響應面法優化苦蕎皮中總黃酮超聲波提取工藝

趙 強，索有瑞*，李天才，趙海福，董曉寧

響應面法優化苦蕎皮中總黃酮超聲波提取工藝

趙 強1,2，索有瑞1,*，李天才1，趙海福3，董曉寧2

（1.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2.天水師范學院生物工程與技術學院，甘肅 天水 740001；3.甘肅農業大學動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

以苦蕎皮為研究對象，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面試驗設計法，對苦蕎皮中總黃酮提取工藝條件進行研究，并對提取物進行高效液相色譜法檢測。結果表明，影響苦蕎皮中總黃酮含量的因素大小順序為乙醇體積分數、液料比、回流時間、超聲時間，最佳提取工藝為乙醇體積分數65%、液料比14∶1（mL/g）、回流時間1.6 h、超聲時間28 min，苦蕎皮中總黃酮最高含量為1.49520%，高效液相色譜法檢測重復性良好。

苦蕎皮；總黃酮；響應面法；高效液相色譜法

苦蕎，又稱韃靼蕎麥，是一種適合于在冷涼氣候下生長的短季蓼科蕎麥屬雙子葉藥食兼用植物，在我國主要分布于甘肅、四川、云南、貴州等地。苦蕎的性味甘苦、平、寒、有益氣力，有利耳目，降氣寬腸健胃的作用[1-3]。現代醫學表明，苦蕎中富含蛋白質、維 生素、礦物元素等，具有抗氧化、降三高、抗腫瘤等多種藥理活性，其含有極為豐富的生物活性成分——黃酮類化合物，總黃酮含量為普通蕎麥的10～100 倍[3-5]。黃酮類化合物主要是指結構為2-苯基色原酮的一類天然有機化合物，在植物體內通常與糖結合成苷類，小部分以游離態（苷元）的形式存在。近年來，有研究表明食用富含黃酮類的食物還可以降低癌癥的發病率，增強人體免疫力，對糖尿病、高血壓、冠心病、中風等疾病有輔助療效[6]。我國苦蕎常年播種面積約30萬 ha，總產量約30萬 t，資源豐富。苦蕎皮作為苦蕎制粉過程中的副產物，產率約為224 g/kg，亦富含黃酮類化合物，可作為一種廉價而豐富的總黃酮提取材料，具有較好的市場前景[7-8]。

目前，提取總黃酮的方法有恒溫水浴振蕩提取、有機溶劑浸提、堿性水或堿性稀醇提取以及酶法提取等，但這些方法提取時間較長，提取率較低[9]。而超聲波輔助提取則是利用超聲波在液體中的空化作用，加速植物有效成分迅速進入溶劑，從而提高提取效率，縮短提取時間[10-11]。本實驗以苦蕎皮為原料，采用統計軟件Design-Expert中響應面法的Box-Behnken模式，對苦蕎皮中總黃酮的超聲波輔助提取工藝進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦蕎皮（采集于甘肅省天水市農業高新科技園區規范化種植的苦蕎），自然風干。

蘆丁標準品（批號：F20051222） 國藥集團化學試劑公司；95%乙醇、Al(NO3)3、NaOH、NaNO2均為分析純。

1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；RE52-99型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；Q-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UV751GD型紫外-可見分光光度計、FA22048型電子天平上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準工作曲線的繪制

準確稱取0.200 8 g蘆丁標準品，用三重水溶解，移入100 mL容量瓶中定容、搖勻。再次稀釋，得到質量濃度為1.34 mg/L蘆丁標準溶液。分別移取蘆丁標準溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50 mL和5.00 mL，置于50 mL容量瓶中，分別加入10.00 mL蒸餾水、3.00 mL 5% NaNO2溶液，6 min后加入6.00 mL 1% Al(NO3)3溶液，6 min后加入20.00 mL 4% NaOH溶液，15 min后定容、搖勻、靜置。以三重水做空白對照，在510 nm波長處測其吸光度。以質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。

