腰果蛋白的提取工藝條件優化

鐘俊楨，頓儒艷，黃宗蘭，劉 偉，劉成梅*

腰果蛋白的提取工藝條件優化

鐘俊楨，頓儒艷，黃宗蘭，劉 偉，劉成梅*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

以腰果為原料，分析腰果仁的主要成分，比較研究不同提取方法對蛋白質提取率的影響；以料液比、提取液pH值、提取溫度、提取時間為單因素，運用單因素和正交試驗設計，優化腰果蛋白提取的最佳工藝條件。結果表明：腰果仁中粗脂肪含量最高，達44.13%，其他組分含量為：碳水化合物22.91%、蛋白質19.41%、水分3.07%、灰分2.45%；研究發現堿提法提取效果最佳，并確定其最佳工藝條件為料液比1∶40（g/mL）、提取液pH 9、提取溫度35 ℃、提取時間1.5 h，此條 件下獲得的腰果蛋白提取率可達79.0%，腰果蛋白質的純度為86.62%。腰果蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明：腰果蛋白主要含有22、26.2 kD的亞基，其次是14.1、16 kD，少量亞基為67.5、88 kD。

腰果；蛋白質；營養成分；提取優化；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠

腰果屬多年生熱帶常綠喬木果樹，生于熱帶亞熱帶，是世界四大著名堅果之一，具有非常高的營養藥用和保健價值[1]。腰果果仁營養豐富，多用于制腰果巧克力、點心和油炸鹽漬食品。腰果仁油為上等食用油，副產品有果殼液、果梨等[2]。腰果的果仁約含40%～57%的油和21%蛋白質，蛋白質含量是一般谷類作物的2 倍之多，氨基酸的種類與谷物中氨基酸的種類互補，是一種具有高營養價值的食物[3]。有研究[4]顯示濃縮腰果蛋白可作為營養添加劑添加入食品中，增強食物的營養，還可以作為功能性食品，改善人體由于缺少蛋白質而引起的一些疾病等。現代醫學研究表明，腰果具有許多重要的醫藥保健作用，例如抗癌、抗菌等作用。目前，主要研究是關于腰果油和腰果酚的報道[5-8]，對于腰果果仁中蛋白質的利用和開發還少有研究。Prabha等[9]通過腰果球蛋白粕喂養大鼠，對其監測腰果球蛋白飲食對脂質代謝的影響。Ogunwolu等[10]報道了腰果中濃縮蛋白和分離蛋白的功能性質。Bora等[11]比較研究天然腰果蛋白和變性蛋白功能性質的區別。Yuliana等[12]研究pH值和NaCl對腰果殼分離蛋白功能性質的影響。盡管有一些腰果蛋白功能性質的研究報道，但關于提取優化的工藝研究甚少。腰果蛋白的提取工藝的優化為食品加工產業化提供理論指導，為稀有資源的開發與利用提供理論依據，也豐富了食品行業、醫藥業保健藥品的開發利用等。

本實驗主要以腰果為原料，分析其主要成分，對腰果蛋白質的提取方法及工藝條件進行研究，以期得到最佳提取工藝，并運用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法對提取的腰果蛋白進行分析，為腰果蛋白加工利用等研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腰果購于南昌洪城大市場，于0～4 ℃貯藏。

SDS-PAGE凝膠電泳所用試劑 美國Sigma公司；所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HR83型快速鹵素水分測定儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Sx-4-10型馬弗爐 湖北英山國營試驗設備廠；FreeZone12plus真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；KV-9820自動凱氏定氮儀 美國Microfluidics公司；UV-1600PC紫外分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；LXJ-IIBB高速離心機 上海安亭科學儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制度有限公司；041BR86999電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 原料營養成分的測定

水分含量測定：采用常壓干燥法，GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》；碳水化合物含量測定：采用GB/T 5009.7—2003《食品中還原糖的測定》的方法；粗脂肪含量測定：采用索氏提取法，GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》；蛋白質含量測定：采用凱氏定氮法，GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》；灰分含量測定：采用灼燒法，GB/T 5009.4—2010《食品中灰分的測定》。

