大孔樹脂分離純化南極磷蝦殼中的蝦青素

姜啟興，宋素梅，夏文水，劉富俊，許艷順，劉冬梅，王海鷗,*

大孔樹脂分離純化南極磷蝦殼中的蝦青素

姜啟興1，宋素梅1，夏文水1，劉富俊2，許艷順1，劉冬梅2，王海鷗1,*

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.遼寧省大連海洋漁業集團公司，遼寧 大連 116113）

研究AB-8大孔吸附樹脂對蝦青素的靜態、動態吸附效果。結果表明，AB-8樹脂對蝦青素的最大吸附量為476.2 μg/g干樹脂，乙酸乙酯對蝦青素的解吸率為98.7%；動態吸附條件為蝦青素上樣質量濃度2 μg/mL、上樣流速4BV/h。此條件下，皂化液中蝦青素的回收率為78.9%，純度為92.4%。

南極磷蝦殼；大孔吸附樹脂；分離純化；蝦青素

近年來，隨著資源問題的日益嚴峻，遠洋資源的開發利用成為各國爭相研究的課題。據估計，南極磷蝦的生物量為6.5～10.0億 t，幾乎遍布整個南極海域，資源極其豐富[1-4]。而蝦青素是南極磷蝦殼中含量比較豐富的活性成分，具有超強的抗氧化活性以及顯著的著色能力，在食品、醫藥、化妝品和飼料等行業具有重要作用[5-12]。目前，國內研究更多關注南極磷蝦肉中蛋白、脂溶性成分等的分離和應用[13]，國外則側重于對酶、脂肪酸等的分離純化及其性質分析[14-16]，對南極磷蝦殼資源的研究較少。而蝦殼大多作為廢棄物丟棄，亟需有效的開發利用。

目前，大孔吸附樹脂不僅廣泛應用于水溶性總類胡蘿卜素的吸附和分離，如蘆丁、綠原酸、牛蒡以及苷類物質[17-19]，還越來越多地應用于非水體系總類胡蘿卜素的吸附和分離，如葛根素、芹黃素和香豆素等[20-22]。然而，有關大孔吸附樹脂分離純化蝦青素的研究較少。本實驗在探索大孔樹脂對蝦青素吸附條件的基礎上，進一步分析了大孔樹脂分離純化皂化液中游離蝦青素的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦由遼寧省大連海洋漁業集團公司提供，蝦殼經有機溶劑提取、脫溶得色素油，經NaOH皂化后得皂化液；蝦青素標準樣品（純度≥97.1%） 德國Dr.Ehrenstorferg公司；皂化液（游離蝦青素含量為55.75 μg/mL） 實驗室現配；丙酮、乙醇、正己烷、乙酸乙酯（均為分析純），二氯甲烷、甲醇、乙腈（均為色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；AB-8、S-8、D3520樹脂 南開合成公司；LX-16、LX-10G、LX-17樹脂 西安藍曉科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1525高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器、色譜柱Spherisorb?Silica（4.6 mm×250 mm，5 μm） 美國Waters公司；AB104-N電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大孔吸附樹脂的預處理

取樹脂，用無水乙醇浸泡24 h，醇洗至流出液與水1∶5（V/V）不混濁，再用去離子水沖洗至無醇味；然后用5% HCl溶液浸泡2～4 h，用去離子水沖洗至中性；最后用2% NaOH溶液浸泡2～4 h，用去離子水沖洗至中性。

1.3.2 大孔樹脂對蝦青素的吸附和解吸效果

稱取預處理后的樹脂AB-8、S-8、D3520、LX-17、LX-10G、LX-16各5.0 g（干質量1.0 g左右，下同）于具塞錐形瓶中，分別加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液（蝦青素標樣溶于乙醇，下同）50 mL，搖床振蕩4 h（30 ℃、70 r/min），用絹布過濾，濾液于472 nm（光譜掃描所得最大吸收波長）處測定吸光度，向樹脂中加入50 mL丙酮，恒溫水浴振蕩4 h（30 ℃、70 r/min），于472 nm波長處測定解吸液的吸光度。計算樹脂對蝦青素的吸附率、解吸率和吸附量。

