頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法分析黑茶香氣成分

李建勛，杜麗平*，王 超，李 瑋，李 桃，肖冬光

（工業發酵微生物教育部重點實驗室（天津科技大學），天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法分析黑茶香氣成分

李建勛，杜麗平*，王 超，李 瑋，李 桃，肖冬光

（工業發酵微生物教育部重點實驗室（天津科技大學），天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

利用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術分別對普洱茶、六堡茶和安化黑茶3種典型黑茶的香氣成分進行分析。結果表明：從普洱茶中鑒定出香氣成分66種，六堡茶和安化黑茶鑒定出香氣成分均為67種，其中醇類、醛類、酮類、酯類、酚類、碳氫類、含氮類、雜氧類物質含量分別占普洱茶香氣成分總含量的6.48%、4.17%、6.30%、6.09%、3.90%、10.58%、7.11%、37.24%；醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、酚類、碳氫類、含氮類、雜氧類物質分別占六堡茶香氣成分總含量的6.03%、6.60%、11.50%、0.27%、5.00%、6.00%、9. 15%、9.73%、24.69%；在安化黑茶中分別占11.26%、3.00%、13.27%、0.48%、25.63%、3.60%、14.11%、11.11%、4.86%。通過比較分析，普洱茶和六堡茶香氣成分相近，富含具有陳香香韻的甲氧基苯類物質，安化黑茶中酯類物質含量最高，表現出花果香香韻。

頂空固相微萃取；氣相色譜-質譜聯用；黑茶；香氣成分

黑茶是我國特有的茶類，屬于后發酵茶[1]，制茶工藝一般包括殺青、揉捻、渥堆和干燥4道工序。黑茶主要分布為云南、湖南、廣西、四川、湖北[2]，其中云南普洱茶、廣西六堡茶和安化黑茶每年產量與銷售很大，是黑茶中的代表。

茶葉香氣是衡量茶葉品質的重要因素之一，也是鑒別茶葉品種的主要指標[3-4]。頂空固相微萃取（headspacesolid-phase micro-extraction，HS-SPME）用于茶葉 香氣成分檢測，具有簡單、快速、靈敏度高、選擇性好的優點[5-6]。實踐證明，HS-SPME與氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）可快速分析出茶葉香氣物質的組成，已成功應用于綠茶[7-9]、烏龍茶[10-12]、紅茶[13-14]和普洱茶[15]香氣成分分析，本實驗采用HS-SPME與GC-MS分析云南普洱茶、廣西六堡茶和湖南安化黑茶3種典型黑茶的香氣成分，比較3者的異同，旨在探明不同黑茶香氣物質的組成特點，為進一步研究黑茶的品質化學提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大益普洱茶 云南勐海茶廠；安化黑茶 湖南安化茶廠；六堡茶 廣西梧州茶廠。

1.2 儀器與設備

手動固相微萃取進樣手柄、65 μm PDMS/DVB固相微萃取萃取頭 美國Supelco公司；6890A-5973C型氣-質聯用儀 美國Agilent公司；IT-09A5磁力攪拌器 上海一恒科學儀器有限公司；FA2004電子天平 上海精密科學儀器有限公司；150 mL頂空萃取瓶 天津市東科儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME

稱取4 g茶樣和3.6 g NaCl加入到150 mL頂空萃取瓶，加入12 mL沸蒸餾水，以四氟乙烯封口，70 ℃水浴平衡15 min，插入裝有65 μm PDMS/DVB萃取頭的手動進樣器，吸附60 min后，取出萃取頭插入色譜進樣口中，250 ℃解吸5 min。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%）；流速1 mL/min；升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持1 min；不分流進樣。

1.3.3 質譜條件

電子電離離子源；離子源溫度230℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280℃；電子倍增器電壓1 280 V；掃描范圍m/z 40～450。

1.3.4 數據處理

采集到的質譜圖與NIST 08標準譜庫對照，并結合相關文獻[16-21]比對，對化合物進行定性。采用峰面積歸一化法計算各化學成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 黑茶茶葉揮發性香氣成分鑒定

3種黑茶樣品經SPME萃取、GC-MS分析得到總離子流色譜圖見圖1。

圖1 普洱茶（A）、六堡茶（B）和安化黑茶（C）的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of Pu-erh tea (A), Liubao tea (B) and Anhua dark tea (C)

