固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法對黃粉蟲中手性烯唑醇的分離測定

劉 琛，朱文學，曲昊楊，李建中，王會利，郭寶元,*

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；2.中國科學院生態環境研究中心，北京 100085）

固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法對黃粉蟲中手性烯唑醇的分離測定

劉 琛1,2，朱文學1，曲昊楊1，李建中2，王會利2，郭寶元1,2,*

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；2.中國科學院生態環境研究中心，北京 100085）

建立固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法檢測黃粉蟲中手性農藥烯唑醇的方法，對樣品凈化方法和色譜條件進行優化。樣品經乙腈提取并加入正己烷液-液分配去脂后，經弗羅里硅土小柱凈化，通過高效液相色譜-串聯質譜儀以多選擇反應監測模式進行分析測定。此方法對烯唑醇的檢出限為0.002 mg/kg，回收率在97.22%～101.31%之間，相對標準偏差小于3%，具有操作簡單、分離效果好、靈敏度和準確性高等特點。該法適合推廣用于黃粉蟲等昆蟲體內烯唑醇含量的測定。

烯唑醇；黃粉蟲；手性；固相萃取；高效液相色譜-串聯質譜

烯唑醇是一種十分重要的三唑類內吸性殺菌劑，對植株具有保護、除草和生長調節等作用[1]，其通過抑制類固醇的去甲基化和破壞麥角甾醇的生物合成，可防治白絹病、多種銹病和黑穗病[2-3]，被廣泛應用于農業生產過程中。烯唑醇在環境中具有較高的化學、光化學穩定性以及較低的生物降解性等[4]，隨著在農業生產實踐中的擴大使用，其對環境以及環境中的非靶標生物的危害也越來越大，甚至存在通過食物鏈危害到人類健康的風險。此外，目前市售的烯唑醇均以消旋體的形式銷售，然而由于烯唑醇的一條疏水鏈上存在立體中心[5]，其手性分子存在兩種形式（圖1）并表現出不同的生物活性。其中，R-烯唑醇具有較高的殺菌活性，S-烯唑醇則具有較強的生長調節活性[6]。因此，以消旋體生產銷售不僅僅會增加環境的負荷，還會對環境中的生物造成一定的危害。黃粉蟲（Tenebrio molitor），又名面包蟲，是一種源自于北美洲的高蛋白昆蟲，由于其所具有的高蛋白特性[7]，目前被廣泛應用于魚類飼養和家禽養殖中。黃粉蟲還能夠作為有益微量元素的載體，將無機微量元素轉化為有機微量元素以便于微量元素被人體吸收[8]，其已經作為食品的原材料進行生產。此外，昆蟲能夠通過腸道和皮膚等暴露途徑攝取農藥，成為農藥在食物鏈中富集和擴散的媒介。因此，以昆蟲中的黃粉蟲作為手性農藥烯唑醇的靶標生物，測定其體內的手性農藥殘留具有十分重要的意義。

圖 1 S--烯唑醇和R-烯唑醇的分子結構Fig.1 Structures (absolute configurations) of S- and R-diniconazole

目前，國內外有關烯唑醇手性分離測定的研究主要集中在水果和環境介質方面，而對于它們在昆蟲體中的分離檢測方法報道較少，有關高效液相色譜串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）分離檢測黃粉蟲體中的烯唑醇方法的文獻報道更少。文獻報道的烯唑醇殘留的檢測方法主要有氣相色譜法[9-11]、高效液相色譜法[11-12]、氣相色譜-質譜聯用法[13]和液相色譜-質譜聯用法[14]等，其中對于烯唑醇手性分離的測定方法主要以液相色譜為主[15-20]，而HPLC-MS-MS具有靈敏度高和精確度高等優點在本實驗中被選為烯唑醇殘留分離測定的方法。

本實驗以黃粉蟲作為昆蟲代表，對其體中烯唑醇的殘留提取、凈化和分析方法等方面進行研究，采用固相萃取高效液相色譜串聯質譜法，對黃粉蟲中的烯唑醇進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黃粉蟲（經檢測體內無烯唑醇殘留）采自北京昌平郊區農場。