1.2.2 苦蕎皮中總黃酮的制備

準確稱取6.00 g干燥的苦蕎皮，按設計的時間浸泡，在不同的溫度與功率條件下超聲振蕩處理；采用索氏回流法提取苦蕎皮中的總黃酮，將提取液轉入旋轉蒸發儀，減壓濃縮至無醇味，轉入100 mL錐形瓶，加入少許活性炭脫色，靜置過夜，抽濾，將濾液按編號裝入容量瓶，并定容至50 mL，靜置待測定[12]。

1.2.3 苦蕎皮中總黃酮含量的測定

以蘆丁為標準品，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理后，在510 nm波長處測其吸光度，計算苦蕎皮中總黃酮的含量[12-15]。即將待測液2.00 mL于50 mL容量瓶內，分別加入10.00 mL蒸餾水、3.00 mL 5% NaNO2溶液，6 min后加入6.00 mL 1% Al(NO3)3溶液，6min后加入20.00 mL 4% NaOH溶液，15 min后定容、搖勻。以三重水做空白對照，在510 nm波長處，測其吸光度A。對照蘆丁標準曲線，得出提取液中總黃酮質量濃度，最后計算出苦蕎皮提取液中總黃酮含量，其計算公式為：

式中：c為苦蕎中總黃酮質量濃度/（mg/mL）；V為待測液的體積/mL；N為稀釋倍數；m為苦蕎皮的質量/mg。

1.2.4 苦蕎皮中總黃酮的提取工藝

選取乙醇體積分數、液料比、超聲時間、回流時間、浸泡時間、超聲溫度、超聲功率、浸提液pH值8 個因素依次進行單因素輪換提取試驗[10,15]。各因素的水平梯度設置分別為乙醇體積分數35%、50%、65%、80%、95%，液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g），超聲時間15、30、45、60、70 min，回流時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，浸泡時間6、12、18、24、30 h，超聲溫度35、40、45、50、55 ℃，超聲功率200、250、300、350、400 W，浸提液pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。根據單因素試驗結果，采用極差分析法篩選出4 個主要影響因素。然后按照響應面法試驗設計進行苦蕎皮中總黃酮提取工藝優化，最后建立苦蕎皮中總黃酮提取工藝。

1.2.5 響應面試驗因素水平的選擇

采用極差分析對8 組單因素水平進行篩選，最終選用乙醇體積分數、回流時間、超聲時間、液料比4個因素為主要考察因素，進行響應面試驗，按響應面試驗設計進行總黃酮提取，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.6 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測

以蘆丁為標準品，將最佳工藝下提取的苦蕎皮中的總黃酮進行高效液相色譜法測定，并且進行回收率的測定。

1.2.6.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax eclipse XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱箱溫度（30±1）℃；進樣量：20 μL。

1.2.6.2 HPLC測定的工作曲線的繪制

準確配制質量濃度為0.025 0 mg/mL的蘆丁標準液，靜置備用。將其依次配成質量濃度為0.187 5、0.375 0、0.750 0、1.500 0、3.000 0 μg/mL的梯度溶液，進行HPLC檢測。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

根據系列質量濃度梯度的蘆丁標準品在510 n m波長處測得的吸光度，以質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=7.121 4X＋0.029 1，R2=0.999 8（n=8）；在0.01～0.15 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2 單因素篩選試驗

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Results of single-factor experiments

由圖1可知，所選8 個單因素的最佳值條件分別為乙醇體積分數65%、液料比15∶1（mL/g）、超聲時間30 min、回流時間1.5 h、浸泡時間30 h、超聲溫度50 ℃、超聲功率300 W、浸提液pH 8.0。

2.3 苦蕎皮中總黃酮的響應面試驗方案設計及結果

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental designs and results for response surface analysis

采用Design-Expert 7.0分析軟件，利用Box-Behnken設計原理[16-17]，以蘆丁的含量為響應值，以A（乙醇體積分數）、B（回流時間）、C（超聲時間）、D（液料比）4 個因素為自變量，進行響應面試驗。設計四因素三水平（共29 個試驗點，5 個中心點）的響應面試驗，其設計及結果見表2。

表2中共有29 組試驗，其中1～24 組是析因試驗，25～29 組是中心試驗。29 個試驗點分別為析因點和零點；中心試驗進行3 次，中心試驗用以估計試驗的誤差，其中析因點為A、B、C和D所構成的三維空間的頂點，零點為區域的中心點。

