酶水解-離子色譜法測定乳粉中多聚果糖含量

白 靖，姜金斗*，陶大利

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江 哈爾濱 150090）

酶水解-離子色譜法測定乳粉中多聚果糖含量

白 靖1，姜金斗2,*，陶大利2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江 哈爾濱 150090）

建立果糖酶水解、離子色譜法測定乳粉中多聚果糖的方法。在醋酸緩沖溶液條件下加入果聚酶與葡聚酶，60 ℃水浴1 h，使多聚果糖與麥芽糊精全部分解為葡萄糖與果糖，然后用離子色譜-電化學檢測器分別測定酶解前后樣品中果糖及蔗糖的含量，從而計算多聚果糖的含量。色譜條件為：色譜柱PA-1（250 mm×4 mm，4.6 μm），梯度洗脫，流速0.8 mL/min；標準曲線回歸方程為y=0.348 8＋3.694 0x，r=0.999 9（果糖）；y=0.174 8＋4.350 4x，r=0.999 7（蔗糖）。樣品平均回收率為97.4%，相對標準偏差為3.56%。果糖和蔗糖的定量限分別為1.3、1.2 ng/mL。該方法具有樣品處理簡便、靈敏度高、重復性好等優(yōu)點，可以用于調(diào)制乳粉及嬰幼兒配方乳粉中多聚果糖含量的測定。

乳粉；果聚酶；多聚果糖；離子色譜

多聚果糖是從菊苣根中提取的、具有保健功能的低聚糖，由α-果糖以β-1,2糖甙鍵連接，在其末端接一個葡萄糖殘基而形成的，分子式為（C6H12O6）-（C6H10O5）n（n=2～60），平均聚合度（average degree of polymerization）≥23，相對分子質(zhì)量344～11 400。多聚果糖是一種優(yōu)良的水溶性膳食纖維，可以預防便秘與結腸癌、降低血液膽固醇、穩(wěn)定血糖水平；同時還是一種很好的“益生元”，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增殖雙歧桿菌、促進鈣的吸收、促進免疫調(diào)節(jié)、抗齲齒等保健功能，可減少肝臟毒素，能在腸中生成抗癌的有機酸，有顯著的防癌功能[1]。多聚果糖被譽為抗生素時代后最具潛力的新一代添加劑——促生物質(zhì)，在法國被稱為原生素（hormone maternelle）。我國GB 14880—2012《食品營養(yǎng)強化劑使用標準》[2]中規(guī)定嬰幼兒配方食品、嬰幼兒谷類輔助食品、兒童及孕產(chǎn)婦乳粉中多聚果糖的用量不超過64.5 g/kg。

多聚果糖的測定方法文獻報道較少，主要測定方法有液相色譜法、離子色譜法、分光光度法、酶聯(lián)免疫試劑盒法等[3-27]。由于嬰幼兒乳粉及調(diào)制乳粉中碳水化合物主要含有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及麥芽糊精等，成分復雜，碳水化合物總含量大都在50%以上，而強化的多聚果糖含量一般僅為0.5%～2.0%，甚至不足0.1%，采用色譜法測定多聚果糖其干擾物質(zhì)較多，且能測定聚合度為2～4的低聚果糖部分[4,6,11-18]；酶聯(lián)免疫法通過測定樣品酶解前后果糖與蔗糖含量，進而計算得出多聚果糖含量，因試劑盒的穩(wěn)定性、準確性等原因，其結果的準確性與重復性不甚理想；美國AOAC標準[6-7]中制定的總果聚糖離子色譜法與分光光度法使用β-淀粉酶、普魯蘭酶、麥芽糖酶、外切菊粉酶、內(nèi)切菊粉酶等多種酶酶解后測定，操作步驟復雜、結果重復性差；多聚果糖本身成分復雜，主要是由聚合度為2～60的果聚糖組成，其中低聚果糖（聚合度為2～8）可溶于乙醇，而更高聚合度的果聚糖則屬于不溶于乙醇，因此乙醇提取并沉淀蛋白方式也不適用于乳粉類樣品中多聚果糖的測定，多聚果糖只能采用果聚酶水解的間接方法測定。