烯唑醇消旋體標準品（純度＞95%） 中國農業部農藥檢定所；甲醇、乙腈（均為色譜純），甲酸、正己烷、丙酮（均為分析純）、無水硫酸鈉 北京化工廠；蒸餾水 屈臣氏中國有限公司。

ACQUITY超高效液相色譜儀、Quattro Premier XE質譜儀（配有電噴霧離子源） 美國Waters公司；DS-200型高速組織搗碎機 江蘇省江陰市周莊科研器械廠；KQ-500B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；RJ-TDL-40B低速臺式大容量離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司；恒溫水浴旋轉蒸發器 上海申生科技有限公司；佛羅里硅土固相萃取柱（1 g） 北京Dikma公司；0.22 μm混合纖維樹脂微孔濾膜。

1.2 方法

1.2.1 儲備溶液和標準溶液的配制

精確稱取100 mg烯唑醇標準品于100 mL的容量瓶中，用甲醇定容，配制1 000 mg/L的儲備溶液。使用前再用甲醇稀釋配制成標準溶液。

1.2.2 樣品的制備

1.2.2.1 樣品的提取

將黃粉蟲用組織搗碎機搗碎均勻后，稱取試樣1g放入50 mL的離心管中將加標后的黃粉蟲樣品靜置30 min后，加入10 mL乙腈，超聲10 min后以3 000 r/min的速率離心5 min，將上層清液轉移至分液漏斗中（下層殘渣重復以上步驟提取3次，合并提取液）。

1.2.2.2 凈化

在分液漏斗中加入3×10 mL正己烷對提取液進行液液分配除脂，棄去上層正己烷，下層乙腈過無水硫酸鈉柱（無水硫酸鈉柱：將4.0 g無水硫酸鈉填充于10 mL的小柱內）收集于圓底燒瓶中，35 ℃水浴旋轉蒸干。蒸干所得殘渣用3×1 mL丙酮-正己烷（1∶20，V/V）的混合溶劑溶解后過弗羅里硅土固相萃取柱。佛羅里硅土固相萃取柱使用前用丙酮和正己烷活化，并用丙酮-正己烷（1∶20，V/V）的混合溶劑調整。上樣后，用10 mL丙酮-正己烷（1∶20，V/V）淋洗去雜。最后，弗羅里硅土柱用4 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）的混合溶劑洗脫，收集洗脫液于圓底燒瓶中，35 ℃水浴旋轉蒸干。蒸干殘渣用1.0 mL乙腈定容，過0.22 μm濾膜后，待測。

1.2.3 色譜條件

Chiralcel OD-3R手性色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動相：0.05%甲酸溶液-乙腈（40∶60，V/V）；流速：0.25 mL/min；進樣量：5μL；柱溫：30 ℃；外標法定量。

1.2.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度：120 ℃；毛細管電壓：1.7kV；錐孔氣（氮氣）流量：50L/h；錐孔電壓：30 V；去溶劑氣（氮氣）流量：600 L/h；去溶劑溫度：350 ℃；母離子m/z 326.1，定量離子m/z 69.8，定性離子m/z 159.1；監測離子及碰撞能量：m/z 326.13＞69.82（24 eV），m/z 326.13＞159.13（36 eV）。

2 結果與分析

2.1 樣品制備條件的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇

烯唑醇微溶于水，易溶于甲醇、丙酮、乙腈和乙酸乙酯等有機溶劑。常用提取溶劑為丙酮、甲醇和乙腈，通過研究對比發現，甲醇和乙腈的提取效率均高于丙酮（表1），但甲醇較乙腈提取液中的雜質比較多（圖2），影響后續凈化，這是由于烯唑醇同丙酮、乙腈和甲醇均有較好的互溶性，但甲醇還會將黃粉蟲中部分有機物雜質溶出，因此實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

表1 黃粉蟲中烯唑醇在不同提取溶劑下的回收率Table1 Recovery rates of diniconazole in Tenebrio moliittoorr wiitthh different extraction solvents

圖2 乙腈（A）和甲醇（B）提取溶劑烯唑醇的加標回收實驗Fig.2 Chromatographic separation of diniconazole in spiked samples using different extraction solvents