1.3.3 樹脂靜態吸附動力學曲線

取AB-8、LX-10G和LX-16樹脂各5.0 g于具塞錐形瓶中，加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液50 mL，恒溫水浴振蕩（30 ℃、70 r/min），每20 min于472 nm波長處測定總類胡蘿卜素液的吸光度，計算樹脂對蝦青素的吸附量，直至吸附平衡。

1.3.4 樹脂靜態吸附等溫線

稱取AB-8樹脂 5.0 g于具塞錐形瓶中，分別加入2、4、6、8、10 μg/mL的蝦青素乙醇溶液10 mL，于25 ℃恒溫水浴振蕩5 h，吸附平衡后于472 nm波長處測定吸光度。

1.3.5 不同溶劑對蝦青素的解吸效果

稱取AB-8樹脂5.0 g于具塞三角瓶中，加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液10 mL，于25 ℃恒溫水浴振蕩3 h，達到吸附平衡。然后分別用10 mL乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯進行解吸，用氮氣吹干溶劑，乙醇復溶，于472 nm波長處測定吸光度，計算蝦青素的解吸率。

1.3.6 蝦青素上樣質量濃度對AB-8動態吸附的影響

稱取AB-8樹脂 5.0 g，濕法裝柱（D10 mm× 200 mm），樹脂高度13 cm，柱床體積10 mL（1 BV），用恒流泵以2 BV/h的流速分別將1、2、4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液泵入玻璃柱內，每10 mL即1 BV收集1管，于472 nm波長處測定吸光度，計算流出液質量濃度。以流出液體積為橫坐標，流出液中蝦青素質量濃度為縱坐標，繪制動態吸附曲線。

1.3.7 上樣流速對AB-8樹脂動態吸附的影響

稱取AB-8樹脂5.0 g于具塞三角瓶中，加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液10 mL，于25 ℃恒溫水浴振蕩3 h，達到吸附平衡。然后分別用10 mL乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯進行解吸，用氮氣吹干溶劑，乙醇復溶，于472 nm波長處測定吸光度，計算蝦青素的解吸率。

1.3.8 AB-8樹脂再生對蝦青素吸附率的影響

稱取5.0 g經過預處理的AB-8樹脂于具塞三角瓶中，加入4 μg/mL的蝦青素乙醇溶液50 mL，按照吸附-解吸-再生的順序重復操作，測定蝦青素溶液吸附前后的吸光度，分析吸附率的變化。其中，吸附條件：恒溫水浴振蕩（30 ℃、70 r/min），4 h；解吸條件：恒溫水浴振蕩（30 ℃、70 r/min），10 mL乙酸乙酯解吸2 h；再生方法同1.3.1節方法。

1.3.9 AB-8樹脂分離純化皂化液中的蝦青素

稱取AB-8樹脂 5.0g，濕法裝柱（D10 mm× 200 mm），樹脂高度13 cm，柱床體積10 mL（1 BV）。制備皂化液 7.5 mL，皂化12 h時，用無水乙醇稀釋皂化液中的蝦青素至2 μg/mL。用恒流泵以4 BV/h的流速將稀釋后的皂化液泵入AB-8層析柱內，每10 mL收集1管至吸附平衡。接著用H2O沖洗柱子至流出液的pH值為中性，然后無水乙醇沖洗除去H2O，最后用乙酸乙酯解吸。記錄吸附平衡時皂化液的體積、蝦青素吸附量以及解吸液中蝦青素的含量。濃縮除去乙酸乙酯，用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定游離蝦青素的含量，根據蝦青素標準曲線進行計算，即S=123.15C-91.77，R2=0.996 4，式中：S為峰面積/（mAU·s）；C為蝦青素質量濃度/（μg/mL）。

1.3.10 HPLC的色譜條件

色譜柱：Ecosil反相C18柱（4.6 mm×250 mm）；流動相：包括A和B，其中A為二氯甲烷-甲醇-乙腈-水（5.0∶85.0∶5.5∶4.5，V/V），B為二氯甲烷-甲醇-乙腈-水（22.0∶28.0∶45.5∶4.5，V/V）；梯度洗脫：0%的B洗脫8 min，0%～100%的B洗脫24 min；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測器：二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）；進樣量5 μL；檢測波長476 nm（DAD掃描結果）。

1.4 數據處理

數據分析采用SPSS 18軟件；數據繪圖采用Origin 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同大孔樹脂對蝦青素的分離效果

