高良姜多糖提取工藝優化及其抗氧化活性

鄭 義，王衛東，李 勇，朱園園，郭 靜

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇 徐州 221000；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221000）

高良姜多糖提取工藝優化及其抗氧化活性

鄭 義1,2，王衛東1,2，李 勇1,2，朱園園1，郭 靜1

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇 徐州 221000；2.江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221000）

通過Box-Behnken試驗設計，獲得了熱水浸提高良姜多糖的最佳工藝；以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力、還原力、清除羥自由基能力、螯合鐵離子能力為指標，評價了高良姜多糖的抗氧化活性。結果表明，熱水浸提高良姜多糖的最佳工藝條件為液料比43∶1（mL/g）、浸提溫度95 ℃、浸提時間3 h，在此條件下多糖得率實測值為11.81%。高良姜多糖具有較好的抗氧化活性，清除自由基能力、還原力和螯合鐵離子能力均表現出一定的質量濃度依賴性；高良姜多糖清除DPPH自由基、清除羥自由基和螯合鐵離子能力的半數有效質量濃度（EC50）分別為（0.59±0.01）、（0.05±0.003）g/L和（2.75±0.2）g/L。

高良姜；多糖；響應面法；抗氧化活性

高良姜為姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖，別名風姜、小良姜、高涼姜、良姜等，為衛生部認定的藥食同源的物品之一。高良姜營養成分豐富，含有豐富的糖類、蛋白質、微量元素等。目前國內外對高良姜的研究主要集中于黃酮[1-3]、芳香油[4-5]等化學成分及抑菌、抗腫瘤、降血脂等藥理功能上[6-9]，有關高良姜多糖的研究極少，而關于春砂仁、莪術等其他姜科植物多糖的研究較多，并發現多種姜科植物多糖具有抗腫瘤、調節免疫、抗氧化等作用[10-11]。目前有關高良姜多糖的提取工藝及抗氧化性能尚未見報道。本研究采用熱水浸提法提取高良姜多糖，并基于響應面法對提取工藝進行優化，評價高良姜多糖的抗氧化活性，旨在為高良姜資源的開發利用提供科學依據和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮高良姜產地為廣東徐聞，品種為牛姜，5年生；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、菲咯嗪（ferrozine） 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；THZ-82恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；R201L旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠；3K30高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 高良姜多糖的提取

將新鮮高良姜用清水洗凈，去皮，適當切片，60 ℃干燥，恒質量后粉碎，過60目篩，干燥保存待用。稱取一定量的高良姜干粉，加適量水，恒溫振蕩器中提取一定時間，抽濾后得多糖提取液。多糖提取液進行濃縮、4 ℃醇析、離心，所得沉淀用無水乙醇洗滌3次，沉淀晾干。Sevag法脫蛋白，反復進行5次。自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h。透析液濃縮后冷凍干燥得高良姜多糖。稱取一定量高良姜多糖，用蒸餾水配制成20 g/L母液，4 ℃保存，備用。

1.3.2 多糖含量測定

多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[12]。

多糖得率Y/%=高良姜多糖質量/高良姜干粉質量×100 1.3.3 單因素試驗

設定液料比20∶1（mL/g）、浸提溫度90 ℃、浸提時間2 h，固定其他因素，分別考察液料比、浸提溫度和時間對多糖得率的影響。每組試驗重復3次，取其平均值。1.3.4 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采取Box-Behnken試驗設計安排三因素三水平試驗，試驗因素水平表如表1所示。每組試驗重復3次，取其平均值。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表Table1 Coded levels for factors used in Box-Behnken experimental design

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率測定參考Wu Huichun等[13]的方法，取不同質量濃度（0.3～10 g/L）的高良姜多糖，在517 nm波長處檢測吸光度。以VC作為陽性對照。清除率計算公式如下：

式中：Ac為1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液的吸光度；Ai為1.5 mL樣品液加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液的吸光度；Aj為1.5 mL樣品液加1.5 mL 95%乙醇溶液的吸光度。

1.3.5.2 還原力測定

還原力測定方法采用鐵氰化鉀法[14]。量取不同質量濃度（0.05～1.5 g/L）的樣液2 mL，加入2 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和質量分數1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴下保溫20 min，再加入2 mL質量分數10%三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL去離子水和0.4 mL質量分數0.1%的FeCl3溶液，混勻后在50 ℃水浴下保溫10 min，當體系溶液顏色由黃色變為藍色時，在700 nm波長處測定其吸光度A700nm。以去離子水代替樣品作為空白對照，VC作為陽性對照。