2.1.2 凈化條件的選擇

由于黃粉蟲含有脂肪，在凈化的過程中需加入一定量的正己烷進行液-液分配萃取，考察不同的正己烷加入量及萃取次數對后續藥物提取的影響后發現，采用10 mL正己烷萃取3次效果最好。黃粉蟲樣品中含有大量有機物雜質，實驗研究對比3種固相萃取柱——弗羅里硅土、中性氧化鋁和PC/NH2在正相模式下的凈化效果，結果如表2所示。中性氧化鋁需要極性較強的混合溶劑才能將全部烯唑醇洗脫下來，相比較而言，弗羅里硅土需要的混合溶劑極性較小，而PC/NH2對藥品的保留效果較強，即使使用純丙酮作為洗脫溶劑，仍然洗脫不完全。因此，選擇弗羅里硅土固相萃取柱最佳，其所需上樣液的體積和極性都較小，在保證烯唑醇能被最大程度洗脫下來的同時可減少其他雜質的干擾。

表2 不同固相萃取柱中的烯唑醇回收率Table2 Recovery rates of diniconazole with different solid phase extraction columns

2.2 固相萃取條件的優化

2.2.1 上樣液的選擇

文獻[21]報道用丙酮-正己烷（1∶9，V/V）的混合溶劑作為三唑類農藥戊唑醇的上樣溶液，本實驗發現丙酮與正己烷體積比1∶9的上樣液會將部分烯唑醇直接洗脫下來，影響回收率。由于純正己烷的極性較小，不能夠將烯唑醇完全溶解在上樣液中，故上樣液選擇丙酮-正己烷（1∶20，V/V）混合溶劑為最佳。

2.2.2 淋洗液的選擇

實驗對比丙酮-正己烷（1∶20，V/V）分別為5、10、15 mL及10 mL純正己烷溶劑淋洗固相柱的去雜效果。發現使用10 mL極性較小的純正己烷或者體積較大的混合溶劑進行淋洗，會造成烯唑醇的損失，平均回收率僅為77.2%；使用體積較小的混合溶劑淋洗時，平均回收率也僅為85.7%，同時會造成雜質峰的嚴重干擾。最終選擇10 mL的丙酮-正己烷（1∶20，V/V）混合溶劑進行洗脫，保證了去雜效果和回收率。

2.2.3 洗脫液的選擇

本實驗采用丙酮-正己烷（1∶1，V/V）的混合溶劑進行洗脫，對比了分別用混合溶劑10 mL一次性洗脫和4 mL/次分2次洗脫的洗脫效果。發現用10 mL混合溶劑進行洗脫后的峰受雜質峰影響較大，用4 mL混合溶劑第1次洗脫時即可將烯唑醇完全洗脫下來，第2次洗脫后只有雜質峰出現。最終，本實驗采用4 mL丙酮-正己烷（1∶1，V/V）混合溶劑進行洗脫，標樣洗脫色譜圖見圖3。

圖3 烯唑醇標樣的色譜分離圖Fig.3 Chromatographic separation of diniconazole in standard sample

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 色譜柱的選擇

本實驗對比2種色譜柱：C h i r a l O D-3R[cellulose tris-（3,5-dimethylphenyl-carbamate）（4.6 m m×2 5 0 m m，5 μ m）和C h i r a l PA KIC[cellulose tris-（3,5-dichlorophenyl-carbamate）]（4.6 mm×150 mm，3 μm），按照1.2.3、1.2.4節的色譜、質譜條件測定1 ?g/mL的烯唑醇的標準溶液，根據圖4所示的分離效果，選擇ChiralOD-3R手性色譜柱為實驗所用。

圖4 ChiralPAK-IICC柱（A）和Chiral OD--33RR柱（B）對烯唑醇分離的色譜圖Fig.4 Chromatograms of diniconazole on two different columns

2.3.2 流動相的選擇

首先，實驗對比了乙腈和水在流動相中的比例。結果發現，乙腈比例過小會導致烯唑醇的保留時間會過長而影響實驗時間；乙腈比例過大時會使烯唑醇的保留時間變短而不利于目標峰與其他雜質峰的分離；故選擇水-乙腈（60∶40，V/V）作為流動相，分離效果十分理想。其次，實驗選用水和不同比例的甲酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%）與乙腈配比作為流動相進行比較以提高信號響應。結果表明，加入甲酸的流動相洗脫烯唑醇后的響應值均高于純水和乙腈組成的流動相洗脫的響應值；當甲酸的加入量提高后，洗脫烯唑醇后的信號響應值反而受到降低，因而選擇0.05%的甲酸溶液和乙腈作為流動相。

