中的最佳參數組合，克服了正交試驗設計只能給出試驗因素在設定水平下的最佳組合的缺陷，從而得到了較高的葉綠素提取率。陳紹瑗等[19]采用響應面法試驗設計得到的桑葉葉綠素提取的最佳工藝參數為提取時間5.25 h、提取溫度56.5 ℃、液料比103∶1。其工藝參數值均高于本研究工藝參數值。這可能是由于桑葉原料細胞壁較為堅硬，且其原料破碎程度較小造成。

表7 規范分析結果Table7 Results of canonical analysis

3 結 論

通過Plackett-Burman設計，篩選出影響大麥苗葉綠素提取量的顯著因素為乙醇體積分數、液料比、提取時間，并通過CCD 試驗設計建立了顯著影響因素與大麥苗葉綠素提取量之間的三元二次回歸模型，確定了大麥苗葉綠素最佳提取工藝參數為液料比31∶1、乙醇體積分數92%、提取時間112 min，在此工藝條件下，葉綠素提取量為13.622 mg/g，其與預測值13.646 mg/g基本一致。故該模型能反映大麥苗葉綠素提取過程中的內部規律，可較好地預測大麥苗葉綠素的提取情況，并能為拓寬葉綠素提取原料的來源、進一步提高大麥嫩苗資源利用率及大麥苗葉綠素工業化生產提供理論參考。

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Optimization of Extraction Process for Chlorophyll from Young Barley Grasses Based on Response Surface Methodology

ZHANG Hui1,2, ZHANG Na-na3, MA Li1, TANG Jian3, QIAO Yong-jin2,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. Agricultural Products Storage and Processing Research Center, Shanghai Academy of Agricultural Science, Shanghai 201403, China; 3. College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

The extraction of chlorophyll from young barley grasses with aqueous ethanol as extraction solvent was optimized. Significant variables that influence extraction efficiency were selected by Plackett-Burman experimen tal design and optimized by central composite experimental design. Solid-to-solvent ratio, ethanol concentration and extraction time were identified as main influencing parameters. The optimal extraction condition s were fo und to be 31:1, 92% and 112 min. Under these conditions, the observed yield of chlorophyll was 13.646 mg/g, approximating to the predicted value of 13.622 mg/g. It can be concluded that response surface methodology is applicable to optimize the parameters for extraction of chlorophyll from young barley grasses and the optimized extraction process parameters can provide a reference for industrial production of chlorophyll from young barley grasses.

Plackett-Burman design; central composite design; chlorophyll of young barley grasses; optimization of extraction process

R284.2

A

1002-6630（2014）02-0075-06

10.7506/spkx1002-6630-201402014

2013-05-09

上海市科委國際合作計劃項目（073907003）

張輝（1988—），男，碩士研究生，研究方向為農產品保鮮與加工。E-mail：nd_zh@sina.com

*通信作者：喬勇進（1967—），男，研究員，博士，研究方向為農產品保鮮與加工。E-mail：yjqiao2002@126.com