2.4 不同因素對苦蕎皮中總黃酮含量的影響

采用SAS RSREG程序對所得數據進行響應面分析，得到4 個因子與苦蕎皮中總黃酮含量之間的模擬回歸方程為：Y=-48.100 9＋0.957 0A＋18.159 2B＋0.372 5C＋1.904 9D＋0.104 4AB＋0.000 1AC＋0.000 8AD-0.095 7BC-0.347 8BD＋0.004 8CD-0.008 9A2-5.773 1B2-0.005 3C2-0.054 5D2。

對該回歸模型進行差異顯著性檢驗及方差分析，其結果見表3所示。

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Analysis of variance for the response surface regression model

由表3中方差分析結果可知模型P=0.041 3（P＜0.05），表明回歸模型達到顯著水平，即各因素自身交互作用影響顯著。但是誤差項不顯著，其決定系數R2=0.853 4，說明該模型與實際情況接近，即試驗誤差小，能充分反映出各因素與響應值之間的關系，因此，可以用該方程對實驗結果進行分析。

由于各種因素之間存在著一定的交互作用，A、B、D和AB、AD、BD呈顯著影響（P＜0.05）；而C、AC、BC、CD均呈不顯著交互作用。從模型中回歸方程系數顯著性檢驗可知：二次項A2（P=0.001 4），D2（P= 0.009 4），即A2、D2為極顯著影響（P＜0.01）達到了極顯著水平；B2（P=0.012 7），C2（P=0.032 7），P值均小于0.05，達到顯著水平。

2.5 苦蕎皮中總黃酮提取的響應面圖分析

圖2 各因素交互作用的等高線圖和響應面圖Fig.2 Contour and response surface graphs for the interactive effect between four factors

根據響應方程繪制的響應面曲面圖和等高線圖，響應面圖形能直觀地反映各因素和它們之間的交互作用對響應值的影響[18-20]。響應面圖形是響應值Y與試驗因素A、B、C、D相對應構成的三維空間曲線圖，具體做法是將2 個因素固定在零水平，然后將剩下的2 個因素交互作用繪制成響應面曲線圖，見圖2。

從各因素之間兩兩相互作用的響應面圖形觀察，各因素間有較為強的交互作用，發現其中曲線走勢越陡，其影響越顯著；曲線走勢越平滑，其影響越小。乙醇體積分數與回流時間、超聲時間、液料比交互作用較為復雜，隨著各因素的水平值增加，總黃酮含量會出現一個峰值；當再次持續升高各水平值時，總黃酮含量又會隨之下降，其坡度相對平緩，說明提取量可以忍受處理條件的變異，但是不經濟，因此仍選取最高點的提取條件為最佳；回流時間與超聲時間和液料比的交互作用，超聲時間和液料比的交互作用同樣較為復雜，但在隨著各因素的水平值的變化，總黃酮含量同樣會出現一個峰值[21-25]。每個因素及其之間的交互作用對總黃酮含量的影響也存在差異，乙醇體積分數、回流時間、液料比、乙醇體積分數和回流時間、乙醇體積分數和液料比、回流時間和液料比對總黃酮含量的影響呈顯著影響（P＜0.05）；而其余的均呈不顯著交互作用。

本實驗中各因素顯著程度依次為乙醇體積分數（P=0.014 2）＞回流時間（P=0.032 1）＞液料比（P=0.041 1）＞超聲時間（P=0.715 7）。使用Design-Expert軟件分析優化得到苦蕎皮中總黃酮最佳模擬提取工藝為乙醇體積分數64.72%、液料比14.18∶1（mL/g）、回流時間1.59 h、超聲時間28.12 min，在此工藝條件下，苦蕎皮中總黃酮含量為1.49700%。考慮到實際操作過程中的局限性，對影響苦蕎皮中總黃酮含量的的因素加以修正，修正后的工藝條件為乙醇體積分數65%、液料比14∶1（mL/g）、回流時間1.6 h、超聲時間28 min，在該工藝條件下，苦蕎皮中總黃酮含量為1.49270%。在該工藝條件下進行3 次平行實驗，結果分別為1.494 30%、1.498 50%、1.492 90%，取其平均值為1.495 20%，與理論值誤差為0.018 0%，說明響應面法優化模型能較好地預測苦蕎皮中總黃酮含量，所得工藝條件比較可靠。