2.3.3 質譜參數的優化

色譜峰在流速0.25 mL/min、柱溫30 ℃時峰形和分離度最好。用Optimizer優化軟件對烯唑醇的質譜參數進行優化，選擇監測離子及碰撞能量分別為m/z 326.13＞69.82（24 eV），m/z 326.13＞159.13（36 eV）。在確定了母離子和子離子的基礎上，對毛細管電壓和錐孔電壓進行了優化，分別為1.7 kV和35 V。

2.4 線性范圍和檢出限

將烯唑醇標準儲備液稀釋為0.005～2.00 mg/L 5個質量濃度，在選定的色譜條件下依次測定，峰面積（y）與相應的質量濃度（x）呈正比，進行線性回歸得S-烯唑醇和R-烯唑醇的方程分別為：y=865 832x－808.419（R2=0.999 7）；y=869 478x－320.249（R2=0.999 9）。以信噪比為3作為檢出限的判斷標準，檢出限為0.002 mg/kg。

2.5 方法精密度和添加回收率

表3 黃粉蟲中烯唑醇的平均回收率和相對標準偏差（n==66）Table3 Average recovery rates and relative standard deviations of diniconazolee iinn Tenebrio moliittoorr (nn == 66))

在優化的實驗條件下，在空白黃粉蟲樣品中分別添加烯唑醇的標準溶液，使黃粉蟲樣品中的的質量濃度分別達到0.01、0.1、2.0 mg/kg，每個添加量平行測定6次，回收率及精密度實驗結果見表3。樣品在3個添加水平的烯唑醇平均回收率為97.22%～101.31%，相對標準偏差小于3%，具有良好的精密度。

2.6 實際樣品的測定

空白黃粉蟲中，未檢測到烯唑醇。對投喂2.0 mg/kg烯唑醇的黃粉蟲進行了檢測。分別取投喂0.375、1、2、7 d的黃粉蟲1.0g，檢測其體中的烯唑醇含量在0.019～0.062 mg/kg之間，檢測靈敏度高，方法適用度好。

3 結 論

本實驗采用固相萃取-高效液相色譜串聯質譜法在實驗室條件下對黃粉蟲中的手性農藥烯唑醇進行測定，方法操作簡單、快速，具有分離效果好，靈敏度高、準確性、重復性好等特點。適合推廣用于黃粉蟲等昆蟲體內手性農藥烯唑醇含量的測定。

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Determination of Chiral Diniconazole in Tenebrio molitor by Solid Phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIU Chen1,2, ZHU Wen-xue1, QU Hao-yang1, LI Jian-zhong2, WANG Hui-li2, GUO Bao-yuan1,2,*
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China; 2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China)

A method for analysis of chiral diniconazole in Tenebrio molitor using solid phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-HPLC-MS-MS) was developed. Sample purification and HPLC-MS-MS conditions were optimized. Acetonitrile extracts of samples were degreased with acetonitrile by liquid-liquid partition and cleaned up using a Florisil solid phase extraction cartridge before analysis by HPLC-MS-MS in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. The limit of detection of this method was found to be 0.002 mg/kg. The recoveries were in the range of 97.22% to 101.31%, with RSD less than 3%. This method has the advantages of easy operation, good separation, high sensitivity and precision. It is suitable to determine diniconazole residues in Tenebrio molitor and other insects.

diniconazole; Tenebrio molitor; chiral; solid phase extraction (SPE); high-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS)

TQ455.4

A

1002-6630（2014）02-0154-04

10.7506/spkx1002-6630-201402028

2013-04-08

國家自然科學基金面上項目（21277163）；中國科學院重要方向性項目（KZCX2-YW-JS403）

劉琛（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：leinali@foxmail.com

*通信作者：郭寶元（1976—），男，副研究員，博士，研究方向為環境分析化學。E-mail：guoby@rcees.ac.cn