表1 普洱茶、六堡茶和安化黑茶的成分鑒定表Table1 Chemical constituents of Pu-erh tea, Liubao tea and Anhua dark tea

續表1

續表1

3種樣品中分離鑒定出的香氣成分結果見表1。3種黑茶共分離鑒定出97種香氣化合物，初步定性的有81種，其中包括11種醇類、12種醛類、15種酮類、1種酸類、7種酯類、5種酚類、16種碳氫類、3種含氮類和11種雜氧類。

普洱茶初步定性化合物共有66種，占色譜流出組分總量的81.87%，相對含量排在前10位的是1,2,3-三甲氧基苯（16.19%）、1,2,4-三甲氧基苯（15.10%）、咖啡因（7.06%）、二氫獼猴桃內酯（2.91%）、2,6,10,14-四甲基-十五烷（2.09%）、1,2,3,4-四甲氧基苯（2.01%）、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇（1.72%）、苯甲酮（1.50%）、β-紫羅蘭酮（1.46%）和十六烷（1.42%）。

六堡茶共有67種化合物被初步定性，占色譜流出組分總量的78.97%，相對含量排在前10位的是咖啡因（9.67%）、1,2,3-三甲氧基苯（9.01%）、1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯（7.41%）、β-紫羅蘭酮（4.30%）、二氫獼猴桃內酯（3.86%）、3,4,5-三甲氧基-苯甲醛（3.66%）、2,3,4-三甲氧基苯酚（2.55%）、1,2,3,4-四甲氧基苯（2.02%）、3,4-二甲氧基甲苯（1.93%）和香葉基丙酮（1.83%）。

安化黑茶初步定性化合物共有67種，占色譜流出組分總量的87.32%，相對含量排在前10位的是順丁烯二酸二丁酯（17.87%）、咖啡因（10.40%）、β-紫羅蘭酮（5.33%）、二氫獼猴桃內酯（3.48%）、2,6,10,14-四甲基-十五烷（2.79%）、水楊酸甲酯（2.79%）、香葉基丙酮（2.60%）、十六烷（2.50%）、芳樟醇（2.27%）和雪松醇（2.12%）。

2.2 黑茶茶樣的揮發性成分比較

將普洱茶、六堡茶和安化黑茶的揮發性成分按照不同種類化合物進行比較，結果表明3種黑茶存在明顯的差異。

普洱茶、六堡茶和安化黑茶的醇類化合物相對含量分別為6.48%、6.03%和11.26%。普洱茶和六堡茶中醇類含量最高的都是2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇，它和芳樟醇氧化物Ⅱ、α-松油醇、芳樟醇氧化物Ⅰ和芳樟醇一起構成了兩茶樣醇類物質的主體，安化黑茶醇類物質以芳樟醇、雪松醇、香葉醇和芳樟醇氧化物Ⅱ為主。

普洱茶和安化黑茶的醛類化合物相對含量分別為4.17%和3.00%，低于六堡茶的6.60%。六堡茶醛類化合物以3,4,5-三甲氧基-苯甲醛、2-丁基-2-辛烯醛、β-環檸檬醛、（E）-2-壬烯醛和臧花醛為主，其中3,4,5-三甲氧基-苯甲醛相對含量為3.66%，明顯高于普洱茶的1.19%，而安化黑茶中未檢測出3,4,5-三甲氧基-苯甲醛；在普洱茶中檢測到了六堡茶和安化黑茶未檢測到的壬醛。

六堡茶和安化黑茶的酮類化合物相對含量較高，分別達11.5%和13.27%，高于普洱茶的6.30%。其中β-紫羅蘭酮在六堡茶和安化黑茶中的相對含量分別為4.30%和5.33%，高于普洱茶的1.46%；在這兩茶樣中還檢測到了普洱茶中未檢測到的2,6-二叔丁基-鄰苯醌、6-甲基-5-庚烯-2-酮和2,5-二甲基二苯甲酮；二氫-β-紫羅蘭酮僅在普洱茶中檢測出。