1.3.2 蛋白質含量的測定

蛋白質含量測定：采用考馬斯亮藍Bradford法[13]，以牛血清蛋白為標準蛋白，考馬斯亮藍G-250染色，得標準曲線方程為：Y=0.004 6X-0.012 5，R2=0.996 4。按下式計算腰果蛋白提取率。

1.3.3 原料處理及蛋白提取

1.3.3.1 原料預處理

實驗前選取顆粒飽滿、無病蟲害、質地均勻的腰果，取一定量的腰果在粉粹機中進行粉碎，放在干燥器中備用，用石油醚脫脂[14]，得到腰果粉。

1.3.3.2 腰果蛋白提取方法選擇

1）Tris-HCl法[15]：取脫脂后的樣品1 g，向其中加入50 mL 0.2 mol/L pH 8的Tris-HCl緩沖液，攪拌溶解，并在45 ℃條件下浸提6 h，于4 000 r/min離心15 min，取上清液測定蛋白質含量。

2）鹽溶法：取脫脂后的樣品1 g，向其中加入50 mL 0.14 mol/L的NaCl溶液，攪拌溶解，并在45 ℃條件下浸提6 h，于4 000 r/min轉速下離心15 min，取上清液測定蛋白質含量。

3）堿溶酸沉法[16]：取脫脂后的樣品1 g，向其中加入50 mL的蒸餾水，用0.01 mol/L的NaOH溶液調pH值至10，攪拌溶解，并在45 ℃條件下浸提6 h，于4 000 r/min離心15 min，取上清液測定蛋白質含量。

1.3.4 蛋白質提取工藝的確定

1.3.4.1 單因素試驗設計

采用堿提法，在其他條件一定時，料液比采用1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）6 個水平，0.01 mol/L的NaOH溶液調節提取液pH值7、8、9、10、11、12共6 個水平，提取溫度采用25、30、35、40、45、50 ℃ 6 個水平，提取時間采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h共5 個水平分別進行單因素試驗。

1.3.4.2 正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇料液比、提取液pH值、提取溫度、提取時間進行四因素三水平L9（43）正交試驗，試驗設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳[17]

將提取的腰果蛋白配制成1 mg/mL溶液，與樣品緩沖液（pH 6.8、0.5 mol/L Tris-HCl 2.0 mL，10 g/100 mL SDS 4.0 mL，甘油2.0 mL，β-巰基乙醇1.0 mL，0.1 g/mL溴酚蘭0.5 mL，超純水0.5 mL）按1∶1的體積比例混合，各8 μL。100 ℃煮沸5 min，離心，上樣8 μL，分離膠質量濃度12 mg/100 mL，濃縮膠質量濃度5 mg/100 mL。開始電流8 mA，進入分離膠后16 mA，電泳時間3.5～4 h。至溴酚藍前沿到達分離膠底部時停止電泳，撥膠，考馬斯亮藍R-250染色液染色1.5～2 h，脫色，至凝膠背景為無色時為止，拍照，分析蛋白質遷移率。

2 結果與分析

2.1 腰果原料基本成分分析

從表2可以看出，腰果仁中含量最高的是粗脂肪，含量44.13%，其次依次為碳水化合物22.91%，蛋白質19.41%，與文獻[3]中報道腰果仁中約含40%～57%的油和21%左右的蛋白質基本一致，蛋白質含量可能由于產地和品種的不同存在一定差異。

表2 腰果原料基本成分分析Table 2 Proximate composition of cashew nuts

2.2 提取方法的選擇

圖1 不同提取方法對腰果蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction solvents on protein extraction from cashew nuts

選用不同方法提取腰果蛋白，由圖1可以得出，相比于鹽溶法和Tris-HCl法，采用堿溶法顯著提高蛋白質提取率，達到40.09%（P＜0.05），鹽溶法最低20.15%，相比較而言，提取率相差多達約20%。所以本實驗采用堿提法。研究顯示堿可以使腰果的結構變疏松，打破蛋白質分子間的部分氫鍵[18]，增加了蛋白的溶解度，使得提取率增加。

2.3 單因素試驗

2.3.1 料液比對腰果蛋白質提取率的影響

圖2 料液比對腰果蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on protein extraction from cashew nuts

