固相微萃取和同時蒸餾萃取法分析海南香草蘭揮發性成分

董智哲，谷風林，徐 飛，王慶煌,*

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；3.農業部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室，海南 萬寧 571533）

固相微萃取和同時蒸餾萃取法分析海南香草蘭揮發性成分

董智哲1,2，谷風林2,3，徐 飛2,3，王慶煌2,3,*

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；3.農業部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室，海南 萬寧 571533）

對固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）技術萃取香草蘭中揮發性成分的萃取條件進行優化，并采用SPME和同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）兩種方法對海南地區香草蘭豆莢中揮發性成分進行檢測分析。結果表明：SPME最優萃取條件為萃取頭75 μm CAR/PDMS、萃取溫度80 ℃以及萃取時間20 min。2種萃取方法共檢測出105種揮發性成分，其中利用SPME技術檢測出揮發性成分73種，SDE 檢測出78種。結果表明：將SPME和SDE兩種方法聯合使用可以更加全面地檢測出香草蘭中的揮發性成分。

香草蘭；固相微萃取；同時蒸餾萃取；優化

香草蘭原產于墨西哥，是著名的熱帶蘭科植物，素有“食品香料之王”的美譽。20世紀60年代，我國從斯里蘭卡引種試種香草蘭成功，開始了對香草蘭種植、病蟲害以及加工生產的研究，經過多年不懈努力，我國海南地區香草蘭已經進入產業化生產階段[1]。目前香草蘭已作為一種高級香料廣泛用于飲料、糖果、奶制品等食品工業，在化妝品行業中也有廣泛的應用[2]。

目前，馬達加斯加、烏干達、桑坦尼亞、波旁、印度尼西亞等地區香草蘭香氣成分已被許多國外學者分析[3-5]，從其分析結果可看出香草蘭中香氣成分及含量隨著豆莢種植地區不同而有所差異。除產地影響其香氣外，加工方法同樣對香草蘭香氣成分有著重要的影響。然而目前中國海南地區香草蘭香氣成分暫不明確。

揮發性成分提取分析方法較多，提取分析方法適當與否直接影響最終結果。Brunschwig等[4]的實驗結果表明在香草蘭揮發性成分鑒定方法中，同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）明顯優于乙醇萃取和超聲波輔助萃取法。Perez-Silva等[5]的實驗結果表明用溶劑提取法分析香草蘭揮發性成分時，戊烷-乙醚（1∶1，V/V）混合溶劑萃取效果明顯優于乙醚、戊烷-二氯甲烷（2∶1，V/V）的萃取效果。Sostaric[6]、De Jager[7]等采用固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）分別對香草蘭豆莢和浸膏中幾種揮發性成分做了定性和定量分析，取得較好的效果。

一些學者認為SDE和SPME均存在一些優缺點，因此可以將這2種方法聯合使用、相互補充[8-9]。呂健[8]、Yu[9]以及Zheng[10]等聯合使用SDE和SPME 2種方法對食品或香精中揮發性成分進行成分分析，取得較好的效果。本實驗在優化SPME萃取條件的基礎上將其與SDE聯合使用，對采用單元式熱空氣發酵生香技術加工處理的中國海南地區香草蘭豆莢中的揮發性成分進行初步探索，為日后進一步深入研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香草蘭豆莢由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所提供（一級），采用單元式熱空氣技術發酵生香。

二氯甲烷（分析純）、C7～C30烷烴標樣 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀、5975C氣相色譜-質譜儀 美國Agilent公司；固相微萃取纖維頭（100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/ CAR/PDMS）、手動固相微萃取裝置 美國Supelco公司；同時蒸餾萃取裝置 天長市長城玻璃儀器制造廠。

1.3 方法

1.3.1 SDE

在文獻[4]的操作條件基礎上進行調整：移取50 mL重蒸二氯甲烷于100 mL圓底燒瓶中，再準確稱取30 g經粉碎機粉碎的香草蘭豆莢粉末置于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水和少許沸石，兩燒瓶接在SDE裝置的兩端。用電熱套對水溶液進行加熱，調節加熱功率使水相保持微沸。同時用水浴鍋加熱有機溶液，水浴溫度保持在60 ℃，同時蒸餾萃取2 h。萃取完成后收集有機相，加入無水硫酸鈉去除少量水分，用旋轉蒸發儀濃縮提取液至10 mL，再吹氮濃縮至1 mL，待分析。

1.3.2 SPME

準確稱取經粉碎機粉碎的香草蘭粉末2 g于15 mL固相微萃取瓶中，加蓋密封后置于指定溫度的恒溫水浴鍋中預熱20 min。將萃取頭插入固相微萃取瓶并在指定溫度下吸附特定時間。吸附結束后在氣-質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀進樣口解吸，解吸溫度250 ℃、時間8 min。通過預實驗分析，選擇50、60、70、80、90 ℃ 5個溫度梯度和10、20、30、40、50 min 5個時間梯度來優化萃取條件，通過衡量萃取能力大小的萃取量（Y）來選擇合適的萃取頭：

式中：i為第i種揮發性成分；j為第j種萃取條件；n為揮發性成分的總數；m為萃取條件的總數；Aij為第j種萃取條件下第i種揮發性成分的峰面積。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：DB-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以1.5 ℃/min的速率升溫到65 ℃，保持2 min，再以0.5 ℃/min的速率升溫到70 ℃，再以5 ℃/min的速率升溫到90 ℃，再以3 ℃/min的速率升溫到170 ℃，最后以4 ℃/min的速率升溫到290 ℃并保持2 min；載氣為He；流速1 mL/min。2種萃取方法的進樣方式均為不分流。

1.3.4 質譜條件

電子電離離子源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；掃描范圍m/z 30～300。

1.3.5 定性、定量分析

各組分經儀器配置的NIST 08譜庫進行檢索，再與文獻報道的DB-5柱的保留指數（retention index，RI）比對進行定性分析。采用峰面積歸一化法對各組分進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 SPME條件的優化

SPME條件一般包括萃取頭、吸附時間、吸附溫度[11]。根據文獻報道選擇了香草蘭中34種常見香氣成分（表1）進行優化分析[3-6,12]。

2.1.1 萃取頭的篩選

萃取頭涂層對香氣成分的吸附具有一定的選擇性，其遵循“相似相容”的原則，與氣相色譜固定相對揮發性物質的吸附原理類似[13]，因此萃取頭材料的適當與否直接影響著最終萃取效果。本實驗比較5種常用的萃取頭在70 ℃、30 min條件下的萃取效果。

Tomislav等[6]比較了PDMS、PA以及CW/DVB 3種萃取頭萃取香草蘭中揮發性成分的萃取效果，結果顯示PA萃取效果相對較好。然而從表1可以看出，復合涂層萃取頭DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS和DVB/PDMS可分別鑒定出34種常見香氣成分中的25、29種和22種，明顯于優于單一涂層PA（21種）和PDMS（14種）。這主要與涂層的極性有關，不同極性的涂層選擇吸附不同類型的化合物。香草蘭中揮發性成分具有較廣的極性范圍，而復合涂層對物質極性具有較廣的選擇性[14]，因而復合涂層能檢出更多的物質。CAR/PDMS萃取頭能測定出來的香氣成分最多，而且包含了其他4種萃取頭能檢測出來的化合物，因此選擇CAR/PDMS萃取頭進行以下實驗。

表1 5種萃取頭的萃取效果Table1 Effect of five types of extraction fibers on extraction efficiency

2.1.2 萃取時間和溫度

萃取溫度和時間直接影響吸附效果。當溫度較低時樣品揮發較慢，因而到達吸附平衡的時間較長，吸附的物質較少；而溫度較高時，有利于快速達到吸附平衡，但會使分析物在涂層與基質中的分配系數降低，解吸速率增加，降低了萃取頭吸附能力[14-15]。另外溫度太高可能會導致某些熱不穩定揮發物質的分解，影響結果的準確性。當萃取時間太短時，分析物在涂層中的吸附量較少，不利于分析物的鑒定；而萃取時間太長則影響萃取效率。因此需要尋找最優的萃取溫度和時間。

在探索最優萃取溫度和萃取時間的實驗中，通常做法是選擇幾種常見的揮發性成分，根據它們在不同萃取條件下的峰面積來判斷[11,15-16]，或是通過這些物質的總峰面積來選擇[4-5,17]。但是由于香草蘭揮發性成分十分復雜，僅僅幾種揮發性成分不具有代表性；另外由于香草蘭中香氣成分含量差別很大，某些微量的香氣成分卻對整體香氣貢獻非常大[4-5,18]，若只以對常見揮發性物質峰面積進行簡單的加和或是通過總峰面積來選擇合適的萃取條件，只能反映某些高含量揮發性物質的萃取信息。因此針對香草蘭的特殊情況，通過1.3.2節的公式對CAR/ PDMS檢測出來的29種揮發性物質的峰面積進行轉換，消除峰面積差異的影響，通過轉換后的Y值來選擇合適的萃取條件。

圖1 萃取時間和溫度對揮發性物質萃取效果的影響Fig.1 Effects of extraction time and temperature on extraction efficiency

從圖1可看出，在溫度相對較低時（50、60 ℃），Y值隨著萃取時間的延長而增加，其中在60 ℃條件下、吸附40 min以后Y值增長幅度較小，趨于穩定。而在溫度相對較高時（70、80 ℃和90 ℃），Y值隨著萃取時間的延長而呈現先增加后減少的趨勢，分別在30、20、20 min達到峰值。

表2 SDE和SPME檢測香草蘭的揮發性成分Table2 The volatile compounds in vanilla identified by SDE and SPME

續表2

續表2

高溫條件下萃取效果隨時間延長先上升后下降原因可能有2點：一是所測物質揮發性相對較好，在萃取頭剛開始吸附時，由于溫度較高，易揮發性成分從基質中快速揮發出來，而半揮發性成分揮發較慢，頂空中易揮發性成分濃度較高，萃取頭涂層對其快速吸附，使易揮發性成分在基質、頂空和涂層中快速達到平衡；然而隨著時間的延長，半揮發性香氣成分逐漸揮發到頂空中，與易揮發性成分競爭吸附萃取涂層，導致已經吸附在涂層表面的易揮發性成分解吸，最終導致吸附量的下降。二是隨著時間延長，基質中自由水和結合水蒸發析出，使纖維頭凝結水滴，從而大大降低了纖維頭對揮發性物質的吸附[19]。因此綜合上面的分析，從萃取溫度和時間方面綜合考慮，選擇80 ℃、20 min作為最優的萃取條件進行以下實驗。

2.2 SDE和SPME檢測結果

在SPME條件優化的基礎上，將其與SDE聯合使用，對中國海南地區香草蘭揮發性香氣成分進行GC-MS分析，兩種方法檢測結果見表3。兩種方法共檢測出105種揮發性成分，其中SPME檢測出73種，同時SDE檢測出78種。

表3 SDE和SPME檢測結果的比較Table3 Comparisons of analytical results obtained for volatile compounds in vanilla by SDE and SPME

從表3可看出，SDE和SPME兩種方法對芳香族化合物萃取能力均較強，芳香族化合物的相對含量最高。

對于醛和酮類化合物，在化合物相對含量和化合物種類兩方面SPME的萃取效果均優于SDE，而對于烷烴和酯類物質則正好相反。這可能是由于不同類型化合物揮發能力和水溶性的差異造成的。由表2可知，香草蘭中醛、酮類化合物主要是一些小分子化合物，其揮發性優于分子質量相對較大烷烴和酯類化合物，因而更易被SPME萃取涂層吸附。另外，對鑒定出來的大分子烷烴和酯類化合物，由于其水溶性比醛、酮類化合物要弱，因此更易從水溶液中蒸餾出來，被SDE檢測到。

對于酸、醇以及雜環類物質，SDE萃取的化合物種類多于SPME，但其相對含量小于或接近SPME。可能是由于這類化合物沸點分布范圍比較廣，而SPME易受待測物質沸點的影響，沸點較高的酸、醇及雜環類物質難以被檢測，因此SPME鑒別化合物種類比SDE少。但是SPME對低沸點物質有更好的親和能力，同時酸、醇類物質，特別是小分子酸、醇類物質具有較強的水溶性，不易從水中蒸餾出來，因此導致SDE檢測出來的這類物質相對含量較小。

由以上分析可知，SDE和SPME兩種方法均存在一定的選擇性，SPME側重于萃取分子質量小、易揮發的物質，而同時SDE則更側重于萃取水溶較差物質，而往往一些大分子物質極性較弱、水溶性較差。因此，將兩種方法聯合使用則能相互彌補不足，取得較好的萃取效果。

2.3 香草蘭揮發性成分分析

在所有檢測出來的物質中，芳香族化合物在相對含量和數量方面均有明顯的優勢，它們對香草蘭香味貢獻最大[4-5]。在這些芳香族化合物中，香蘭素相對含量最高，是香草蘭中最主要香氣物質，它主要來源于加工過程中香草蘭內源β-糖苷酶對其糖苷的水解作用[25]。除香蘭素外，其他某些芳香族化合物含量雖然較低，但對香草蘭整體香氣貢獻較大。Perez-Silva等[5]報道墨西哥地區的香草蘭中鄰甲氧基愈創木酚、愈創木酚、香草乙酮、香草醇含量低，但其香氣強度接近于香蘭素。Dignum等[26]報道鄰甲氧基愈創木酚、愈創木酚、苯乙醇、4-甲基苯酚對香草蘭整體香氣有著非常重要的影響。Brunschwig等[4]認為茴香醛和愈創木酚是塔西提島地區香草蘭關鍵香氣成分，這些香氣成分在中國海南地區香草蘭中均能檢測到。

醛類化合物在香料香味中占有重要地位，具有令人愉快的香氣。由表3可知，醛類化合物數量僅低于芳香族化合物的數量。Brunschwig等[4]的研究表明，在香草蘭中，醛類物質主要呈現水果、巧克力以及脂肪的香味，其香氣強度也僅低于以芳香族化合物為代表的茴香味和酚香味。這些醛類物質主要來源于脂肪酸的氧化，其中以2-庚烯酸為代表的單烯醛主要來自油酸的自動氧化，而以2,4-二癸烯醛兩種異構體為代表的二烯醛則主要來自亞油酸的自動氧化[12]。

香草蘭中雜環類物質對香草蘭整體香味也有一定的貢獻。2-甲基四氫呋喃-3-酮、2-乙酰基吡咯等具有堅果類香氣，檸檬烯具有檸檬的味道，但還有些物質，如糠醛和糠醇具有苦味，對香草蘭整體香味產生不良影響。

香草蘭中某些小分子酸、酮、醇類物質呈現出黃油味或植物味，如2,3-丁二酮、3-羥基丁酮、2-甲基丁酸、異戊酸燈和1-辛烯-3-醇[4-5]。這類物質主要來源于脂肪酸的受熱氧化或耐熱細菌，如枯草芽孢桿菌的作用[12]。醇類物質中的重要香味成分2,3-丁二醇則主要來源于加工過程中某些3-羥基丁酮的轉化。酯類則主要來源于香草蘭中酸與醇的相互作用。鑒定出來的烷烴主要是大分子類物質，不易揮發，因而對香草蘭香氣貢獻不大。

3 結 論

本研究對SPME技術萃取香草蘭揮發性成分的萃取條件進行優化，得出最優條件為：萃取頭75 μm CAR/ PDMS、萃取溫度80 ℃以及萃取時間20 min。利用SPME和SDE兩種方法對中國海南地區香草蘭揮發性成分進行檢測，共檢測出來105種揮發性成分，其中利用SPME檢測揮發性成分73種，利用SDE檢測出78種，將這兩種方法聯合使用，能相互補充各自的不足，取得較好的萃取效果。

實驗對中國海南 地區香草蘭揮發性成分進行初步的鑒定分析，并給出每種物質的相對含量。但是并不能從其含量來準確判斷哪些揮發性成分對香草蘭整體香氣貢獻較大，因為有些香味物質含量低卻對整體香氣貢獻較大，此外有些香味物質在低含量時呈現香氣，但高濃度時則會表現出相反的效果。因此，在今后的研究中，有必要在本研究的基礎上利用氣相色譜-嗅辨儀聯用等先進技術，對各揮發性成分進行感官分析，確定中國海南地區香草蘭中特征香氣成分。

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Comparative Analysis of Volatile Components of Vanilla Grown in Hainan by Solid Phase Micro-Extraction
and Simultaneous Distillation Extraction

DONG Zhi-zhe1,2, GU Feng-lin2,3, XU Fei2,3, WANG Qing-huang2,3,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wanning 571533, China; 3. Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops, Ministry of Agriculture, Wanning 571533, China)

The conditions of solid phase micro-extraction (SPME) for extraction of volatile components in vanilla grown in Hainan were optimized and its effectiveness was compared with that of simultaneous distillation extraction (SDE) for the analysis of volatile components in vanilla by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS). The results showed the optimal SPME conditions were established using a 75 μm carboxen?/polydimethylsiloxane (CAR/PDMS) fiber at 80 ℃ for 20 min. A total of 105 volatile components were identified, among which, 73 volatile compounds were extracted by SDE and 78 by SPME. This study has shown that more volatile components can be extracted and identified with a combination of SP ME and SDE.

vanilla; solid phas e micro-extraction; simultaneous distillation extraction; optimization

TQ651

A

1002-6630（2014）02-0158-06

10.7506/spkx1002-6630-201402029

2013-01-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD36B03）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（1630052012017）

董智哲（1989—），男，碩士研究生，研究方向為風味化學。E-mail：372735663@qq.com

*通信作者：王慶煌（1963—），男，研究員，博士，研究方向為農產品加工及貯藏。E-mail：kjb3687@163.com