超聲波輔助酶法分離提取葡萄酒泥酵母SOD工藝條件的優(yōu)化

杜 娜，楊學(xué)山*，韓舜愈，祝 霞，付文力，王 婧，盛文軍，張 波

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

超聲波輔助酶法分離提取葡萄酒泥酵母SOD工藝條件的優(yōu)化

杜 娜1，楊學(xué)山2,*，韓舜愈1，祝 霞1，付文力2，王 婧1，盛文軍1，張 波1

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

以葡萄酒泥酵母為試材，超氧化物歧化酶（SOD）比活力為指標(biāo)，在超聲功率、超聲時(shí)間、蝸牛酶質(zhì)量濃度、酶解pH值和酶解溫度等單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助蝸牛酶法提取SOD的工藝條件。結(jié)果表明：提取工藝因素對(duì)SOD比活力影響大小順序?yàn)槌晻r(shí)間＞蝸牛酶質(zhì)量濃度＞超聲功率＞酶解pH值＞酶解溫度，1 g濕酵母懸浮于5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，其提取SOD最佳工藝條件為超聲功率400 W、超聲時(shí)間12 min、2.0 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL、pH 6.6、溫度37 ℃，在此條件下，分離提取得到的SOD比活力達(dá)192.27 U/mg。結(jié)果表明超聲波輔助酶法在葡萄酒泥酵母SOD的提取中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

葡萄酒泥酵母；超氧化物歧化酶；超聲波；蝸牛酶

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）廣泛分布于動(dòng)物、植物和需氧微生物細(xì)胞內(nèi)[1]，可維持體內(nèi)超氧陰離子自由基的動(dòng)態(tài)平衡，防止其對(duì)生物體的毒害[2]。SOD制劑在醫(yī)藥、食品及化妝品等方面具有廣泛的用途[3]。目前國(guó)內(nèi)利用動(dòng)物血液制備SOD取得了一定的成果，但存在原料來(lái)源受限，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定及潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題，因此利用微生物安全性較高、繁殖快、易大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)生產(chǎn)SOD成為了研究熱點(diǎn)[4-6]。

2011年我國(guó)葡萄酒年產(chǎn)量已達(dá)1.16×106kL，且保持年均10%～15%的增長(zhǎng)速度[7]。在葡萄釀酒過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生總加工酒量2%～4%的葡萄酒泥[8-9]，其中含有大量的酵母細(xì)胞。大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)將酒泥酵母直接丟棄或發(fā)酵后用作肥料，不僅浪費(fèi)了寶貴的生物資源，而且會(huì)造成環(huán)境污染[10]。因此，利用葡萄酒泥酵母分離提取SOD，不僅可以獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益，而且能夠有效減輕葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)的環(huán)保壓力。

利用葡萄酒泥酵母分離提取SOD國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。馬森等[11]利用超聲波輔助提取啤酒廢酵母中活性成分，李永霞等[12]采用酶法結(jié)合機(jī)械破碎酵母提取肽酶，吳桂英等[13]運(yùn)用高壓破碎酵母釋放乙醛脫氫酶，曾俊華等[14]介紹了乙酸乙酯處理酵母細(xì)胞，再采用擠壓法破碎酵母釋放腺苷蛋氨酸。結(jié)果顯示單一的破壁方法效果均不理想。超聲波可通過(guò)水介質(zhì)的空化作用，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生破碎，釋放內(nèi)容物[15-16]。蝸牛酶是從蝸牛的嗉囊和消化道中制備的混合酶，含有纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20多種酶，可用于植物及酵母細(xì)胞壁的破碎[17]。因此本實(shí)驗(yàn)以葡萄酒泥酵母為原料，采用超聲波輔助蝸牛酶酶解葡萄酒泥酵母細(xì)胞壁分離提取SOD，并對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為葡萄酒泥酵母資源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒泥酵母 甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司。

牛血清白蛋白 美國(guó)Pharmacia公司；蝸牛酶 金田生物科技有限公司；SOD活性測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、鄰苯三酚、檸檬酸鈉、山梨醇、Na2HPO4·12H2O、考馬斯亮藍(lán)均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；SL-1001電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；PHS-3C pH計(jì) 上海雷磁有限公司；808型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒泥酵母SOD提取工藝流程

葡萄酒泥→預(yù)處理→收集濕酵母→加入磷酸鹽緩沖液→超聲波處理→加入蝸牛酶→保溫處理→離心→熱變性→離心→提取液→SOD活性及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

1.3.2 操作要點(diǎn)