2.1.1 樹脂的基本指標及吸附解吸效果

根據蝦青素分子中含有共軛雙鍵和苯環的結構特點，選擇常用的S-8、AB-8、D3520，以及LX系列樹脂，測定各樹脂的基本參數及吸附、解吸性能，結果見表1。

表1 樹脂的性質及吸附解吸效果Table 1 Physical properties and absorption capacities of macroporous ressiinnss

從表1可以看出，AB-8、LX-10G和LX-16等弱極性或非極性樹脂的吸附率均大于85%，而強極性樹脂S-8、LX-17的吸附率分別為57.8%和25.8%。這主要由于蝦青素是弱極性分子，更容易與極性相似的樹脂大分子形成π-π共軛，成為樹脂吸附蝦青素的主要作用力。AB-8、LX-10G和LX-16的解吸率分別為93.4%、92.1%和84.3%，無明顯差異；吸附量分別為120.9、109.9 μg/g和92.1 μg/g干樹脂。因此，選擇AB-8、LX-10G和LX-16進一步分析。

2.1.2 樹脂靜態吸附動力學曲線

圖1 AB-8、LX-10G和LX-16樹脂吸附蝦青素的動力學曲線Fig.1 Adsorption kinetics of astaxanthin on AB-8, LX-10G and LX-16

由圖1可見，在起始的60 min內，3 種樹脂對蝦青素的吸附量快速增大，而后增速減緩，可能由于蝦青素向樹脂微孔中擴散時存在傳質阻力。3種樹脂都在約180 min時達到吸附平衡。吸附時間相同時，AB-8樹脂的吸附量總是高于LX-10G和LX-16。因此選擇AB-8樹脂為后序實驗的吸附樹脂。

2.2 AB-8樹脂對蝦青素的靜態吸附和解吸效果

2.2.1 等溫吸附曲線

實驗表明，AB-8樹脂對蝦青素的吸附量隨蝦青素質量濃度的增加而增加，線性關系明顯。因此，考慮用Langmuir方程來表示吸附過程：

式中：Qe為平衡吸附量/（μg/g干樹脂）；Qm為最大吸附量/（μg/g干樹脂）；Ce為吸附平衡時蝦青素溶液質量濃度/（μg/mL）；K為經驗常數。

圖2 AB-8樹脂的等溫吸附線Fig.2 Adsorption isotherm of AB-8 resin

如圖2所示，AB-8樹脂Langmuir模型的相關系數高達0.9973，說明吸附過程屬于單分子層吸附。經計算，最大吸附量為476.2 μg/g干樹脂。

2.2.2 不同溶劑對蝦青素的解吸效果

表2 不同溶劑對蝦青素的解吸率Table 2 Desorption rates of astaxantinon with different solvents

由表2可以看出，乙醇對蝦青素的解吸率最低，僅為10.3%，而丙酮、正己烷、乙酸乙酯的解吸率都在90%以上，且乙酸乙酯的解吸率最高，為98.7%。這可能由于乙醇為強極性有機溶劑，而蝦青素為弱極性化合物，根據相似相溶的原理，當蝦青素吸附于樹脂上時，乙醇對其解吸能力低于中等極性或非極性溶劑。

2.3 AB-8樹脂對蝦青素的動態吸附效果

2.3.1 蝦青素上樣質量濃度對動態吸附的影響

圖3 蝦青素上樣質量濃度對AB-8樹脂動態吸附曲線的影響Fig.3 Effect of astaxanthin concentration on dynamic adsorption curve of AB-8 resin

由圖3可知，隨著上樣量的增加，流出液中蝦青素的含量逐漸增加。蝦青素質量濃度越大，初始階段的吸附速率越大，泄漏點也逐漸提前，如1、2、4 μg/mL的泄漏點分別為10、8、6 BV。質量濃度低，耗時較長，質量濃度過高會增大傳質阻力，能耗較大。因此，結合經濟效益，選擇蝦青素質量濃度為2 μg/mL。蝦青素質量濃度2 μg/mL，流出液體積24 BV時，流出液中蝦青素的質量濃度與初始質量濃度幾乎相等，即達到吸附平衡。

2.3.2 上樣流速對動態吸附的影響

表3 上樣流速對吸附效果的影響Table 3 Effect of flow rate on adsorption efficiency

由表3可知，隨著流速的增大，蝦青素的泄漏體積逐漸提前。當流速達到6 BV/h時，蝦青素收集量僅為4.0 BV時即發生泄漏；而流速為1.0 BV/h時，收集11 BV的蝦青素時才發生泄漏。這可能由于流速過大時，溶質分子尚未被樹脂吸附就提前發生泄漏，樣品流失較多；然而流速過小，吸附時間延長使得樣液中蝦青素過長時間的與樹脂結合，可能導致蝦青素的降解，回收率下降，而且長時間的吸附使得樹脂再生困難。因此選擇上樣流速為4 BV/h。

2.3.3 AB-8樹脂再生對蝦青素吸附率的影響

圖4 AB-8樹脂再生對蝦青素吸附率的影響Fig.4 Effect of AB-8 resin regeneration on adsorption rate of astaxanthin

由圖4可知，AB-8樹脂經過15 次吸附-解吸-再生的重復操作之后，對蝦青素的吸附能力略有降低，僅下降了3.28%，因此，AB-8樹脂用于非水介質中蝦青素的分離純化將十分經濟有效，可應用于蝦青素的規模化生產。

2.4 AB-8樹脂分離純化皂化液中的蝦青素

表4 AB-8樹脂對皂化液中蝦青素的吸附和解吸Table 4 Adsorption and desorption of astaxanthin in saponification solution on AB-8 resin

按表4的流程，用AB-8吸附皂化液中的蝦青素；通過H2O沖洗除去皂化反應生成的鹽類物質；接著用乙醇沖洗除去H2O（由表2可知，乙醇解吸率低，為除去H2O，同時減少蝦青素的損失，選擇乙醇除雜溶劑），最后用乙酸乙酯解吸，測定吸附和解吸過程的中各項指標。

如表4所示，將稀釋至2 μg/mL的皂化液以4 BV/h的流速泵入柱內，21 BV即210 mL時吸附游離蝦青素的總量為345.8 μg。首先用H2O以4 BV/h的流速洗脫，用精密pH試紙檢測洗脫液的pH值，約3 BV即可使pH值由9.0降至7.0，接著用約1 BV的無水乙醇沖洗柱內的H2O，最后用乙酸乙酯洗脫，約2 BV，得到蝦青素溶液。通過濃縮除去乙酸乙酯，用HPLC測得蝦青素330.0 μg，即一次吸附的回收率為78.9%。通過HPLC檢測可知，純度為92.4%。H2O沖洗和乙醇沖洗過程中，將樹脂表面吸附的部分蝦青素沖洗下來，造成了回收率的下降。

3 結 論

在比較S-8、AB-8、D3520、LX-17、LX-10G和LX-16樹脂對蝦青素標準溶液的吸附和解吸效果的基礎上，選擇AB-8為吸附樹脂。AB-8對蝦青素的最大吸附量為476.2 μg/g干樹脂，選擇乙酸乙酯作為解吸溶劑；動態吸附條件為蝦青素質量濃度2 μg/mL、上樣流速4 BV/h。此條件下，皂化液中的蝦青素回收率為78.9%，純度為92.4%。

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Separation and Purification of Astaxanth from Antarctic Krill Shells by Macroporous Resin

JIANG Qi-xing1, SONG Su-mei1, XIA Wen-shui1, LIU Fu-jun2, XU Yan-shun1, LIU Dong-mei2, WANG Hai-ou1,*
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Liaoning Province Dalian Ocean Fishery Group, Dalian 116113, China)

In the present study, the static and dynamic adsorption capacities of AB-8 macroporous resins for astaxanthin from Antarctic krill shells were evaluated. The results showed that the maximum quantity of astaxanthin adsorbed was 476.2 μg per gram of dry AB-8. Ethyl acetate was selected as the elution solvent with a desorption rate of 98.7%. The dynamic adsorption conditions were optimized as 2 μg/mL and 4 BV/h for astaxanthin concentration and flow rate, respectively. Under the optimal condition, the astaxanthin in saponification solution was purified with recovery rate of 78.9% and purity of 92.4%.

Antarctic krill shells; macroporous resin; separation and purification; astaxanthin

TS254.9

A

1002-6630（2014）16-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201416001

2013-08-05

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA090801）

姜啟興（1977—），男，副教授，博士，研究方向為食品加工與保藏。E-mail：qixingj@163.com

*通信作者：王海鷗（1956—），女，副教授，碩士，研究方向為食品加工與保藏。E-mail：howang@126.com