選取溫度45 ℃、時間1 h、pH 9時，以料液比為變量進行3 次平行試驗，由圖2可知，料液比從1∶10～1∶40（g/mL）時，蛋白質提取率呈上升趨勢。當料液比為1∶40（g/mL）時，提取率顯著增高，達到最大為56.32%（P＜0.05）。隨著提取液用量的持續增大，提取率逐漸降低至33.05%。可能的原因是隨著溶液體積的增大，溶劑增加，原料內外蛋白質濃度差加大，蛋白質越容易滲透到提取液中，提取率相應增大[19]。當提取液用量繼續增加時，蛋白質溶解達到飽和，加水量過多，酸沉時上清液中殘留的的清蛋白量增加，蛋白的損失量也就增高[20]，提取率反而下降，此外，食品工業生產過程中，提取液用量過大會影響濃縮干燥的加大，增加了產品成本，故選取料液比為1∶40（g/mL）進行提取分析。

2.3.2 pH值對腰果蛋白質提取率的影響

圖3 pH值對腰果蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of pH on protein extraction from cashew nuts

選取料液比為1∶40（mg/mL）、溫度45 ℃、時間1 h，以pH值為變量進行3 次平行試驗，由圖3可知，提取液pH值由7升到10時，腰果蛋白質的提取率隨著pH值的增高而增大，最高達到53.25%（P＜0.10），但當pH值繼續增大時，提取率有下降的的趨勢。這是由于堿可以使腰果的結構變疏松，還會打破蛋白質分子間的部分氫鍵[18]從而促使淀粉和蛋白質分離，增加了蛋白提取率，而當pH值繼續增大時，在強堿環境下蛋白質容易變性和水解，同時使蛋白產品的顏色變深，蛋白質長時間受強堿作用會引起“胱賴”反應，還會生成有毒化合物[21]，因此試驗的最適提取pH值在9～10之間。

2.3.3 提取溫度對腰果蛋白質提取率的影響

圖4 提取溫度對腰果蛋白質提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on protein extraction from cashew nuts

選取料液比為1∶40（mg/mL）、pH 9、時間1 h，以溫度為變量進行3 次平行試驗，由圖4可知，不同提取溫度對蛋白質的提取率具有顯著影響（P＜0.05）。當提取溫度為25～35 ℃，提取率逐漸上升，由56.00%上升到61.07%，隨著溫度的持續升高，提取率降低至54.73%。原因可能是35 ℃前，隨著溫度的升高，親水基團慢慢展開，巰基含量增加，蛋白質的溶解度升高；隨著溫度的持續升高，疏水基團被暴露和展開，使得蛋白質分子聚集，溶解度下降[22]，導致提取率下降。當溫度升高至一定程度時，蛋白質可能發生變性，所以試驗提取溫度選在35 ℃左右。

2.3.4 提取時間對腰果蛋白質提取率的影響

圖5 提取時間對腰果蛋白質提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction from cashew nuts

選取料液比為1∶40（mg/mL）、溫度45 ℃、pH 9，以浸提時間為變量進行3 次平行試驗，由圖5可知，在1.5 h之前，腰果蛋白的提取率隨著時間的延長而顯著提高，由48.27%上升到63.93%（P＜0.05），1.5 h之后，提取率出現下降趨勢，下降至55.47%。這是由于去脂腰果粉本身需要一定的溶脹時間，充足的溶脹時間利于蛋白質的分離溶解[23]，若提取時間過長，浸提液中已溶蛋白質達到飽和[24]，并且隨著疏水基團的暴露，有部分蛋白質出現凝聚沉淀，導致提取率的降低。

2.4 腰果蛋白質提取條件優化

在單因素試驗基礎上做正交試驗，優化提取工藝。正交試驗結果見表3。

表3 腰果蛋白提取條件優化的正交試驗結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results

表4 正交試驗結果方差分析表Table 4 Analysis of variance for protein yield with various extraction conditions