2.6 HPLC檢測結果

在實驗設定的色譜條件下，將蘆丁標準品和在優化條件下提取的苦蕎皮中總黃酮進行HPLC檢測，其結果見圖3。

圖3 蘆丁標準品（A）和樣品（B）HPLC檢測結果Fig.3 HPLC profiles of rutin standard (A) and sample (B)

由圖3可知，將蘆丁標準系列得到的標準曲線為色譜峰面積Y，對進樣質量濃度進行線性回歸分析可得：Y=70.299 0X-8.709 9，R2=0.999 7，0.375～25 μg/mL；蘆丁標準品保留時間為9.625 min，范圍為9.310～11.032 min。優化條件下提取的苦蕎皮中總黃酮在9.457 min時出峰，峰形對稱，與標樣接近。平均回收率為99.58%、相對標準偏差為2.40%，表明HPLC檢測精密度良好、重復性較好。

3 結 論

我國富產苦蕎，但其利于目前仍局限于苦蕎粉、苦蕎掛面、苦蕎茶等食品加工，苦蕎皮主要作為枕心充填物和肥料使用，在對其總黃酮提取利用方面的研究還比較欠缺，尤其是對苦蕎皮中總黃酮的響應面法提取工藝研究不多，通過本實驗的數據分析，可以尋找到一種最有效的提取工藝，為苦蕎皮資源的開發和研究提供實驗數據[18]。在影響苦蕎皮總黃酮提取工藝的各實驗步驟中，采用乙醇-索氏抽提影響效果最為顯著。在總黃酮提取劑中，從操作難易程度和成本角度考慮，雖然甲醇極性比乙醇大，沸點比乙醇低，但因甲醇有毒且不經濟，丙酮揮發性較乙醇大，故選用乙醇作為總黃酮提取劑，其提取效果理想且相對安全。采用超聲波振蕩輔助索氏回流提取法，可使得植物細胞壁及整個植物體在瞬間被破碎，有效地加快了總黃酮溶解度，縮短了提取時間，提高了總黃酮得率，且操作簡單易行。通過響應面法優化苦蕎皮中總黃酮最佳提取工藝參數為乙醇體積分數65%、液料比14∶1（mL/g）、回流時間1.6 h、超聲時間28 min，通過HPLC檢測進一步驗證了響應面法提取工藝的可靠性，并對提取物含量做了進一步準確測定，在該工藝條件下，苦蕎皮總黃酮含量為1.495 20%。

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Optimization by Response Surface Methodoloy of Ultrasonic Extraction of Total Flavonoids from Tartary Buckwheat Hull

ZHAO Qiang1,2, SUO You-rui1,*, LI Tian-cai1, ZHAO Hai-fu3, DONG Xiao-ning2
(1. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810001, China; 2. College of Bioengineering and Technology, Tianshui Normal University, Tianshui 740001, China; 3. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The ultrasonic extraction of total flavonoids from tartary buckwheat hull was optimized by response surface analysis with Box-Behnken design, and the flavonoid extract obtained was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the extraction effi ciency of total fl avonoids was affected in decreasing order by ethanol concentration, liquid-to-solid ratio, refl uxing time and ultrasonication time, for which the optimal conditions were 65%, 14:1 (mL/g), 1.6 h and 28 min, respectively. Under the optimized conditions, the yield of total fl avonoids was 1.495 20%. The HPLC method used in this study was found to be highly repeatable.

tartary buckwheat hull; total flavonoids; response surface methodology; high performance liquid chromatography (HPLC)

TS202.3

A

1002-6630（2014）16-0064-07

10.7506/spkx1002-6630-201416012

2013-09-10

2013年甘肅省科技計劃資助項目（1308RJZE305）

趙強（1982—），男，副教授，博士后，研究方向為西北特色生態經濟植物資源利用與開發。

E-mail：zhaoq2000@163.com

*通信作者：索有瑞（1960—），男，研究員，博士，研究方向為天然藥物化學。E-mail：yrsuo@nwipb.cas.cn