肉鴨表皮組織中脫氫樅酸殘留的SPE-HPLC檢測方法

張蘇珍，耿志明*，王道營，諸永志，劉 芳，張牧焓，卞 歡，徐為民

肉鴨表皮組織中脫氫樅酸殘留的SPE-HPLC檢測方法

張蘇珍1,2，耿志明2,*，王道營2，諸永志2，劉 芳2，張牧焓2，卞 歡2，徐為民2

（1.南京農業大學 肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農業科學院農產品 加工研究所，江蘇 南京 210014）

建立經松香脫毛處理的肉鴨表皮組織中殘留脫氫樅酸的固相萃取-高效液相色譜檢測方法。肉鴨表皮組織中的脫氫樅酸用乙腈提取，經C18固相萃取小柱凈化，以0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇（13∶87，V/V）為流動相，采用反相C18（25 0 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離，以紫外檢測器（檢 測波長212 nm）進行檢測。結果表明：該方法檢測脫氫樅酸線性范圍 為0.1～10 mg/L，檢測限為0.10 μg/g，定量限為0.33 μg/g。在 低中高3 個添加量范圍內回收率為80.8%～91.8%。實際樣品分析顯示，肉鴨表皮中脫氫樅酸含量最高達10.06 μg/g。所建立的分析方法簡便快捷、具有較好的靈敏度和可靠性，可用于肉鴨表皮組織中脫氫樅酸殘留量的分析。

肉鴨；松香；脫氫樅酸；高效液相色譜法；固相萃取

脫氫樅酸（亦稱脫氫松香酸）是松香的主要成分之一。松香中的樅酸和脫氫樅酸是人們熟知的肺和皮膚致敏劑，可以導致職業哮喘和接觸過敏[1]，它們的氧化產物被認為是重要的皮膚過敏源[2]。樅酸和脫氫樅酸可以損傷水生生物的DNA活性[3]，對水蚤的生長發育有一定的限制作用[4]。細胞毒理學研究表明脫氫樅酸對人體紅細胞、多核白細胞有毒性作用[5-9]。脫氫樅酸和樅酸一樣，廣泛存在于紙漿、造紙 廠廢液[10]以及藥劑[11-15]、化妝品[16]和工業品中[4]，在食品包裝材料中也存在有相當濃度的脫氫樅酸和樅酸[17]。脫氫樅酸和樅酸的分析方法主要包括氣相色譜法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）。采用氣相色譜法方法時，樣品中的脫氫樅酸和樅酸必須通過衍生化反應轉變為甲酯形式，樣品處理繁瑣、重現性較差[18-19]。HPLC法分析脫氫樅酸和樅酸，無需進行衍生化反應，因而HPLC結合紫外檢測器、二極管陣列檢測器、熒光檢測器以及質譜越來越多地應用于不同樣品基質的脫氫樅酸和樅酸含量分析[13,20-23]>。

松香加熱后具有良好的黏附性，在我國曾被廣泛用于鴨、鵝等水禽加工中的二次脫毛工序。2009年，我國頒布實施《食品安全法》，禁止在畜禽加工過程中使用松香。但是，由于GB/T 2760—2007《食品添加劑使用衛生標準》中允許使用的松香甘油酯脫毛效果不理想、且成本高，少數水禽加工作坊仍然非法采用松香用于鴨、鵝等脫毛加工，導致樅酸、脫氫樅酸殘留在鴨、鵝的表皮組織中，給消費者帶來嚴重的健康隱患。

為了研究松香主要成分在采用松香脫毛的鴨、鵝中的殘留，本課題組在前期研究中已建立了鴨表皮組織中樅酸的殘留含量的測定方法[24]。與樅酸相比，脫氫樅酸（圖1）具有更強的極性和不同的最佳紫外吸收波長。本研究在建立樅酸檢測方法的基礎之上，通過固相萃取法對樣品進行凈化，采用高效液相色譜法對脫氫樅酸進行檢測分析，建立了肉鴨表皮組織中脫氫樅酸的定量檢測方法。本方法具有操作便捷、靈敏度高、自動化程度高等優點，可用于經松香脫毛處理的水禽中脫氫樅酸殘留的分析檢測。本實驗建立的方法可以和前期建立的樅酸殘留檢測方法互為驗證，共同用于監控肉鴨加工中松香的非法使用、以及流通環節中違法使用松香脫毛肉鴨的鑒別。

圖1 脫氫樅酸分子結構Fig.1 Molecular structure of dehydrogenated abietic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰性和陽性樣本，肉鴨來自農貿市場，宰殺后分別采用人工脫毛（陰性樣本）和松香脫毛（陽性樣本）；實際肉鴨樣本分別來源于畜禽屠宰加工企業F和附近一家農貿市場。所有樣本取不同部位表皮組織，切碎，混合均勻，于-20 ℃條件下保存。