在六堡茶和安化黑茶中均檢測到的1種酸類化合物，即壬酸，相對含量分別為0.27%和0.48%，普洱茶中未檢測到任何酸類物質。

普洱茶和六堡茶的酯類化合物相對含量分別為6.09%和5.00%，低于安化黑茶的25.63%。安化黑茶中順丁烯二酸二丁酯含量最高，相對含量為17.87%，遠高于普洱茶的0.61%，在六堡茶中未檢測到順丁烯二酸二丁酯；二氫獼猴桃內酯和水楊酸甲酯在安化黑茶中含量也較高，相對含量分別為3.48%和2.79%；其中順丁烯二酸二丁酯具有淡淡的花果香香氣；二氫獼猴桃內酯具有濃郁的果香氣息[22]。

普洱茶、六堡茶和安化黑茶的酚類化合物相對含量分別為3.90%、6.00%和3.60%。其中，六堡茶中的2,3,4-三甲氧基苯酚相對含量為2.55%，是含量最高的酚類化合物；3-甲基苯酚是六堡茶獨有的酚類化合物。

安化黑茶的碳氫化合物相對含量為14.11%，高于普洱茶和六堡茶的10.58%、9.15%。其中相對含量較高的碳氫化合物有2,6,10,14-四甲基-十五烷、十六烷和十七烷等；檸檬烯是安化黑茶所特有的碳氫化合物；在六堡茶中未檢測到普洱茶和安化黑茶中具有木香香韻的β-愈創木烯；2-乙烯基萘只在六堡茶中檢測出。

普洱茶、六堡茶和安化黑茶的含氮化合物相對含量分別為7.11%、9.72%和11.11%。其中3種茶中均可檢測到咖啡因和N-乙基琥珀酰亞胺2種含氮化合物，并且咖啡因含量比較高；除此之外，在安華黑茶還檢測出2,3,5,6-四甲基吡嗪，而普洱茶和六堡茶中未檢測到。

普洱茶和六堡茶的雜氧化合物相對含量分別為37.24%和24.69%，遠遠高于安化黑茶的4.86%，是3種茶中含量差異最明顯的1類化合物。這是由于普洱茶中1,2,3-三甲氧基苯和1,2,4-三甲氧基苯2種化合物的相對含量接近其香氣總含量的三分之一，六堡茶中1,2,3-三甲氧基苯和1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯相對含量也分別高達9.01%和7.41%，而安化黑茶中除了1,2,3-三甲氧基苯外，其余甲氧基苯類化合物相對含量都不足1%。這些甲氧基苯類化合物賦予黑茶典型的霉味和陳香，是黑茶沉香甘醇的主要原因[23]，在不發酵綠茶和全發酵紅茶中未檢測到甲氧基苯類化合物[24]，故甲氧基苯類化合物是黑茶特有的香氣成分。

圖2 普洱茶、六堡茶和安化黑茶香氣組分對比圖Fig.2 Comparison of aroma constituents among Pu-erh tea, Liubao tea and Anhua dark tea

由表1和圖2可知，不同種類化合物在3種黑茶樣品中的相對含量差異十分明顯。對3種黑茶揮發性成分按照不同種類化合物進行比較，普洱茶中醇類、醛類、酮類、酯類、酚類、碳氫類、含氮類、雜氧類物質含量分別占色譜流出組分總量的6.48%、4.17%、6.30%、6.09%、3.90%、10.58%、7.11%、37.24%；醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、酚類、碳氫類、含氮類、雜氧類物質含量在六堡茶中分別占色譜流出組分總量的6.03%、6.60%、11.50%、0.27%、5.00%、6.00%、9.15%、9.73%、24.69%，在安化黑茶中分別占11.26%、3.00%、13.27%、0.48%、25.63%、3.60%、14.11%、11.11%、4.86%；普洱茶和六堡茶中以甲氧基苯類化合物為代表的雜氧化合物含量最高，而安化黑茶酯類化合物含量最高。

3 結 論

采用SPME結合GC-MS對普洱茶、六堡茶和安化黑茶3種典型黑茶的香氣成分進行了分析。3種黑茶共分離出97種香氣成分，初步定性的共81種，其中普洱茶66種、六堡茶67種、安化黑茶67種。對香氣成分分析結果表明，普洱茶和六堡茶香氣成分比較接近，甲氧基苯類化合物含量較高，分別為37.24%和24.69%，甲氧基苯類化合物表現出陳香風味，另外這2種茶中碳氫類物質與含氮類物質的含量也比較高；安化黑茶與普洱茶和六堡茶的香氣具有明顯差異，安化黑茶中酯類物質含量比較高，為25.63%，此外碳氫類、酮類、醇類、含氮類物質在安化黑茶中含量都相對比較高，該茶具有典型的花果香味；另外，3種茶中二氫獼猴桃內酯和β-紫羅蘭酮的相對含量均排在前10位，其中二氫獼猴桃內酯具有強烈的果香香氣，β-紫羅蘭酮則賦予黑茶木香香味。

茶葉的香氣與茶樹品種、自然環境與栽培條件、加工工藝和外源誘導等多種因素有關[25]，本研究對3種黑茶的香氣成分進行了初步研究，有必要對影響黑茶香氣的各種因素進行進一步研究，并結合氣相色譜-嗅覺測量法對黑茶香氣成分進行分析研究，為提高黑茶產品質量和規范黑茶加工工藝提供依據。

[1] 楊崇仁, 陳可可, 張穎君. 茶葉的分類與普洱茶的定義[J]. 茶葉科學技術, 2006, 36(2): 37-38.

[2] 楊新河, 王麗麗, 黃建安, 等. 傅里葉變化紅外光譜鑒別黑茶樣品[J].食品科學, 2012, 33(14): 203-205.

[3] 竇宏亮, 李春美, 喬宇, 等. 炒青綠茶香氣成分的GC-MS分析[J]. 食品科學, 2007, 28(5): 258-261.

[4] 劉曉慧, 張麗霞, 王日為, 等. 頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法分析黃茶香氣成分[J]. 食品科學, 2010, 31(16): 239-243.

[5] PONTES M, MARQUES J C, CAMARA J S. Screening of volatile composition from Portuguese multifloral honeys using headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-quadrupole mass spectrometry[J]. Talanta, 2007, 74(1): 91-103.

[6] DU L P, WANG C, LI J X. Optimization of headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry for detecting methoxyphenolic compounds in Pu-erh tea[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(3): 561-568.

[7] 孔維婷, 劉建軍, 司輝清. 固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用分析信陽毛尖香氣成分[J]. 食品科學, 2012, 33(12): 185-189.

[8] BAPTISTA J A B, TAVARES F P, CARVALHO C B. Comparison of catechins and aromas among different green teas using HPLC/SPMEGC[J]. Food Research International, 1998, 31(10): 729-736.

[9] YE Nengsheng, ZHANG Liqin, GU Xuexin. Discrimination of green teas from different geographical origins by using HS-SPME/GC–MS and pattern recognition methods[J]. Food Analytical Methods, 2012, 5(4): 856-860.

[10] 鐘秋生, 呂海鵬, 林智, 等. 東方美人茶和鐵觀音香氣成分的比較研究[J]. 食品科學, 2009, 30(8): 182-186.

[11] LIN Jie, DAI Yi, GUO Yanan, et al. Volatile profile analysis and quality prediction of Longjing tea (Camellia sinensis) by HS-SPME/GC-MS[J]. Journal of Zhejiang University: Science B, 2012, 13(12): 972-980.

[12] LIN Jie, ZHANG Pan, PAN Zhiqiang, et al. Discrimination of oolong tea (Camellia sinensis) varieties based on feature extraction and selection from aromatic profiles analysed by HS-SPME/GC-MS[J]. Food Chemistry, 2013, 141(1): 259-265.

[13] 王秋霜, 陳棟, 許勇泉, 等. 廣東紅茶香氣成分的比較研究[J]. 茶葉科學, 2012, 32(1): 9-16.

[14] VINAS P, CAMPILLO N, AGUINAGA N, et al. Use of headspace solid-phase microextraction coupled to liquid chromatography for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in tea infusions[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1164(1): 10-17.

[15] 盧紅, 李慶龍, 王明凡, 等. 陳化普洱茶與原料綠茶的揮發性成分比較分析[J]. 西南農業大學學報, 2006, 28(5): 820-824.

[16] 侯冬巖, 回瑞華, 李鐵純, 等. 黑茶揮發性化學成分的研究[J]. 茶葉科學, 2008, 29(8): 550-552.

[17] RAWAT R, GULATI A. Characterization of volatile components of Kangra orthodox black tea by gas chromatography-mass spectrometry[J]. Food Chemistry, 2007, 105(1): 229-235.

[18] 張文彥, 朱春華, 周紅杰, 等. 普洱生茶在貯藏過程中香氣成分的變化[J]. 食品科學, 2010, 31(12): 153-155.

[19] 黃亞輝, 王娟, 曾貞, 等. 不同年代茯磚茶香氣物質測定與分析[J].食品科學, 2011, 32(24): 261-265.

[20] 呂才有, 單治國, 劉勤晉, 等. 普洱茶后發酵中的香氣成分變化分析[J].食品科學, 2009, 30(10): 252-256.

[21] Lü Haipeng, ZHONG Qiusheng, LIN Zhi, et al. Aroma characterisation of Pu-erh tea using headspace-solid phase microextraction combined with GC/MS and GC-olfactometry[J]. Food Chemistry, 2012, 130(4): 1074-1081.

[22] 楊志忠, 韋鳳杰, 程向紅, 等. 不同降解方法下β-胡蘿卜素降解產物的分析[J]. 農學學報, 2011, 15(11): 13-17.

[23] 曹艷妮, 劉通訊. 普洱生茶和熟茶香氣中萜烯類和甲氧基苯類成分分析[J]. 食品工業科技, 2012, 33(5): 128-133.

[24] WANG Lifei, LEE J Y, CHUNG J O, et al. Discrimination of teas with different degrees of fermentation by SPME-GC analysis of the characteristic volatile flavour compounds[J]. Food Chemistry, 2008, 109(1): 196-206.

[25] 王力, 林智, 呂海鵬, 等. 茶葉香氣影響因子的研究進展[J]. 食品科學, 2010, 31(15): 293-298.

Analysis of Aroma Compounds in Dark Teas by Head Space-Solid Phase Micro-Extraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LI Jian-xun, DU Li-ping*, WANG Chao, LI Wei, LI Tao, XIAO Dong-guang
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology (Tianjin University of Science and Technology), Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The aroma components in Pu-erh tea, Liubao tea and Anhua dark tea were analyzed using headspace-solid-phase micro-extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). The results showed that 66 aroma components were identified in Pu-erh tea, including alcohols, aldehydes, ketones, esters, phenolic compounds, hydrocarbons, nitrogenous compounds and heterocyclic oxygen compounds, which accounted for 6.48%, 4.17%, 6.30%, 6.09%, 3.90%, 10.58%, 7.11%, and 37.24% of the total amount of aroma compounds, respectively; and 67 in Liubao tea and Anhua dark tea, resp ectively. The content s of alcohols, aldehydes, ketones, acids, esters, phenolic compounds, hydrocarbons, nitrogenous compounds and heterocyclic oxygen compounds in relation to the total amount of the aroma compounds identified in Liubao tea were 6.03%, 6.60%, 11.50%, 0.27%, 5.00%, 6.00%, 9.15%, 9.73%, and 24.69% whereas in Anh ua dark tea they were 11.26%, 3.00%, 13.27%, 0.48%, 25.63%, 3.60%, 14.11%, 11.11%, and 4.86%, respectively. In comparison, the aroma characteristics of Pu-erh tea and Liubao tea were similar, both being rich in methoxybenzene compounds, which was responsible for the stale flavor. Esters were the most abundant aroma compounds in Anhua dark tea, which contributed to the floral and fruity aroma.

headspace-solid-phase micro-extraction (HS-SPME)；gas chromatograph-mass spectrometry (GC-MS)；dark tea；aroma components

TS272

A

1002-6630（2014）02-0191-05

10.7506/spkx1002-6630-201402036

2013-03-03

教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”項目（IRT1166）

李建勛（1987—），男，碩士研究生，研究方向為生物分離工程。E-mail：lijianxun12345@126.com

*通信作者：杜麗平（1967—），女，副教授，博士，研究方向為發酵工程與分離工程。E-mail：dlp123@tust.edu.cn