葡萄酒泥酵母預(yù)處理：收集足量的葡萄酒泥，與蒸餾水以1∶1比例混合，用80目的篩子進(jìn)行篩分[18]，在4 000 r/min離心20 min，重復(fù)上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無(wú)色透明為止，收集沉淀備用；超聲波處理：以料液比1∶5（g/mL）將酵母懸浮于0.2 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液中，進(jìn)行超聲波處理；蝸牛酶消化：在超聲波處理液中加入質(zhì)量濃度1.0 mg/100 mL蝸牛酶液（蝸牛酶需用1.0 mol/L山梨醇等滲溶液溶解），控制溫度和pH值，酶解2 h，4 000 r/min離心20 min，收集上清液；熱變性：上清液45 ℃水浴20 min，4 000 r/min離心15 min，除去雜蛋白，即得SOD液。取樣進(jìn)行SOD活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別對(duì)不同超聲功率、超聲時(shí)間、蝸牛酶質(zhì)量濃度、酶解pH值和酶解溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，重復(fù)3次。以SOD比活力為指標(biāo)，為正交試驗(yàn)選擇因素水平。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定葡萄酒泥酵母中提取SOD的正交試驗(yàn)因素和水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化超聲波輔助蝸牛酶法提取SOD的最優(yōu)工藝，平行重復(fù)2次。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[19]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=0.004 9X－0.006 9（R2=0.998 9）。方程符合測(cè)定要求。

1.3.6 SOD酶活力測(cè)定

SOD活性測(cè)定試劑盒進(jìn)行 。根據(jù)蛋白質(zhì)含量和酶活力測(cè)定值計(jì)算SOD比活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率對(duì)SOD比活力的影響

將1 g濕酵母分別懸浮于5 mL pH 5.8、0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，分別在超聲功率為200、300、400、500、600 W條件下處理16 min，再加入質(zhì)量濃度1 mg/100 mL的蝸牛酶液1 mL，37 ℃保溫2 h，離心后熱變性除去雜蛋白。SOD比活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 超聲功率對(duì)SOD比活力的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on SOD specific activity

由圖1可知，隨著超聲功率的增加，SOD比活力在呈先上升后下降趨勢(shì)，400 W時(shí)達(dá)到最大值。其原因是，在超聲波作用時(shí)間一定時(shí)，超聲波的破碎作用主要取決于超聲功率，功率越大，其機(jī)械振動(dòng)強(qiáng)度越大，酵母細(xì)胞壁破碎效果就越好，越有利于SOD釋放[20-21]，但超聲功率過(guò)大可能會(huì)導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)變化，從而影響酶的活性。因此，選擇最佳超聲功率為400 W。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)SOD比活力的影響

將1 g濕酵母分別懸浮于5 mL 0.2 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液中，在超聲功率400 W條件下分別處理8、12、16、20、24 min，再加入質(zhì)量濃度為1.0 mg/100 mL的蝸牛酶液1 mL，37 ℃保溫2 h，離心后熱變性除去部分雜蛋白。測(cè)定SOD比活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)SOD比活力的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on SOD specific activity

由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD比活力先不斷升高，當(dāng)超聲時(shí)間為16 min時(shí)達(dá)到最大值，隨后開(kāi)始下降。因?yàn)檫m當(dāng)?shù)某晻r(shí)間，可以有效破壞酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，有利于SOD釋放，但處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)引起熱量積聚或機(jī)械剪切作用導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變化[22]，進(jìn)而影響SOD比活力。因此超聲時(shí)間可控制在16 min左右。

2.1.3 蝸牛酶液質(zhì)量濃度對(duì)SOD比活力的影響

將1 g濕酵母分別懸浮于5 mL 0.2 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液中，超聲功率400 W處理16 min后分別加入質(zhì)量濃度0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/100 mL的蝸牛酶液1 mL， 37 ℃水浴2 h，離心后熱變性。SOD比活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 蝸牛酶質(zhì)量濃度對(duì)SOD比活力的影響Fig.3 Effects of snailase dosage on SOD specific activity

由圖3可知，SOD比活力隨著蝸牛酶量的增加而增加，當(dāng)蝸牛酶質(zhì)量濃度增加至1.5 mg/100 mL時(shí)，SOD比活力達(dá)到最大值。當(dāng)蝸牛酶量再增加時(shí)，SOD比活力開(kāi)始下降。因?yàn)槲伵Ｃ钢泻械鞍酌福^(guò)量的蝸牛酶在水解酵母細(xì)胞壁的同時(shí)，也可降解SOD[23-24]，這也是單一大量使用蝸牛酶進(jìn)行酵母細(xì)胞破碎提取蛋白質(zhì)類(lèi)效果不佳的原因之一。綜合考慮結(jié)果及成本等因素，故最終選擇1.5 mg/100 mL蝸牛酶液為最佳質(zhì)量濃度。

2.1.4 酶解pH值對(duì)SOD比活力的影響

將1g濕酵母分別懸浮于5 mL pH值為5.4、5.8、6.2、6.6、7.0的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，在超聲功率400W處理16 min后，加入質(zhì)量濃度1.5 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL，37 ℃保溫2h，離心后熱變性。SOD比活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酶解pH值對(duì)SOD比活力的影響Fig.4 Effect of initial hydrolysis pH on SOD specific activity

由圖4可知，pH值對(duì)SOD比活力影響較大，當(dāng)pH值小于或大于6.2時(shí)，酶的比活力都有所下降。這是由于當(dāng)pH值為6.2時(shí)，既介于蝸牛酶的作用pH值（5.5～7.2）范圍內(nèi)[25-26]，使酵母細(xì)胞破碎效果較好，又對(duì)SOD的活性影響較小，當(dāng)pH值高于或低于6.2，SOD穩(wěn)定性會(huì)受到一定影響，進(jìn)而導(dǎo)致SOD比活力降低。

2.1.5 酶解溫度對(duì)SOD比活力的影響

將1g濕酵母懸浮于5 mL 0.2 mol/L、pH 6.2的磷酸鹽緩沖液中，超聲功率400W處理16 min后加入質(zhì)量濃度1.5 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL，分別于31、34、37、40、43 ℃水浴2h，離心后熱變性，SOD比活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 酶解溫度對(duì)SOD比活力的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on SOD specific activity

由圖5可知，隨著酶解溫度升高，SOD比活力逐漸增高，在37 ℃時(shí)達(dá)到最大值，超過(guò)37 ℃后酶活性開(kāi)始下降，證明37 ℃為蝸牛酶液的最佳酶解溫度，與李永霞[12]、張培德[17]等的研究結(jié)果一致。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)SOD比活力影響較大的超聲功率、超聲時(shí)間、蝸牛酶質(zhì)量濃度和酶解pH值進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。計(jì)算每一試驗(yàn)組合的SOD比活力，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到最優(yōu)組合后進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確定超聲波輔助蝸牛酶法提取葡萄酒泥酵母SOD的最優(yōu)工藝條件。

表1 L 1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1 Lle1 L9(3(34) orthogonal array design arrangement and experimental results ) orthogonal array design arrangement and experimental results

從表1可以看出，分離提取葡萄酒泥酵母SOD影響因素的主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即超聲時(shí)間＞蝸牛酶質(zhì)量濃度＞超聲功率＞酶解pH值。由K值可以確定最佳工藝組合為A2B1C3D3，即超聲功率400 W、超聲時(shí)間12 min、質(zhì)量濃度2.0 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL、酶解pH 6.6。

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)方差分析Table2 Analysis of variances for SOD specific activity with various extraction conditions

由表2可知，因素A、B、C在P＜0.05的水平上有顯著性差異，因素D酶解pH值不顯著。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于L9（34）正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合在L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中未出現(xiàn)，因而需對(duì)正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。1 g濕酵母分別懸浮于5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，在超聲功率400 W、超聲時(shí)間12 min、質(zhì)量濃度2.0 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL、酶解pH 6.6、酶解溫度37 ℃條件下提取SOD，重復(fù)3次。測(cè)得平均SOD比活力為192.27 U/mg，比正交試驗(yàn)中最優(yōu)組合得到的酶比活力高，可見(jiàn)正交試驗(yàn)方差分析所確定的為最佳工藝參數(shù)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以葡萄酒泥酵母為原料，通過(guò)不同單因素條件下的提取結(jié)果，對(duì)超聲波輔助蝸牛酶法提取葡萄酒泥酵母SOD主要影響因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為1 g濕酵母分別懸浮于5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中，超聲功率400 W、超聲時(shí)間12 min、質(zhì)量濃度2.0 mg/100 mL蝸牛酶液1 mL、酶解pH 6.6、酶解溫度37 ℃，在此條件下提取SOD，所得平均SOD比活力為192.27 U/mg。該工藝具有工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、產(chǎn)品安全性高等特點(diǎn)，具有一定的應(yīng)用前景。

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Optimization of Process Conditions for Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Superoxide Dismutase from Waste Wine Yeast

DU Na1, YANG Xue-shan2,*, HAN Shun-yu1, ZHU Xia1, FU Wen-li2, WANG Jing1, SHENG Wen-jun1, ZHANG Bo1
(1. College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. College of Life Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The current work was designed to establish an optimal procedure for the extraction of superoxide dismutase (SOD) from waste wine yeast by ultrasonic-assisted snailase hydrolysis. Five process parameters, ultrasonic power, radiation time, enzyme concentration, pH and temperature were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design. The effects of these variables on SOD specific activity in extracts decreased in this order: radiation time ＞ enzyme concentration ＞ultrasonic power ＞ pH ＞ hydrolysis time. The optimal extraction conditions were found to be ultrasonic pretreatment at a power of 400 W for 12 min and subsequent hydrolysis with 1 mL of 2.0 mg/100 mL snailase solution at 37 ℃ with an initial pH of 6.6. Under these optimal conditions, the specific activity of SOD was 192.27 U/mg. The ultrasonic-assisted snailase hydrolysis procedure deserves further application in the production of SOD from waste wine yeast.

wine yeast; superoxide dismutase (SOD); ultrasound; snailase

TS261.9

A

1002-6630（2014）02-0087-04

10.7506/spkx1002-6630-201402016

2013-01-05

甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（1104NKCA080）

杜娜（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工利用。E-mail：dnxiaole88@163.com

*通信作者：楊學(xué)山（1977—），男，講師，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與生物產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。E-mail：yangxs@gsau.edu.cn