1.3.5.3 羥自由基清除率測定

羥自由基清除率測定采用鄰二氮菲比色法[15]。樣品溶液質量濃度為0.01～2 g/L，以VC作為陽性對照。

損傷管：取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液加入1 mL磷酸鹽緩沖液（0.15 mol/L，pH 7.40）和0.5 mL去離子水，混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，混勻后再加入0.5 mL體積分數0.01%的H2O2，37 ℃水浴60 min后，536 nm波長處測其吸光度為A損。

未損傷管：以0.5 mL去離子水代替損傷管中的H2O2，重復上述操作步驟，測其吸光度為A未損。

樣品管：0.5 mL樣品溶液代替損傷管中的去離子水，測其吸光度為A樣。

樣品參比：取1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.40）和0.5 mL樣品溶液混合，加入1.5 mL去離子水，不需水浴，測其吸光度為A參。

空白參比：取1 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.40）加入2 mL去離子水，作為空白調零A空。

清除率計算公式為：

1.3.5.4 鐵離子螯合能力測定

鐵離子鰲合能力的測定采用 Decker等[16]的方法，略有改動。在2 mL不同質量濃度（0.5～10 g/L）的樣品溶液中，加入0.02 mL 5 mmol/L的FeCl2溶液，再加0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪，室溫靜置10 min，加入等體積的蒸餾水，搖勻，于562 nm波長處測量吸光度。上述反應體系中，以蒸餾水替代樣品溶液作為空白對照，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）作為陽性對照。每個樣品平行測定3次，取其平均值。鐵離子鰲合能力計算公式如下：

鐵離子螯合率/%=（A0－A1）/A0×100

式中：A0和A1分別為為空白對照和樣品或陽性對照的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對多糖得率的影響

圖1 液料比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharides

由圖1可知，多糖得率隨液料比的增大而增加，液料比達到40∶1（mL/g）后，多糖得率增加緩慢，表明此時浸提過程已達到基本穩定。液料比過大，后續濃縮時耗能加大，從降低成本、節約能源角度考慮，液料比宜在40∶1（mL/g）左右。

2.1.2 浸提溫度對多糖得率的影響

圖2 浸提溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature time on the yield of polysaccharides

由圖2可知，溫度在60～90 ℃之間，多糖得率隨著浸提溫度的升高而增加，溫度從90 ℃升高到100 ℃，多糖得率變化不大，故選擇較優浸提溫度為90 ℃。

2.1.3 浸提時間對多糖得率的影響

圖3 浸提時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

由圖3可知，多糖得率在1.5～3.0 h時間內呈顯著增加的趨勢，浸提時間超過3.0 h后，多糖得率增幅趨于平緩，此時多糖已基本浸提完全，故選擇3.0 h為浸提時間較優值。

2.2 Box-Behnken試驗

Box-Behnken試驗設計與結果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table2 Design and results of experiments

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗

對表1試驗數據用多元回歸擬合后，得到多糖得率Y與液料比x1、浸提溫度x2和浸提時間x3的回歸方程：

對該回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the regression model

該模型達到極顯著水平（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），決定系數R2為0. 974，校正決定系數為0.942，信噪比RSN為14.79，可知該回歸方程擬合度和可信度均很高，故可用于設計范圍內的預測。

對表3回歸模型系數的顯著性分析可見，一次項中，x2、x3極顯著，x1達到顯著水平（P＜0.05）；平方項的回歸系數均極顯著，說明各因素與多糖得率之間存在明顯的二次關系；交互項中x2x3的回歸系數達到極顯著水平，表明浸提溫度與浸提時間的交互作用對多糖得率有顯著影響。

2.2.2 兩因素間的交互效應分析

由表3可知，浸提溫度與浸提時間的交互作用對多糖得率有顯著影響，固定液料比于零水平，繪出浸提溫度與浸提時間的響應面，如圖4所示。隨著浸提溫度的升高與浸提時間的延長，多糖得率呈現出先急劇增加后緩慢下降的趨勢。當浸提溫度在90～100 ℃，浸提時間在2.9～3.3 h時，多糖得率較高。

圖4 浸提溫度與浸提時間的交互效應對多糖得率的影響Fig.4 Interactive effect of extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharides

2.2.3 最佳條件優化及驗證結果

通過所得回歸模型對提取工藝進行優化，得到最佳提取工藝條件為液料比42.75∶1（mL/g）、浸提溫度94.95 ℃、浸提時間3.06 h，在此條件下高良姜多糖得率的理論得率為11.73%。考慮實際操作情況，將最佳提取工藝修正為液料比43∶1（mL/g）、浸提溫度95 ℃、浸提時間3 h。在此修正條件下，實測提取率為11.81%，表明該回歸模型具有較好的預測性能，對于指導生產實踐具有一定的借鑒意義。

2.3 高良姜多糖的抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力

圖5 高良姜多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effects of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance against DPPH radicals

由圖5可知，在測定的質量濃度范圍，高良姜多糖對DPPH自由基的清除能力呈現出劑量依賴性。質量濃度為0.1 g/L時，清除率為22.14%，質量濃度為1 g/L時，清除率為66.69%，質量濃度為5 g/L時，清除率達到了98.36%。當質量濃度低于3 g/L時，高良姜多糖對DPPH自由基的清除能力均低于陽性對照VC；而當質量濃度為5 g/L時，高良姜多糖的清除率高于VC。

半數有效濃度（median effective concentration，EC50）是指清除率為50%時的樣品質量濃度，EC50可作為評價抗氧化能力的重要參數。如某種物質的EC50低于10 g/L，則表明其具有很好的抗氧化活性[17]。采用Logit回歸計算出高良姜多糖及VC的EC50分別為（0.59±0.01）、（0.09±0.001） g/L。高良姜多糖清除DPPH自由基的EC50遠小于10 g/L，由此可見高良姜多糖具有明顯清除DPPH自由基的能力。

有關植物多糖清除DPPH自由基能力已有較多研究，李嬌等[18]報道了蘆筍多糖的EC50為（1.50±0.75）g/L；葛霞等[19]用D301R型大孔樹脂純化制備青錢柳多糖，在質量濃度為4 g/L時，青錢柳多糖對DPPH自由基的清除率為71.8%。由此可見，高良姜多糖對DPPH自由基的清除能力明顯高于蘆筍多糖、青錢柳多糖等植物多糖。

2.3.2 還原力

圖6 高良姜多糖的還原力Fig.6 Reducing power of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

由圖6可知，在0.05～1.5 g/L的質量濃度范圍內，高良姜多糖的還原力隨著質量濃度的增加而增加，當質量濃度為0.1 g/L時，吸光度為0.285；當質量濃度為1.5 g/L時，吸光度則達到了1.027。對于分光光度法而言，吸光度高于1.0時，測量結果的相對誤差較大，故不再進一步加大高良姜多糖質量濃度。在已測量的質量濃度范圍內，高良姜多糖的還原力不及VC。

馬虎飛等[20]報道了質量濃度為1 g/L的陜北野生枸杞多糖的還原力為0.493；Wang Junlong等[21]通過微波輔助提取獲得了圓頭蒿多糖，并對其抗氧化活性進行評價，在質量濃度為5 g/L時，圓頭蒿多糖的還原力為0.86。與上述植物多糖相比，高良姜多糖表現出更強的還原力。

2.3.3 清除羥自由基能力

高良姜多糖對羥自由基的清除作用如圖7所示，在0.01～2.0 g/L的質量濃度范圍內，高良姜多糖對羥自由基的清除能力隨質量濃度增大而增大，質量濃度為0.05 g/L時，清除率為50.42%，質量濃度為1 g/L時，清除率為79.78%，在上述質量濃度時，陽性對照VC的清除率分別為53.90%和74.07%，在測定的質量濃度范圍內，高良姜多糖清除羥自由基的能力與VC基本相當。采用Logit回歸計算出高良姜多糖及VC的EC50分別為（0.05±0.003）、（0.04±0.002）g/L，EC50也表明高良姜多糖與VC清除羥自由基的能力基本相當。

圖7 高良姜多糖對羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance against hydroxyl radicals

Fu Jianfang等[22]評價了刺五加多糖的抗氧化活性，當質量濃度為0.8 g/L時，刺五加多糖對羥自由基的清除率稍低于60%。鐘文武等[23]采用水提醇沉的方法對兩種不同寄主的扁枝槲寄生多糖進行提取，兩種多糖清除羥自由基的EC50分別為0.541 1、0.590 2 g/L。由此可見，與刺五加多糖和扁枝槲寄生多糖相比，高良姜多糖具有更強的清除羥自由基能力。

2.3.4 鐵離子螯合能力

圖8 高良姜多糖對鐵離子的螯合作用Fig.8 Iron-chelating ability of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

在質量濃度為0.5～10 g/L的范圍內，高良姜多糖對鐵離子的螯合能力呈現出劑量依賴性。質量濃度為3、5、10 g/L時，螯合率分別為52.53%、78.06%、96.48%。陽性對照EDTA在質量濃度為1 g/L時，螯合率已達到86.92%。高良姜多糖與EDTA對鐵離子螯合能力的EC50分別為（2.75±0.2）、（0.12±0.02） g/L。

Chen Huoliang等[24]采用DEAE-纖維素離子交換層析和Sepharose CL-6B凝膠過濾層析法分離純化得到3個香菇多糖組分LEPA1、LEPB1和LEPC1，在質量濃度為4 g/L時，LEPB1和LEPC1的對鐵離子的螯合率分別為99.1%和99.2%。魏磊等[25]評價了雞油菌、變綠紅菇、蜜環菌和棕灰口蘑4種食用菌粗多糖的抗氧化活性，結果顯示4種食用菌粗多糖的鐵離子鰲合能力的EC50大小的順序為：棕灰口蘑（1.69 g/L）＜雞油菌（3.22 g/L）＜蜜環菌（3.41 g/L）＜變綠紅菇（3.49 g/L）。高良姜多糖對鐵離子的螯合能力弱于香菇多糖和棕灰口蘑，而強于雞油菌、蜜環菌等，顯示出良好的鐵離子螯合能力。

3 結 論

本研究建立了熱水浸提高良姜多糖的最佳工藝條件，即液料比43∶1（mL/g）、浸提溫度95 ℃、浸提時間3 h，在此條件下多糖得率理論值為11.73%，驗證值為11.81%。表明該模型具有較好的預測性能，對于指導生產實踐具有一定借鑒意義。

在測定的質量濃度范圍，高良姜多糖清除DPPH自由基能力、還原力、清除羥自由基能力、螯合鐵離子能力均隨質量濃度增大而增大。高良姜多糖清除DPPH自由基、清除羥自由基和螯合鐵離子能力的EC50分別為（0.59±0.01）、（0.05±0.003）g/L和（2.75±0.2）g/L。高良姜多糖表現出較好的抗氧化活性，可作為潛在天然抗氧化劑應用于食品和保健品工業中，而有關高良姜多糖的結構鑒定及抗氧化活性機理有待進一步研究。

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

ZHENG Yi1,2, WANG Wei-dong1,2, LI Yong1,2, ZHU Yuan-yuan1, GUO Jing1
(1. College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221000, China; 2. Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou 221000, China)

The conditions for hot water extraction of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance were optimized by Box-Behnken statistical design. The antioxidant activities of polysaccharides extracted from Alpinia officinarum Hance were investigated using four different in vitro antioxidant assays, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, reducing power, hydroxyl radical scavenging activity and iron-chelating ability. The results showed that the optimal extraction conditions were found to be extraction at 95 ℃ for 3 h with a solvent-to-solid ratio of 43:1 (mL/g). The experimentally observed yield of polysaccharides extracted from Alpinia officinarum Hance was 11.81% under these conditions. The extracted polysaccharides had powerful antioxidant activities for free radical scavenging activity, reducing power and ironchelating capacity in concentration-dependent manner, with median effective concentration (EC50) of (0.59 ± 0.01), (0.05 ± 0.003) and (2.75 ± 0.2) g/L, respectively.

Alpinia offi cinarum Hance; polysaccharides; response surface methodology; antioxidant activity

R284.2

A

1002-6630（2014）02-0126-06

10.7506/spkx1002-6630-201402023

2013-04-28

蘇北科技發展計劃項目（BC2011401）

鄭義（1982—），男，講師，碩士，研究方向為天然產物與食品生物技術。E-mail：biozheng@gmail.com