本實驗建立的方法經(jīng)果聚酶水解、離子色譜-電化學檢測器測定酶解前后果糖與蔗糖的含量，計算樣品中多聚果糖（含低聚果糖）的含量，操作簡單、重復性和準確性好、成本低，可以滿足乳品企業(yè)出廠檢驗與品控及質(zhì)監(jiān)部門監(jiān)督的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋酸鈉、醋酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸天津科密歐公司；葡聚酶 美國Sigma公司；果糖酶瑞士Fluka公司；蔗果四糖 日本W(wǎng)ako公司；果糖、蔗糖 國家標準物質(zhì)研究中心。

1.2 儀器與設備

HPAE-PAD離子色譜儀 美國Dionex公司；Sevenmulti酸度計 瑞士Mettler Toledo公司；DK-8AX水浴鍋 上海一恒公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

醋酸緩沖液（pH 4.5）：0.2 mol/L醋酸鈉溶液220 mL和0.2 mol/L醋酸溶液280 mL混合后稀釋到1 L；磷酸鹽緩沖液（pH 4.5）：分別稱取1.24 g KH2PO4、7.27 g K2HPO4溶解于1 L去離子水中，用磷酸調(diào)pH值至4.5；葡聚酶（30～60 U/mg）、果糖酶（26.6 U/mg）：用磷酸鹽緩沖液溶解配制成酶含量分別為1 mg/mL；0.5 mg/mL蔗果四糖標準溶液：稱取50 mg標準品用水溶解并定容至100 mL；標準儲備液：分別準確稱取果糖和蔗糖（真空干燥箱55 ℃，4 h）標準品各100 mg（精確至0.1 mg），用水溶解并定容至100 mL，4 ℃冰箱可保存1個月；果糖與蔗糖混合系列標準溶液的配制：稀釋標準儲備液至果糖質(zhì)量濃度分別2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ?g/mL，蔗糖質(zhì)量濃度分別為0.5、2.0、4.0、6.0、10.0 ?g/mL。

1.3.2 樣品處理

稱取約5 g樣品（精確至0.1 mg）于錐形瓶中，加入40 mL 45～55 ℃蒸餾水溶解樣品，冷卻至室溫后轉入100 mL容量瓶中定容至刻度并混勻。A液：吸取10 mL樣液于50 mL試管中，加入10 mL醋酸緩沖液、1 mL果糖酶溶液混勻（若樣品中含有麥芽糊精再加入1.5 mL的葡聚酶溶液），60 ℃水浴1 h。B液：吸取10 mL樣液于50 mL試管中，加入10 mL醋酸緩沖液。待A液取出并冷卻后，將A、B液分別過濾后放于4 ℃冰箱過夜充分酶解。從冰箱中取出濾液緩至室溫后分別吸取1 mL至100 mL容量瓶中用去離子水定容至刻度，0.2 μm濾膜過濾。

吸取10 mL蔗果四糖標準溶液及10 mL醋酸緩沖液混勻后加入1 mL果糖酶溶液，設置不同水解時間（30、45、50、55、60、75、90 min）進行水解后，分別測定蔗果四糖含量，以確定最佳水解時間。

吸取10 mL蔗果四糖標準溶液及10 mL醋酸緩沖液混勻后加入不同體積的果糖酶溶液（0.5、1.0、1.5、2.0 mL），60 ℃水浴1 h后，分別測定蔗果四糖含量，以確定最佳酶用量。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Dionex PA-1（250 mm×4 mm，4.6 μm）；保護柱：Dionex PA-1（50 mm×4 mm，4.6 μm）；流速0.8 mL/min；進樣量2 0 ? L；流動相：A為12.5 mmol/L NaOH溶液，B為125 mmol/L NaOH溶液，C為125 mmol/L NaOH-0.5 mol/L NaAc溶液；梯度洗脫條件：0～30 min，A∶B∶C=85∶15∶0（V/V，下同）；30～36 min，A∶B∶C=0∶0∶100；36～51 min，A∶B∶C=85∶15∶0；電化學檢測器條件：0.00～0.40 min，電壓0.05V，0.20 min開始積分，0.40 min積分結束；0.41～0.60 min，電壓0.75V；0.61～1.00 min，電壓－0.15V。