選取料液比（A）、提取液pH值（B）、提取溫度（C）、提取時間（D）4 個因素，以腰果蛋白的提取率為指標，得出優化條件。從表3極差R值可以得出，對腰果蛋白提取率影響因素由大到小依次是B＞A＞C＞D，即pH值對腰果蛋白的提取率影響最大。可以得出，最佳工藝條件為A2B3C2D2，即料液比1∶40（g/mL）、提取液pH 9、提取溫度35 ℃、提取時間1.5 h。由表4方差分析結果表明：pH值為影響腰果蛋白質提取過程的顯著因素，料液比、提取時間、提取溫度為不顯著因素。根據最佳工藝條件對腰果蛋白進行提取，測得腰果蛋白的提取率可達79.0%，純度為86.62%。

2.5 腰果蛋白的亞基分布和分子質量

圖6 腰果蛋白質電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of protein from cashew nuts

采用SDS-PAGE凝膠電泳對提取的腰果蛋白進行分析，其亞基分布見圖6。染色后提取的腰果蛋白質條帶相比于原料清晰可見，染色程度越深，說 明含量越高，純度越高，反之越低[25]。由圖6可知，提取得到的腰果蛋白相比于腰果原料清晰可見，可以得出提取出的腰果蛋白純度相對較高。從第5列分析，根據遷移率的不同，計算出腰果蛋白中主要含有22、26.2 kD，其次是14.1、16 kD，少量亞基為67.5、88 kD。SDS-PAGE凝膠電泳實驗說明了腰果蛋白的多樣性，驗證了提取的腰果蛋白的純度較高。

3 結 論

3.1 根據國標法測定了腰果的主要成分如下：粗脂肪含量最高，達44.13%，其他組分含量為：碳水化合物22.91%，蛋白質19.41%，水分3.07%，灰分2.45%。

3.2 選擇最優提取方法堿提法，并通過單因素、正交試驗得出腰果蛋白提取的最佳工藝條件是：料液比1∶40（g/mL）、提取液pH 9、提取溫度35 ℃、提取時間1.5 h，所得腰果蛋白的提取率可達79.0%，純度達86.62%。

3.3 SDS-PAGE凝膠電泳得出腰果蛋白中主要含有22、26.2 kD，其次是14.1、16 kD，少量亞基為67.5、88 kD，表現了腰果蛋白的多樣性和提取后的純度較高。

參考文獻：

[1] 趙麗, 黃海杰. 我國腰果研究概況[J]. 中國南方果樹, 2012, 41(2): 41-46; 77.

[2] 黃敏, 操慶國. 腰果產業具有良好的發展前景[J]. 食品工程, 2009(1): 27-29.

[3] SOARES D J, MENEZED D V, PEDRO H, et al. Prevalent fatty acids in cashew nuts obtained from conventional and organic cultivation in different stages of processing[J]. Food Science and Technology, 2013, 33(2): 265-270.

[4] RIBEIRO V G P, BARRETO A C H, DENARDIN J C, et al. Magnetic nanoparticles coated with anacardic acid derived from cashew nut shell liquid[J]. Journal of Materials Science, 2013, 48(22): 7875-7882.

[5] SOARES D J, MEBEZED D V, PEDRO H, et al. Prevalent fatty acids in cashew nuts obtained from conventional and organic cultivation in different stages of processing[J]. Food Science and Technology, 2013, 33(2): 265-270.

[6] AREMU M O, OGUNLADE I, OLONISAKIN A. Fatty acid and amino acid composition of protein concentrate from cashew nut (Anarcadiu occidentale) grown in Nasarawa State, Nigeria[J]. Pakistan Journal of Nutrition, 2007, 6(5): 419-423.

[7] 孫延芳, 楊開寶, 劉瑩, 等. 腰果種仁脂肪酸GC-MS分析[J]. 黑龍江農業科學, 2012(1): 92-93.

[8] GOMEZ-CARAVACA A M, VERARDO V, CABONI M F. Chromatographic techniques for the determination of alkyl-phenols, tocopherols and other minor polar compounds in raw and roasted cold pressed cashew nut oils[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(47): 7411-7417.

[9] PRABHA S P S, RAJAMOHAN T. Effect of inclusion of cashew globulin (Anacardium occidentale) to a casein diet on lipid parameters in rats[J]. Plant Foods for Human Nutrition, 1998, 53(1): 83-92.

[10] OGUNWOLU S O, HENSHAW F O, MOCK H P, et al. Functional properties of protein concentrates and isolates produced from cashew (Anacardium occidentale L.) nut[J]. Food Chemistry, 2009, 115(3): 852-858.