脫氫樅酸標準品（純度95%） 加拿大CSC公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Tedia公司；其余試劑為分析純；水由Millipore純水儀制備；C18固相萃取（solid phase extraction，SPE）小柱 美國Supelco公司。

標準溶液儲備液以及工作溶液配制：稱取適量脫氫樅酸標準品，用甲醇溶解，配制100 mg/L脫氫樅酸儲備液。用移液管吸取適量標準儲備溶液，用流動相（0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇，13∶87，V/V）稀釋配制質量濃度為0.1、0.5、1、2、5、10 mg/L的脫氫樅酸系列工作溶液。

1.2 儀器與設備

Ultimate-3000高效液相色譜戴安（配有VWD-3000紫外（ultraviolet detector，UV）檢測器、Chromeleon色譜管理系統軟件）、LPG-3400SD四元分析泵、WPS-3000SL自動進樣器 美國Dionex公司；Xtimate C18色譜柱 美國Welch公司；Biofuge stratus高速離心機 德國Heraeus公司；HS2060A超聲波振蕩器 常州國華電器有限公司；PX-12固相萃取裝置 天津譜祥科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

樣品處理參照文獻[24]方法。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇（13∶87，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：212 nm；進樣量：20 μL。

1.3.3 精密度實驗

稱取充分混合均勻的陽性樣品7 份，按照上述樣品處理方法處理、并進行HPLC測定，以測定的結果計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4 回收率實驗

稱取陰性表皮樣品1 g于10 mL離心管中，分別添加不同量脫氫樅酸標準溶液（5 mg/L），并在室溫條件下放置1 h（使脫氫樅酸滲透至樣品中）。按照上述樣品處理方法處理、并進行HPLC測定，以測定的脫氫樅酸量和添加量之比計算回收率。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

脫氫樅酸在200 nm有最大吸收峰[13]，此外在276 nm波長處有次強吸收峰，但強度比200 nm波長處收弱得多[25]。在采用HPLC-UV進行分析時，在200 nm分析目標物會受到樣品基質的干擾，通常適當增加檢測波長，以獲得理想的靈敏度和選擇性。為了獲得最佳檢測波長，本實驗采用多波長UV檢測器同時觀察了脫氫樅酸標準溶液和陽性樣本在212、224、268、276 nm的吸收。隨著波長的增加，脫氫樅酸吸收強度急劇下降，1 mg/L的標準溶液4波長處的信噪比分別為78、52、12和16。由于采用SPE凈化手段，4 波長處樣品基質對脫氫樅酸的干擾均比較少。本方法選擇212 nm為檢測波長，在此波長處脫氫樅酸與基質干擾峰達到基線分離，具有最好的靈敏度（圖2）。

圖2 樣品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of samples

脫氫樅酸和樅酸是二萜類化合物，但脫氫樅酸具有更強的極性。流動相由0.003 mol/L磷酸溶液和甲醇組成，在實驗中觀察二者比例對脫氫樅酸在反相C18色譜柱上保留時間的影響，結果表明流動相中甲醇比例顯著影響脫氫樅酸保留時間，流動相中甲醇比例在12%～15%范圍內，脫氫樅酸有較適中的保留時間。實驗中還觀察溫度、流速對脫氫樅酸在C18柱上的保留行為的影響，二者對脫氫樅酸的保留時間有一定影響，但對檢測靈敏度影響不大。最終確定的最佳色譜條件為流動相0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇（13∶87，V/V）、流速1 mL/min、柱溫25 ℃、檢測波長212 nm，在此條件下，脫氫樅酸保留時間約12.40 min，與基質干擾可以基線分離。

2.2 方法的線性范圍、檢測限和定量限

本實驗建立的方法通過標準曲線、以外標法定量樣品中的脫氫樅酸含量。以脫氫樅酸系列工作溶液的質量濃度 為橫坐標X，相應的峰面積為縱坐標Y，得回歸方程Y = 0.682 2X＋0.170 5，線性相關系數R2= 0.999 1。由此可見在0.1～10 mg/L范圍內，脫氫樅酸質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。按照3倍信噪比（RSN=3）和10倍信噪比（RSN=10）計算方法的檢測限和定量限，分別為0.10 μg/g和0.33 μg/g。

2.3 方法的精密度和回收率

為了驗證本實驗建立的肉鴨表皮組織中脫氫樅酸含量檢測方法，本實驗采用松香脫毛的肉鴨為陽性樣本、人工脫毛的肉鴨為陰性樣本，分別進行精密度和添加回收實驗（表1）。其中，陽性肉鴨表皮組織中脫氫樅酸含量為2.69 μg/g（檢測值分別為2.73、2.75、2.71、2.75、2.71、2.66、2.53 μg/g），精密度實驗RSD為2.83%；在不同水平的陰性樣品添加回收實驗中，脫氫樅酸的回收率為80.8%～91.8%。結果表明，本實驗建立的肉鴨表皮組織中脫氫樅酸含量檢測方法具有良好的重復性和準確性。

表1 脫氫樅酸不同添加水平回收率測定結果（n=3）Table 1 Recoveries of dehydrogenated abietic acid spiked at different levellss (n=3)

2.4 實際樣品分析

為了進一步驗證本實驗建立的肉鴨表皮組織中脫氫樅酸含量檢測方法，本實驗分析了來源于畜禽屠宰加工企業（F）和農貿市場的15個肉鴨樣本表皮組中的脫氫樅酸含量，結果列于表2。

表2 實際樣品分析結果（n=3）Table 2 Contents of dehydrogenated abietic acid in commercial sampleess (n=3)

畜禽屠宰加工企業（F）5 個樣品中均發現含有脫氫樅酸，含量范圍0.96～10.06 μg/g，陽性率100%；農貿市場的10 個樣品中7 個檢出脫氫樅酸，含量范圍0.76～6.62 μg/g，陽性率70%。從檢出的脫氫樅酸含量看，變化范圍較大，應該與生產加工過程中脫毛劑配方中松香含量、以及脫毛工藝（溫度、時間）有關，這一檢測結果也與前期的研究結果基本一致[18]。這一分析結果進一步說明，雖然我國在2009年明令禁止使用松香進行畜禽加工脫毛，但仍有相當多的企業在違法使用松香進行水禽脫毛加工。除了加工企業片面最求利益外，監管部門缺乏相關監測分析手段也是造成這一現象的重要原因。因此，在進一步宣傳相關從業企業、人員遵紀守法外，加強水禽生產加工過程中非法使用脫毛劑的監管、以及流通環節中肉鴨等產品中樅酸、脫氫樅酸的檢測，對于杜絕松香脫毛肉鴨進入百姓餐桌、保護消費者身體健康尤為重要。

3 結 論

本實驗建立了肉鴨表皮組織中脫氫樅酸含量的檢測方法，樣品中的脫氫樅酸經乙腈超聲波提取、C18SPE小柱凈化，然后以0.003 mol/L磷酸溶液-甲醇（13∶87，V/V）為流動相、在反相C18柱上進行分離，用UV檢測器在212 nm進行檢測。線性范圍0.1～10 mg/L，最低檢測限和定量限分別為0.10 μg/g和0.33 μg/g。精密度和添加回收實驗表明，建立的肉鴨表皮組織中脫氫樅酸含量的檢測方法，具有良好的重現性和準確性。畜禽加工企業及農貿市場的實際肉鴨樣本中脫氫樅酸含量的分析結果表明，仍然有畜禽加工企業違法利用松香進行水禽脫毛。本實驗建立的肉鴨表皮中脫氫樅酸的高效液相色譜檢測方法，可以和前期建立的樅酸殘留檢測方法互為驗證，同時用于生產過程中違法使用松香的監管、以及流通環節中肉鴨等產品中脫氫樅酸的檢測，對于確保肉鴨制品質量安全具有一定的技術參考意義。

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Development of SPE-HPLC Method for Determination of Dehydrogenated Abietic Acid Residue in Duck Skin Tissue

ZHANG Su-zhen1,2, GENG Zhi-ming2,*, WANG Dao-ying2, ZHU Yong-zhi2, LIU Fang2, ZHANG Mu-han2, BIAN Huan2, XU Wei-min2
(1. Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

A high-performance liquid chromatographic (HPLC) method was established to determine dehydrogenated abietic acid in duck skin. Dehydrogenated abietic acid in duck skin sample was extracted with acetonitrile, followed by purifi cation with a C18solid-phase extraction (SPE) cartridge, and detected by HPLC-ultraviolet detector (UV). The chromatographic conditions were as follows: column, reversed-phase C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm); mobile phase, a mixture of 0.003 mol/L phosphoric acid-methanol (13:87, V/V); fl ow rate, 1.0 mL/min; and detection wavelength, 212 nm. Results indicated that the linearity ranged from 0.1 to 10.0 mg/L, and the detection limit and the quantifi cation limit were 0.10 μg/g and 0.33 μg/g, respectively. The recoveries of dehydrogenated abietic acid spiked at 0.5-20 μ g/g were in the range of 80.8%-91.8%. The method was successfully applied for the determination of dehydrogenated abietic acid in rosin-defeathered duck skin, and the result indicated that content of dehydrogenated abietic acid in th e duck sample could reach 10.06 μg/g. The present method proved to be of high maneuverability and excellent sensitivity and accuracy, and could be employed to analyze dehydrogenated abietic acid residue in duck skin tissue.

duck; rosin; dehydrogenated abietic a cid; high-performance liquid chromatographic (HPLC); solid polymer electrolyte (SPE)

TS201.5

A

1002-6630（2014）16-0101-04

10.7506/spkx1002-6630-201416019

2013-08-28

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101312）；江蘇省農業科技自主創新資金項目（CX(13)3081）

張蘇珍（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：xsdzsz@126.com

*通信作者：耿志明（1965—），男，副研究員，碩士，研究方向為食品化學。E-mail：zmgeng@163.com