分別將樣液與果糖和蔗糖混合標準溶液注入離子色譜測定相應的峰高，外標法定量。

1.3.4 多聚果糖含量計算方法

平均聚合度按28、果糖折算成多聚果糖系數(shù)為0.90計算。

式中：X為多聚果糖含量/（g/kg）；A1為水解后果糖測定含量/（g/kg）；A2為水解前果糖測定含量/（g/kg）；A3為水解前蔗糖測定含量/（g/kg）。

2 結果與分析

2.1 樣品處理的優(yōu)化

2.1.1 緩沖鹽體系

選用pH 4.5的酸度條件處理樣品，可使蛋白質(zhì)變性以去除蛋白質(zhì)，同時也為酶水解提供了適宜的酸度條件。醋酸鹽緩沖液與磷酸鹽緩沖液條件下，酶水解效果有一定差異，其多聚果糖測定結果分別為7.58 g/kg與7.21 g/kg，因此醋酸鹽緩沖液優(yōu)于磷酸鹽緩沖液。

2.1.2 酶解溫度與時間

根據(jù)文獻[7-8]及果聚酶的特點，適宜的酶解溫度應為60 ℃左右。實驗表明，不同的酶水解時間對水解效果影響明顯（表1），酶解時間在1 h及以上時可以達到全部水解的效果，本實驗選用60 ℃、1 h作為酶解溫度與時間。

表1 酶水解時間對多聚果糖測定結果的影響Table1 Effect of enzymatic hydrolysis time on results of determination of polyfructose

2.1.3 果聚酶使用量及葡聚酶的使用

果聚酶的活性及用量是影響酶解效率的重要因素。結果表明，在60 ℃保持1 h的條件下，酶用量低于1 mg時，低聚果糖測定結果偏低；用量大于1 mg時基本無變化，最終選用加入1 mg果聚酶（表2）。

表2 果聚酶用量對樣品多聚果糖含量測定結果的影響Table2 Effect of polymerase dosage on results of determination of polyfructose in samples

由于嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中常含有大量的麥芽糊精，會給樣品處理帶來困難，同時也可會增加測定干擾，降低測定靈敏度，因此需要葡聚酶降解。由于葡聚酶的水解條件與果聚酶基本相同，在使用果聚酶處理樣品的同時加入葡聚酶即可使麥芽糊精降解為葡萄糖。結果表明，用此處理方法后即可得到澄清的樣液，其降解產(chǎn)物葡萄糖也不影響果糖等的定量測定。

2.2 樣品測定

圖1 嬰幼兒配方乳粉酶水解前（A）、后（B）的色譜圖Fig.1 Chromatograms of infant formula before and after the enzymatic hydrolysis

采用1.3.3節(jié)中給出的流動相與檢測器條件樣品進行測定，其結果證明蔗糖、果糖與其他組分實現(xiàn)了有效分離，且基線噪聲低、測定靈敏度高，可滿足多聚果糖的測定（圖1）。

2.3 線性范圍與定量限

在1.3.3節(jié)色譜條件下，分別測定果糖與蔗糖的混合標準系列溶液。結果表明，在該范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度x與峰面積y呈良好的線性關系，果糖的線性回歸方程為y=0.348 8＋3.694 0x，r=0.999 9；蔗糖的線性回歸方程為y=0.174 8＋4.350 4x，r=0.999 7。果糖與蔗糖的定量限（RSN=5）分別為1.3、1.2 ng/mL。