[11] BORA P S, NETO V Q. Functionality of native and denatured cashew nut kernel protein isolates at isoelectric pH as a function of salt concentration[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2004, 84(15): 2022-2027.

[12] YULIANA M, TRUONG C T, HUYNH L H, et al. Isolation and characterization of protein isolated from defat ted cashew nut shell: influence of pH and NaCl on solubility and functional properties[J]. LWT-Food Science and Technology, 2014, 55(2): 621-626.

[13] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1): 248-254.

[14] 于陽陽. 東北核桃楸種仁蛋白提取及降血壓肽制備的研究[D]. 哈爾濱: 東北林業大學, 2012

[15] 李瑩瑩, 吳彩娥, 楊劍婷, 等. 白果蛋白質提取及SDS-PAGE分析[J].食品科學, 2010, 31(22): 36-40.

[16] 王姝, 王昌濤, 于國萍. 羽扇豆蛋白的提取及性質研究[J]. 食品科技, 2012, 37(5): 230-235.

[17] 郭堯君. 蛋白質電泳實驗技術[M]. 北京: 中國科學出版社, 1992: 123-156.

[18] 張相年, 趙樹進, 李超. 蛋白分離技術的應用和進展[J]. 中國藥業, 2006, 15(2): 72-73.

[19] 蔡金星, 劉秀鳳, 常學東, 等. 蠶豆蛋白質提取分離及其物化性質研究[J]. 食品工業科技, 2007, 28(10): 142-144.

[20] 邵佩蘭, 徐明. 提取大豆分離蛋白的工藝研究[J]. 糧油加工與食品機械, 2005(9): 47-48; 51.

[21] 王憲澤. 生物化學實驗技術原理和方法[M]. 北京: 中國農業出版社, 2002.

[22] 李新華, 閆榮. 遼西大扁杏杏仁蛋白的組成及堿法提取工藝的研究[J].食品科技, 2009, 34(5): 132-135.

[23] 李順靈, 嚴有兵, 李向珍. 食用菜籽蛋白的提取分離及其應用研究[J].食品工業科技, 2007, 28(3): 12-14.

[24] 郭興峰, 陳計巒, 林燕, 等. 熱榨和冷榨核桃餅粕中蛋白質提取及其性質研究[J]. 農業工程學報, 2012, 28(18): 287-292.

[25] 王廷華, 鄒曉莉. 蛋白質理論與技術[M]. 北京: 北京科學技術出版社, 2007.

Optimizing the Extraction of Protein from Cashew Nuts

ZHONG Jun-zhen, DUN Ru-yan, HUANG Zong-lan, LIU Wei, LIU Cheng-mei*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In the present study, cashew nuts were analyzed for main chemical components. A comparative investigation of different extraction methods for protein extraction from cashew nuts was made. The extraction process was optimized with regard to solid-to-liquid (S/L) ratio, solvent pH, extraction temperature and time by single-fact or and orthogonal array designs. The results showed that crude fat was the most abundant component in cashew nuts with a level of 44.13%, which also contained 22.91% carbonhydrates, 19.41% protein, 3.07% water and 2.45%. The best extraction efficiency was achieved using alkali extraction and the best experimental conditions were found to be extraction at 35 ℃ for 1.5 h using an extraction solvent at pH 9 with an S/ L ratio of 1:40 (g/mL). Under the optimized conditions, the yield of protein was 79.0% with a purity of 86.62%. SDS-PAGE analysis showed that the major subunits of cashew nuts protein had a molecular mass of 22 and 26.2 kD, respectively, and 14.1- and 16-kD subunits and a small amount of 67.5- and 88-kD subunits were also observed.

cashew nuts; protein; nutritional components; optimized extraction; sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

TS255.6

A

1002-6630（2014）16-0018-05

10.7506/spkx1002-6630-201416004

2013-10-24

公益性行業（農業）科研專項（201303077）

鐘俊楨（1984—），女，助理研究員，博士，研究方向為食品科學與工程。E-mail：zhongjunzhen@163.com

*通信作者：劉成梅（1963—），男，教授，博士，研究方向為食物資源利用與開發。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn