藍莓花青素的提取工藝及其免疫調節活性

潘利華，王建飛，葉興乾，羅建平,*

（1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

藍莓花青素的提取工藝及其免疫調節活性

潘利華1,2，王建飛1，葉興乾2，羅建平1,*

（1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

采用單因素試驗和五元二次正交旋轉組合設計試驗優化藍莓花青素的提取工藝，并通過體外細胞培養評價藍莓花青素對脾細胞增殖活力以及協同ConA促進小鼠脾細胞分泌干擾素-α和白細胞介素-2的活性。結果表明：乙醇體積分數、料液比、提取溫度和提取時間對藍莓花青素提取率有顯著影響；藍莓花青素最佳提取工藝條件為：酒石酸為酸化劑、乙醇體積分數74.6%～76.2%、料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL）、浸提溫度52.5～53.4 ℃、浸提液pH 3.0～3.1、浸提時間144.8～148.5 min，此工藝條件下藍莓花青素的提取率均大于35 mg/g，具有促進小鼠脾細胞增殖和協同ConA促進小鼠脾細胞分泌干擾素-α和白細胞介素-2活性，且呈一定的劑量相關性。

藍莓；花青素；正交旋轉組合設計；免疫調節活性

藍莓是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）多年生常綠灌木果樹，原產于加拿大東部和美國東北部[1]。經過100多年的栽培馴化，藍莓已成為一個世界性的果樹新產業，在中國、蒙古北部、前蘇聯、歐洲、北美等國家和地區均有分布[2]。藍莓果實中富含的花青素，具有增強機體免疫力、抗氧化、促進視紅素再合成、抗心血管疾病、抗衰老等多種生理活性功能，在食品、化妝品、藥品等領域有著廣闊的應用前景[3-7]。

提取是藍莓花青素功能產品研發與應用的關鍵步驟之一[8]。溶劑萃取法是提取花青素的傳統方法，這是由于花青素主要以花青素糖苷形式存在于自然界中，具有較強的極性[9-10]。常用的溶劑主要有甲醇、乙醇等親水性有機溶劑，石油醚、乙酸乙酯等親脂性有機溶劑和水。為提高花青素的溶出率，通常在提取劑中加少量的鹽酸、磷酸等無機酸或醋酸、檸檬酸等有機酸[11-12]。但是Revilla等[13]研究表明，當提取液中鹽酸濃度高于0.12 mol/L時，會造成紅葡萄花青素發生部分水解。所以，為了既能提高花青素的溶出率，又能最大程度地保持其穩定，人們開始采用有機酸酸化的有機溶劑提取花青素。本實驗在評價有機酸和無機酸對藍莓花青素提取效果影響的基礎上，對有機酸酸化乙醇的藍莓花青素提取工藝參數進行了優化，并評價了提取產品藍莓花青素的免疫調節活性，旨在為藍莓花青素深加工產品的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓果（兔眼藍莓巴爾德溫栽培種果實） 安徽徽王食品有限公司；雄性BALB/c小鼠（8～10周，體質量（20±2）g） 安徽醫科大學動物實驗中心；小鼠酶聯免疫吸附測定干擾素-α（interferon-α，FN-α）、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）試劑盒 南京建成科技有限公司；RPMI-1640培養基 默賽飛世爾科技有限公司；矢車菊素3-O-葡萄糖苷標準品 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

CT15RT型高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；Hei-VAP Advantage型旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；V1100型可見光分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；LGJ-18S型原位真空冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；SW-CJ-1FD型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；MCO-17AIC型CO2細胞培養箱 日本三洋公司；Model 680型酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓花青素的提取

首先用組織搗碎機將藍莓鮮果搗碎成藍莓糊，再置于提取瓶中，加入一定量的酸化乙醇浸提液，然后在一定溫度條件下浸提一定時間，得到浸提液；將浸提液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液后測定其花青素含量。

1.3.2 單因素試驗

精確稱取藍莓鮮果500 g，搗碎成藍莓糊，加入一定體積的浸提液。設定乙醇體積分數65%、料液比（冷凍鮮果質量與提取劑體積之比）1∶4、浸提溫度50 ℃、浸提液pH 4.0、浸提時間60 min，固定其他條件，分別探討酸化劑、浸提液中乙醇體積分數、浸提料液比、浸提溫度、浸提液pH值、浸提時間對藍莓花青素提取率的影響。

1.3.3 二次正交旋轉組合設計試驗

在單因素試驗基礎上，選擇乙醇體積分數、浸提料液比、浸提溫度、浸提液pH值、浸提時間共5個因素為研究對象，按照五因素四水平（1/2）實施二次正交旋轉組合設計試驗，因素水平編碼表如表1所示[14]。

表1 二次正交旋轉組合試驗因素編碼水平表Table1 Coded levels for independent variables used in orthogonal rotation combination design

1.3.4 藍莓花青素的提取率測定

采用雙波長pH值示差法[15]，以矢車菊素3-O-葡萄糖苷為參照。取待測液1 mL，加入NaAc-HAc緩沖溶液（pH 4.5，0.4 mol/L）或KCl-HCl緩沖溶液（pH 1.0，0.25 mol/L）9 mL，搖勻，轉入光路長為1 cm的比色皿中，以蒸餾水代替樣品溶液做空白對照，分別在510 nm和700 nm波長處測定光密度(optical density，OD)。

花青素提取率/（mg/g）=A×Mw×DF×100/（ε×1）

式中：A=（OD510nm，pH1.0－OD700nm，pH1.0）－（OD510nm，pH4.5－OD700nm，pH4.5；Mw=449.2 g/mol，矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質量；DF為待測液稀釋倍數；ε=26 900 L/（mol·cm），矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數。

1.3.5 藍莓花青素的免疫調節活性評價

取1.3.1節藍莓花青素的提取中得到的上清液，通過AB-8大孔吸附樹脂吸附，再用體積分數60%的乙醇解吸，收集解吸液；解吸液冷凍干燥得到花青素干粉，根據試驗需要配制花青素溶液。

頸錐脫臼法處死小鼠，制備脾細胞懸液并調整其細胞濃度為1×108cells/L。取96孔培養板，每孔先加脾細胞懸液100 ?L，空白對照組再加入100 ?L RPMI-1640培養基；陽性對照組再加入50 ?L RPMI-1640培養基和50 ?L ConA（Concanavalin A）溶液（ConA用RPMI-1640培養基配制，終質量濃度為2.5 mg/L，下同）；樣品組再分別加入50 ?L花青素溶液（花青素用RPMI-1640培養基配制，終質量濃度分別為25、50、100 mg/L）和50 ?L ConA溶液（ConA終質量濃度為2.5 mg/L）；每組3孔，每孔終體積200 ?L。將培養板置于37 ℃含5% CO2細胞培養箱中培養3 d。取樣檢測前4 h向每孔中加入50 ?L的噻唑藍，繼續培養4 h后3 000 r/min離心10 min，收集上清，按IFN-α、IL-2測定試劑盒標準操作程序于酶標儀上測定IFN-α和IL-2含量。離心管底部的藍色沉淀用100 ?L的二甲基亞砜充分振蕩溶解后于酶標儀570 nm波長處測定OD，以OD值表示脾細胞增殖活性[16-17]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酸化劑對藍莓花青素提取率的影響

圖1 酸化劑對提取率的影響Fig.1 Effect of acidulants on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖1表明，與對照組相比，有機酸和無機酸都提高了藍莓花青素的提取率，酸化劑處理組提取率為對照組的1.1～1.5倍，且以有機酸酒石酸或無機酸鹽酸為酸化劑時，藍莓花青素的提取率最高，分別為33.54 mg/g和32.82 mg/g。鹽酸和酒石酸為酸化劑時，藍莓花青素提取率無顯著差異（P＞0.05），但鹽酸的腐蝕性明顯強于酒石酸，且鹽酸易造成花青素的降解[13]。因此，本實驗以酒石酸酸化的乙醇作為提取劑。

2.1.2 提取劑中乙醇體積分數對藍莓花青素提取率的影響

圖2 乙醇體積分數對花青素提取率的影響Fig.2 Effect of exthanol concentration on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖2可見，以酒石酸酸化的乙醇為提取劑，固定其他因素不變，當乙醇體積分數為25%～65%之間時，提取率隨著提取劑中乙醇體積分數的增大不斷增高；乙醇體積分數為65%時，藍莓花青素提取率達到最大值33.26 mg/g；但是，隨著乙醇體積分數的繼續增大，藍莓花青素提取率反而降低。藍莓花青素屬于黃酮類物質，由花青素苷元與花青素糖苷組成，可溶于水、乙醇等極性溶劑，當提取劑的極性和花青素極性相近時，花青素在提取劑中的溶解性最好，溶出率最大；但當乙醇提取分數繼續增大時，提取劑極性相對變小，偏離了藍莓花青素的極性，從而降低了花青素的溶出，因此，提取率反而有所下降[12,18]。可見，提取劑中乙醇體積分數為65%時，其極性最相近花青素的極性，有利于藍莓花青素的溶出。