2.4 方法的回收率和精密度

選取不含多聚果糖的中老年奶粉添加不同量的多聚果糖后測定其含量（添加前測定的多聚果糖的含量為6.96 g/kg），每個添加水平測定3次，計算回收率；含有多聚果糖的嬰兒配方奶粉與兒童奶粉處理液分別進樣6次，測定精密度。樣品平均回收率為97.4%，相對標準偏差為3.56%（表3、4）。

表3 樣品中多聚果糖回收率測定結果Table3 Recovery of polyfructose in spiked samples

表4 精密度測定結果Table4 Precision of the analytical method

3 結 論

本實驗建立采用酶水解-離子色譜法測定乳粉中多聚果糖的方法。通過對樣品前處理方法的優(yōu)化，確定了采用醋酸緩沖液處理、加入1 mg果糖酶、60 ℃水浴1 h使多聚果糖完全水解。通過測定水解前后果糖與蔗糖的含量即可計算出樣品中多聚果糖的含量。果糖與蔗糖測定的定量限分別為1.3、1.2 ng/mL。對于含有麥芽糊精的樣品，需加入葡聚酶水解成葡萄糖，以去除因麥芽糊精造成樣液過濾困難及濾液渾濁的問題，經(jīng)實驗驗證加入葡聚酶水解后對多聚果糖的測定無影響。該方法具有樣品處理簡單、重復性好、靈敏度高等優(yōu)點。

參考文獻：

[1] 周景欣, 袁杰利, 遲俐, 等. 雙歧桿菌低聚果糖制劑對便秘人群腸道菌群的調(diào)整作用[J]. 中國微生態(tài)學雜志, 2006, 18(5): 399-400.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 14880—2012 食品營養(yǎng)強化劑使用標準[S].北京: 中國標準出版社, 2012.

[3] 張媛媛, 聶少平, 萬成, 等. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法同時測定單糖、雙糖及低聚果糖[J]. 食品科學, 2009, 30(18): 237-239.

[4] 孫彥璞, 楊文遠, 姜玲. 高效液相色譜法測定菊粉酶解產(chǎn)物[J]. 北京化工大學學報: 自然科學版, 2003, 30(1): 109-110.

[5] 許秀敏, 龍朝陽, 魯琳, 等. HPLC-ELSD法測定食品中低聚果糖的含量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008, 18(10): 2002-2003.

[6] Association of Offi cial Analytical Chemists. AOAC Offi cial Method 997.08. Fructans in food products-ion exchange chromatographic method[S]. Gaithersburg: AOAC International, 1999.

[7] Association of Official Analytical Chemists. AOAC Official Method 997.03. Determination of total fructans in food-enzymatic/ spectrophotometric method[S]. Gaithersburg: AOAC International, 1999.

[8] LOBO A R, FILHO J M, ALVARES E P, et al. Effects of dietary lipid composition and inulin-type fructans on mineral bioavailability in growing rats[J]. Nutrition, 2009, 25(2): 16-25.

[9] MATUSEK A, MERERESZ P, LE T K D, et al. Effect of temperature and pH on the degradation of fructo-oligosaccharides[J]. European Food Research Technology, 2009, 228(3): 355-365.

[10] 甘賓賓. 高效液相色譜法測定低聚果糖的組分[J]. 色譜, 1999, 17(1): 87-88.

[11] 張志國, 生慶海, 盧彥君, 等. HPLC法檢測低聚果糖的研究[J]. 食品科學, 2002, 23(8): 221-223.

[12] 張績覓, 劉玉峰, 唐華澄, 等. 高效離子色譜法測定食品中低聚果糖的含量[J]. 食品研究與開發(fā), 2012, 33(1): 135-137.

[13] 王美菡, 李敏, 郭健, 等. 離子交換色譜法測定保健食品中低聚果糖的含量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2007, 17(6): 961-963.

[14] 傅博強, 王晶, 王遠興, 等. 食品中低聚果糖高效液相色譜檢測方法研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(9): 370-374.

[15] 朱煒, 那斯琴高娃, 徐向峰, 等. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器分析配方乳粉中的低聚果糖[J]. 中國食品工業(yè), 2010, 31(5): 62-63.

[16] 劉玉峰, 李東, 唐華澄, 等. 高效離子色譜法測定乳及乳制品中低聚果糖含量[J]. 乳業(yè)科學與技術, 2012(1): 40-42.

[17] 楊成金, 黃樺, 黃永坤, 等. HPLC及LC-MS技術在低聚糖檢測中的應用[J]. 現(xiàn)代科學儀器, 2011, 21(6): 147-150.

[18] 陳芳, 龍軍標, 周金森. 離子色譜在食品檢測中的應用最新進展[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2010, 20(4): 933-935.

[19] 陳青川, 牟世芬. 離子色譜法在食品分析中的最新應用[J]. 色譜, 2000, 18(2): 121-123.

[20] 關翠林. 離子色譜法在食品分析中的應用[J]. 雁北師范學院學報, 2001, 17(3): 50-51.

[21] 周梅素, 郭東龍. 離子色譜法在食品工業(yè)分析中的應用[J]. 山西食品工業(yè), 1997(2): 31-33.

[22] 朱巖, 徐素君. 低聚糖的脈沖安培檢測陰離子色譜測定法[J]. 色譜, 1990, 8(5): 315-316.

[23] 李建文, 王竹, 楊月欣. 高效離子色譜法測定糖漿中低聚半乳糖含量[J]. 衛(wèi)生研究, 2006, 35(5): 584-586.

[24] 張磊, 周光明, 熊建飛. 離子色譜法檢測水果、飲品中的蔗糖、葡萄糖和果糖[J]. 食品科學, 2012, 33(8): 159-162.

[25] 劉曉玲, 李東剛, 史娟, 等. 離子色譜-脈沖安培檢測器分析飲料中單糖和二糖[J]. 光譜實驗室, 2010, 27(2): 441-445.

[26] 王文輝, 彭永芳. 低聚果糖HPLC的快速測定[J]. 食品科學, 1999, 20(3): 53-54.

[27] 那紅萍, 苑向杰. 高壓液相色譜法測定嬰兒配方奶粉中低聚果糖[J].生命科學儀器, 2011(6): 41-42.

Determination of Polyfructose Content in Milk Powder by Enzymatic Hydrolysis Coupled with Ion Chromatography

BAI Jing1, JIANG Jin-dou2,*, TAO Da-li2
(1. School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Dairy Quality Supervision and Testing Center, Ministry of Agriculture, Harbin 150090, China)

This study is intended to develop an analytical method to determine polyfructose in milk powder using enzymatic hydrolysis combined with ion chromatography. Fructanohydrolase and glucose polymerase were added to acetate buffer and incubate in 60 ℃ water bath for 1 h to completely decompose polyfructose and maltodextrin into glucose and fructose. The contents of fructose and sucrose before and after the enzymatic hydrolysis were analyzed by ion chromatography with electrochemical detection so that the content of the polyfructose could be calculated from the measured results. Chromatographic separation was carried out on a PA-1 column (250 mm×4 mm, 4.6 μm) by gradient elution at a fl ow rate of 0.8 mL/min. The calibration curve was y = 0.348 8＋3.694 0x, r = 0.999 9 for fructose, and y = 0.174 8＋4.350 4x, r = 0.999 7 for sucrose. The average recovery was 97.4% with a relative standard deviation of 3.56%. Limit of quantifi cation was 1.3 ng/mL for fructose and 1.2 ng/mL for sucrose. This method was simple, sensitive, reproducible and applicable to determine polyfructose in modifi ed milk powder and infant formula.

milk powder; fructanohydrolase; polyfructose; ion chromatography

TS207.3

A

1002-6630（2014）02-0257-04

10.7506/spkx1002-6630-201402050

2012-10-09

白靖（1982—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全。E-mail：kqzjjzlk@163.com

*通信作者：姜金斗（1960—），男，研究員，碩士，研究方向為食品儀器分析與安全。E-mail：jjindou@163.com