2.1.3 料 液比對藍莓花青素提取率的影響

圖3 料液比對花青素提取率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖3可知，固定其他因素不變，當料液比在1∶2～1∶6（g/mL）時，藍莓花青素提取率隨著液料比的增加而提高，這是由于提取液使用量的增加有利于藍莓中花青素的溶出。繼續增加料液比，藍莓花青素的提取率并沒有繼續增加，可能與藍莓果為小漿果，本身含水率高，1∶6（g/mL）的料液比已經使藍莓花青素的溶出基本達到飽和有關[19]。

2.1.4 浸提溫度對藍莓花青素提取率的影響

圖4 浸提溫度對花青素提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of anthocyanins

由圖4可知，固定其他因素不變，溫度較低時，藍莓花青素的提取率隨著浸提溫度的升高而增大。當浸提溫度為50 ℃時，提取率最大；繼續升高浸提溫度，藍莓花青素提取率反而下降，這可能與花青素的熱穩定性較差有關[19-20]。

2.1.5 浸提液pH值對藍莓花青素提取率的影響

自然條件下，藍莓花青素為花青素糖苷類物質，在酸性條件下穩定并且呈色效果好[19]。實驗結果顯示，固定其他因素不變，當浸提液pH值為1～3時，藍莓花青素提取率稍有提高（數據未顯示），但是，為了調整浸提液pH值小于3，勢必加入較多的酒石酸，100 mL 60%乙醇溶液調節pH值至2.5時，需加入酒石酸5～6 mL。因此，本研究采用浸提液pH值大于3的酸性條件進行提取。從圖6可以看出，當浸提液pH值為3～7時，藍莓花青素提取率隨著pH值的增大而降低。

圖5 浸提液pH值對提取率的影響Fig.5 Effect of solvent pH on the extraction efficiency of anthocyanins

2.1.6 浸提時間對藍莓花青素提取率的影響

圖6 浸提時間對提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the extraction efficiency of anthocyanins

從圖6可見，固定其他因素不變，當浸提時間在20～40 min時，藍莓花青素提取率隨著提取時間的延長迅速提高；浸提時間繼續延長至150 min時，花青素提取率緩慢增大；繼續延長浸提時間，花青素提取率稍有降低。這是因為，隨著浸提時間的延長藍莓花青素不斷地溶出，當花青素溶解度接近飽和時，提取率緩慢增加；而花青素的穩定性較差，繼續延長浸提時間，提取率反而稍有下降。

2.2 二次正交旋轉組合設計試驗

2.2.1 二次正交旋轉試驗結果

五元二次正交旋轉組合設計（1/2實施）的試驗結果見表2。

表2 二次正交旋轉組合設計試驗方案及結果Table2 Scheme and results of orthogonal rotation combination design

續表2

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗

表3 方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results

采用DPS數據處理系統對表2中的結果進行二次多項式逐步回歸分析，得到藍莓花青素提取效率（Y）和乙醇體積分數（X1）、料液比（X2）、浸提溫度（X3）、浸提液pH值（X4）、浸提時間（X5）因子之間的回歸方程：

回歸方程的的失擬性檢驗F1＝2.085＜F0.05（6,9）＝3.37及F0.01（6,9）＝5.80，F2＝23.704＞F0.05（20,15）＝2.33及F0.01（20,15）＝3.36（表3），說明模型的預測準確，模型擬合結果好，可用于描述藍莓花青素提取率隨上述5個因素的變化趨勢。在α＝0.05顯著水平上剔除不顯著項后，簡化的回歸方程：

2.2.3 主效應分析

各因素的P值大小反映了各因素對試驗指標的影響強度，P值越小，表明該因素對試驗結果影響越大。由表3可知，乙醇體積分數、料液比、浸提溫度、浸提時間對藍莓花青素提取率都有極顯著影響，而浸提液pH值有顯著影響。

2.2.4 單因素效應分析

將得到的回歸方程（1）中的5個因素任意4個固定在零水平，得以下方程式：

圖7 各單因素水平值與花青素提取率的關系Fig.7 Relationship between each variable and the extraction efficiency of anthocyanidin

將5個因子的取值固定在－2、－1.5、－0.5、0、0.5、1.0、1.5、2水平，根據方程式（3）～（7），計算出各因子在8個不同水平上花青素提取效率（Y），結果見圖7。由圖7可知，當各因子處于－2～2區間時，藍莓花青素提取率隨著乙醇體積分數、料液比及浸提時間的增大先升高后趨于平穩，而隨著浸提溫度和浸提液pH值的增大先增加后下降。這與前面單因素試驗結果基本相符。

2.2.5 提取工藝參數的優化

藍莓花青素提取率大于35 mg/g的572個方案中各變量取值的頻率分布分析見表4。由表4可知，藍莓花青素最佳提取工藝參數范圍為：乙醇體積分數74.6%～76.2%，料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL），浸提溫度52.5～53.4 ℃，浸提液pH 3.0～3.1，浸提時間144.8～148.5 min。

表4 各變量取值頻率分布Table4 Probability distribution of each variable

2.2.6 驗證實驗

從表4優化的參數取值范圍內隨機選擇3個組合進行驗證實驗，3次驗證實驗平均理論值為41.73 mg/g，平均實際值為42.08 mg/g，實際值與理論值基本吻合，且均在35 mg/g以上。由此可知，采用本實驗的提取工藝參數，可獲得35 mg/g以上的藍莓花青素提取率。

2.3 藍莓花青素的免疫調節活性

藍莓花青素的免疫調節活性以其對小鼠脾細胞 增殖活性的大小以及其聯合ConA促進脾細胞分泌IFN-α和IL-2的水平表征。由圖8可知，陽性對照組和藍莓花青素樣品組的OD值均大于空白對照組；藍莓花青素質量濃度為25 mg/mL時，與陽性對照組相比較，差異不顯著（P＞0.05）；當質量濃度為50 mg/mL和100 mg/mL時，其OD值都極顯著高于空白對照組（P＜0.01），說明藍莓花青素對脾淋巴細胞的增殖有促進作用，且隨著花青素質量濃度的增大和培養時間的延長而增強。

圖8 藍莓花青素對小鼠 脾細胞增殖活性的影響Fig.8 Effects of blueberry anthocyanins on splenocyte proliferation in mice

TNF-α和IL-2是兩個重要的介導免疫反應的細胞因子[21]。圖9和圖10的結果表明，培養1d，陽性對照組和藍莓花青素樣品組的OD值與空白對照組無顯著差異（P＞0.05）；培養2 d后，OD值顯著高于空白對照組（P＜0.05）。可見，本工藝提取獲得的藍莓花青素不僅促進脾細胞增殖，同時能協同ConA刺激小鼠脾T淋巴細胞分泌TNF-α和IL-2炎癥因子。根據《保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊》[22]評判標準，初步判定本工藝提取獲得的藍莓花青素，具有增強免疫力功能。

圖9 藍莓花青素對脾細胞分泌IFFNN--α含量的影響Fig.9 Effect of blueberry anthocyan on IFN-α production

圖10 藍莓花青素對脾細胞分泌IL-2含量的影響Fig.10 Effect of blueberry anthocyanins on IL-2 production

3 結 論

藍莓花青素最佳 提取工藝條件為酒石酸為酸化劑、乙醇體積分數74.6%～76.2%、料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL）、浸提溫度52.5～53.4 ℃、浸提液pH 3.0～3.1、浸提時間144.8～148.5 min，此提取工藝參數范圍內藍莓花青素的提取率均能高于35 mg/g。最佳工藝條件下提取的藍莓花青素仍具有促進小鼠脾細胞增殖及協同ConA促進小鼠脾細胞分泌TNF-α和IL-2活性。因此本研究為藍莓花青素的提取加工與產品研發提供了科學指導。

[1] KUEPPER G L, DTVER S. Blueberries: organic production[M]. Horticulture Production Guide, 2004(6): 1-26.

[2] 王璇琳, 范玉玲, 王喜軍, 等. 越桔的資源、品質及藥用研究概況[J].中國林副特產, 1999, 50(3): 42-44.

[3] 胡雅馨, 李京, 惠伯棣. 藍莓果實中主要營養及花青素成分的研究[J]. 食品科學, 2006, 27(10): 600-603.

[4] BURDULIS D, SARKINAS A, JASUTIENE I, et al. Comparative study of anthocyanin composition, antimicrobial and antioxidant activity in bilberry (Vaccinium myrtillus) and blueberry (Vaccinium corymbosum) fruits[J]. Acta Poloniae Pharmaceutica, 2009, 66(4): 399-408.

[5] 劉會靈, 曹建新. 越橘屬植物的研究進展[J]. 天然產物研究與開發, 2009, 21(5): 905-911; 870.

[6] GIACALONE M, DI S F, TRAUPE I, et al. Antioxidant and neuroprotective properties of blueberry polyphenols: a critical review[J]. Nutritional Neuroscience, 2011, 14(3): 119-125.

[7] JOSEPH J A, SHUKITT-HALE B, BREWER G J, et al. Differential protection among fractionated blueberry polyphenolic families against DA-, Aβ42- and LPS-induced decrements in Ca2＋buffering in primary hippocampal cells[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(14): 8196-8204.

[8] SMITH J, CHARTER E. Functional food product development[M]. John Wiley & Sons Ltd, 2010.

[9] 閆秋麗, 朱詩優, 楊鑫鑫, 等. 花青素提取、純化及穩態化技術研究進展[J]. 食品科技, 2011, 36(10): 219-222.

[10] ZU Xiaoyan, ZHANG Zhenya, ZHANG Xiaowen, et al. Anthocyanins extracted from Chinese blueberry (Vaccinium uliginosum L.) and its anticancer effects on DLD-1 and COLO205 cells[J]. Chinese Medical Journal, 2010, 123(19): 2714-2719.

[11] CASTANEDA-OVANDO A, de LOURDES P H M, ELENA P H M, et al. Chemical studies of anthocyanins: a review[J]. Food Chemistry, 2009, 113(4): 859-871.

[12] BARNES J S, NGUYEN H P, SHEN S, General method for extraction of blueberry anthocyanins and identification using high performance liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap-time of flightmass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(23): 4728-4735.

[13] REVILLA E, CARRASCO D, BENITO A, et al. Anthocyanin composition of several wild grape accessions[J]. American Journal Enology and Viticulture, 2010, 61(4): 536-543.

[14] 徐仲儒. 回歸分析與試驗設計[M]. 北京: 中國農業出版社, 1997: 102-156.

[15] LEE J, DURST R W, WROLSTAD R E. Deter mination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices, beverages, natural colorants, and wines by the pH differential method: collaborative study[J]. Journal of AOAC international, 2005, 88(5): 1269-1278.

[16] 薛慶善. 體外培養的原理與技術[M]. 北京: 科學出版社, 2001: 453-454.

[17] 徐明生, 林日新, 湯群, 等. 卵轉鐵蛋白體外免疫活性研究[J]. 食品與機械, 2012, 28(2): 115-119.

[18] 趙秀玲. 藍莓的成分與保健功能的研究進展[J]. 中國野生植物資源, 2011, 30(6): 19-23.

[19] ROOBHA J J, SARAVANAKUMAR M, ARAVINDHAN K M, et al. The effect of light, temperature, pH on stability of anthocyanin pigments in Musa acuminata bract[J]. Research in Plant Biology, 2011, 1(5): 5-12.

[20] IOANNOU I, HAFSA I, HAMDI S, et al. Review of the effects of food processing and formulation on flavonol and anthocyanin behaviour[J]. Journal of Food Engineering, 2012, 111(2): 208-217.

[21] 何維. 醫學免疫學[M]. 2版. 北京: 人民衛生出版社, 2010: 185-196.

[22] 黃雨三. 保健食品檢驗與評價技術規范實施手冊[M]. 清華同方電子出版社, 2010: 716-731.

Optimization of Extraction Process and Evaluation of Immunomodulatory Activity of Anthocyanins from Blueberry

PAN Li-hua1,2, WANG Jian-fei1, YE Xing-qian2, LUO Jian-ping1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

A quadratic orthogonal rotary composite design was used to optimize the extraction of anthocyanins from blueberry with respect to five process parameters including ethanol concentration, material-to-liquid ratio, solvent pH, temperature and time, and the proliferative effect of the extracted anthocyanins on spleen cells as well as the synergistic effect when combined with ConA on promoting the secretion of interferon-a (IFN-α) and interleukin-2 (IL-2) in mouse spleen cells was evaluated by in vitro cultivation. The results showed that the extraction efficiency for blueberry was significantly affected by ethanol concentration, material-to-liquid ratio, temperature and time. The optimal extraction conditions were found to be 74.6%–76.2% ethanol as extraction solvent with a material-to-liquid ratio of 1:6.6–1:6.8 (g/mL) for 144.8–148.5 min of extraction at pH 3.0–3.1 and 52.5–53.4 ℃. Under these conditions, the yield of anthocyanidins extracted from blueberry was more than 35 mg/g. The blueberry anthocyanins could significantly promote the proliferation of spleen cells and cooperate with ConA to accelerate the production of TNF-α and IL-2 in normal mouse spleen cells in a dose-dependent way.

blueberry; anthocyanin; orthogonal rotation combination design; immunomodulatory activity

TS202.3

A

1002-6630（2014）02-0081-06

10.7506/spkx1002-6630-201402015

2013-04-28

安徽省2012年度科技攻關計劃項目（1201032075）

潘利華（1973—），女，副教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：panlihua@hfut.edu.cn

*通信作者：羅建平（1966—），男，教授，博士，研究方向為中草藥與功能食品化學。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn