紫外光譜結合歐氏距離和主成分分析法快速鑒別牛肝菌

楊天偉，李 濤，張 霽，李杰慶，劉鴻高，王元忠,*

紫外光譜結合歐氏距離和主成分分析法快速鑒別牛肝菌

楊天偉1，李 濤2，張 霽3，李杰慶1，劉鴻高1，王元忠3,*

（1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.玉溪師范學院資源環境學院，云南 玉溪 653100；3.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650223）

采用紫外光譜技術建立快速鑒別不同產地、種類食用牛肝菌的方法。通過確定最佳提取試劑（0.5 mol/L NaOH溶液），最適稱樣量（0.100 0 g）和最佳提取時間（40 min），制備牛肝菌樣品測試液；采用夾角余弦、歐氏距離和主成分分析法對牛肝菌樣品的指紋圖譜進行相似度比較。結果表明，牛肝菌樣品NaOH提取液在10 h內穩定性相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在0.06%～2.33%之間，重復性RSD在0.09%～1.81%之間，精密度RSD在0.11%～1.92%之間。樣品間的 夾角余弦值最大為0.999、最小為0.823，夾角余弦值相差較小，不適于鑒別牛肝菌。歐氏距離最大值為873.17，最小值為31.36，樣品間距離差異明顯；主成分分析的前3 個主成分累積貢獻率達到93.626%，能夠反映樣品的主要信息，說明歐氏距離和主成分分析法可用于不同產地、種類牛肝菌的快速鑒別和質量控制。

紫外光譜；牛肝菌；夾角余弦；歐氏距離；主成分分析；鑒別

牛肝菌為肉質中大型真菌，是菌物界中大型擔子菌的重要類群[1]，也是目前最具經濟價值、應用前景較廣闊的真菌之一[2]。我國牛肝菌種質資源非常豐富，種類多達390 種以上，其中199 種可食用；云南是我國牛肝菌種類較為豐富的地區之一，已知牛肝菌種類有224 種，其中可食用的有144 種[1]，分別約占我國牛肝菌種類的57.4%和72.3%。牛肝菌子實體味道鮮美，富含蛋白質、氨基酸、維生素、多糖類物質和鈣、磷、鐵等多種礦質元素[3-7]，其中多糖和堿性蛋白提取物具有增強人體免疫力，抗腫瘤、抗病毒等功能[8-9]。

長期以來，人們對如此眾多復雜的牛肝菌種類憑借經驗，根據牛肝菌的外表特征、生長特性、孢子型貌等理化指標和色、香、味等感官指標來進行分類及品質評價[10]。然而很多牛肝菌外表型貌極其相似，如茶褐牛肝菌（Boletus brunneissimus）和深褐牛肝菌（Boletus obscureumbrinus）[11]，依靠感官不易作出正確的分類和評價。尤其是經過烘干的牛肝菌很難通過以上方法作出種類的判斷，難以鑒別；部分不良商販為獲取利潤將不同品質、種類的牛肝菌混合出售，甚至收購有毒牛肝菌，如類鉛紫粉牛肝菌（Tylopilus plumbeoviolaceoides）干燥后混入其他可食牛肝菌中出售[11]。因此，尋求能夠快速、準確鑒別牛肝菌種類及作出品質評價的方法顯得重要。目前，對食用菌種類鑒別的研究主要集中在紅外光譜法，如周在進等[10,12]利用傅里葉變換紅外光譜結合分層抽樣、聚類分析等方法對牛肝菌科、雞油菌科和紅菇科的幾種不同屬蘑菇進行鑒別研究；劉剛等[13]根據食用菌傅里葉變換紅外光譜的峰形、峰高等特征對部分食用菌進行了鑒別研究，但這種鑒別需要具有豐富的經驗，難以形成完整的鑒別體系。

紫外指紋圖譜技術是一種靈敏可靠、簡便快速的檢測技術，其原理是不同物質體系成分的含量及不飽和程度不同，導致其紫外吸收光譜曲線的峰形、峰高、峰面積有一定的差異[14]。將不同物質體系紫外吸收圖譜的指紋特性進行比較，即可對物質體系進行分析與鑒別[15]。紫外指紋圖譜技術已被廣泛用于中藥鑒別[16]、真假酒鑒別[17]、食品質量控制[18-19]等多個領域，而在食用牛肝菌種類鑒別方面的應用尚未見報道。本實驗采用紫外光譜法測定了14 種采自云南不同產地、不同種類食用牛肝菌的紫外圖譜，對所得圖譜進行3 組平均、八點平滑和一次微分處理校準和消除干擾，用夾角余弦、歐氏距離和主成分分析（principal component analysis，PCA）法，對牛肝菌樣品紫外指紋圖譜進行相似度評價和鑒別分析。為快速、準確鑒別不同產地、不同種類食用牛肝菌和牛肝菌品質評價提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

14 種牛肝菌樣品采于2012年7月，來源見表1，經云南農業大學農學與生物技術學院劉鴻高教授鑒定。

表1 樣品名稱與來源Table 1 Specices and sources of bolete samples

1.2 試劑與儀器

氫氧化鈉、氯仿（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；無水乙醇（分析純） 云南汕滇藥業有限公司。

UV-2550雙通道紫外-可見分光光度計（配有UV probe工作站） 日本島津公司；KQ5200型超聲波清洗機 昆明市超聲儀器有限公司；AR1140型萬分之一分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FW-100型高速粉碎機 天津市華鑫儀器廠；100目標準篩盤浙江上虞市道墟五四儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紫外光譜測試液制備及測定條件

樣品采集后，清洗干凈，50 ℃烘干，粉碎、過100 目篩，保存于自封袋中備用。準確稱取0.100 0 g牛肝菌樣品于25 mL比色管中，加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，超聲提取40 min，經三層濾紙過濾得NaOH提取液。以0.5 mol/L NaOH溶液為參比液進行紫外指紋圖譜測定，設定掃描波長為190～600 nm，重復3 次，狹縫1.0 nm，采樣間隔0.2 nm。

1.3.2 紫外光譜處理

對NaOH提取液所測得的原始光譜進行3 組總平均，8 點平滑和1 次微分處理，以消除噪音干擾和基線漂移，提高光譜分辨率，使圖譜清晰[16]。

1.3.3 紫外指紋圖譜相似度評價

紫外指紋圖譜的相似度是指圖譜的整體相關性，參考色譜指紋圖譜相似度評價方法，把紫外指紋圖譜的重疊率和共有峰的峰強度相結合[20]，應用Excel 2007軟件和SPSS 17.0軟件處理實驗數據，分別用以下3 種方法分析圖譜整體相關性。

夾角余弦法：將第i個樣品的n個測定值（x1i, x2i, …, xni）和第j個樣品的n個測定值（x1j, x2j, …, xnj）作為n維向量空間的兩個向量，這兩個向量夾角的余弦值為兩個樣品的相似系數；當余弦值接近1時兩樣品相似度高，當余弦值接近0時兩個樣品差別較大[21]。以每個樣品圖譜吸收波長計算夾角余弦值，其計算公式為（1）[21]。

歐氏距離法：歐氏距離能反映樣品間的親疏程度，距離越小相似度越大，距離越大的相似度越小，樣品差異越大。以每個樣品圖譜吸收波長計算歐氏距離計算公式為（2）[21]。

式（1）、（2）中：Cij為夾角余弦；dij為歐式距離；Xik為第i個供試品的n個測定值（x1i, x2i, …, xni）；Xkj為第j個供試品的n個測定值（x1j, x2j, …, xnj）。

主成分分析法：主成分分析法是將多個指標綜合為少數幾個指標，用幾個綜合因子（主成分）來替代多個原始變量，使這些綜合因子盡可能地反映原始變量的信息，簡化分析過程[21]。

2 結果與分析

2.1 牛肝菌特征成分提取條件的確定

2.1.1 最優提取溶劑的選擇

以樣品3為考察對象，準確稱取0.100 0 g樣品分別加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液、無水乙醇、氯仿、蒸餾水，每組平行3 次；超聲提取30 min后用3 層濾紙過濾，經190～600 nm紫外光譜測定，以圖譜吸收峰數考察不同溶劑對牛肝菌提取率的響應。不同溶劑提取的紫外指紋圖譜見圖1，從圖1可知，用氯仿提取的紫外吸收峰數目最少，用NaOH提取牛肝菌紫外吸收峰數明顯多于其他溶劑提取的吸收峰數。

圖1 不同溶劑提取牛肝菌的紫外指紋圖譜Fig.1 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 extracted with different solvents

圖2 不同NaOH濃度提取牛肝菌的紫外指紋圖譜Fig.2 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 extracted with different concentrations of NaOH

準確稱取0.100 0 g樣品分別加入10 mL 0.1、0.5、1.0、1.5 mol/L NaOH溶液，超聲提取30 min后用3 層濾紙過濾，進行紫外光譜測定，考察不同NaOH濃度對牛肝菌樣品提取率的影響。由圖2可看出，不同NaOH濃度對牛肝菌樣品的提取效果有一定影響，0.1 mol/L NaOH提取液測得的紫外光譜吸收峰數較少，吸光度小；0.5 mol/L NaOH提取液測得的紫外吸收峰數較多，且吸光度適中，所以用0.5 mol/L NaOH溶液作為提取溶劑。

2.1.2 最適稱樣量的確定

以樣品3為考察對象，準確稱取0.100 0、0.150 0、0.200 0、0.300 0 g樣品分別加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，超聲提取30 min，3 層濾紙過濾，進行紫外光譜測定。由圖3可知，不同稱樣量的紫外吸收峰數基本一致，故選取0.100 0 g為實驗稱樣量。

圖3 不同稱樣量的牛肝菌紫外指紋圖譜Fig.3 UV fingerprint spectra of boletes sample No.3 with different sample sizes

2.1.3 最佳提取時間

圖4 不同提取時間的牛肝菌紫外指紋圖譜Fig.4 UV fingerprint spectra of boletes samples with different extraction times

以樣品3為考察對象，準確稱取0.100 0 g樣品，加入10 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，分別超聲提取20、30、40、60 min，3 層濾紙過濾，進行紫外光譜測定。由圖4可看出，提取20 min時牛肝菌樣品的紫外吸收峰主要集中在190～350 nm波長范圍內；提取40 min時吸收峰數較多，因此，選擇40 min為超聲提取時間。

2.2 重復性、精密度和穩定性實驗

以樣品3為考察對象，稱取0.100 0 g樣品5 份，同1.3.1節制取測試液并進行紫外光譜掃描，光譜數據經1.3.2節處理后以吸收波長計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在0.09%～1.81%之間，表明該方法重復性好。

取一份樣品3的提取液重復測定10 次，光譜數據經1.3.2節處理后以吸收波長計算的RSD在0.11%～1.92%之間，表明該方法精密度良好。

取一份樣品3提取液分別在2、4、6、8、10 h時進行紫外光譜測定，光譜數據經1.3.2節處理，以吸收波長計算的RSD在0.06%～2.33%之間，表明制備液在10 h內穩定。

2.3 不同產地、種類食用牛肝菌紫外指紋圖譜分析

圖5 0.5 mol/L NaOH溶液提取的14 種牛肝菌的紫外指紋圖譜Fig.5 UV fingerprint spectra of 14 sp ecies of boletes extracted with 0.5 mol/L NaOH (numbered 1 through 14, the same below)

由圖5可以看出，牛肝菌樣品紫外圖譜在190～370 nm波長范圍內圖譜重疊率較高，在370～500 nm波長范圍內圖譜重疊率低；每個牛肝菌樣品都具有多個特征吸收峰，表現出指紋特性，有利于牛肝菌樣品的鑒別分析。

圖6 同一產地不同種類牛肝菌紫外指紋圖譜Fig.6 UV fingerprint spectra of different species of boletes from the same area

圖7 同一種類不同產地牛肝菌紫外指紋圖譜Fig.7 UV fingerprint spectra of the same species of boletes from different areas

由圖6、7可知，同一產地不同種類和同一種類不同產地牛肝菌樣品紫外圖譜的峰形、峰高等都具有差異，表現出明顯的指紋特性，這可能與氣候條件、土壤環境等多種生態因子及不同牛肝菌種類之間差異有關。

2.4 牛肝菌紫外指紋圖譜相似度評價

2.4.1 夾角余弦法

表2 樣品間的夾角余弦值Table 2 The included angle cosine between different samples

由表2可知，夾角余弦為0.999的有7 組，分別是1∶3（樣品1與樣品3之間的夾角余弦，下同）、1∶4、3∶4、4∶11、6∶7、6∶14和12∶14，表明這7組中兩個樣品間相似度較高，難以區分。夾角余弦值最小的是9∶14，為0.823，表明兩個樣品差別大；樣品9與其他樣品夾角余弦值均在0.900以下，該樣品易于區分；同一產地不同物種和同一物種不同產地之間夾角余弦值除1∶3為0.999外，其余都在0.949～0.900之間，樣品不易區分開；因此，夾角余弦法對于準確鑒別不同產區、不同種類牛肝菌樣品具有一定局限性。

2.4.2 歐氏距離法

表3 樣品間的歐氏距離Table 3 The Euclidean distance between different samples

由表3可知，樣品間距離最大的是9∶13（樣品9與樣品13之間的歐氏距離，下同），為873.17，樣品9與其他樣品間的歐氏距離都十分明顯，表明，樣品9最易于區分，這與夾角余弦法結論一致；歐氏距離最小的是6∶14，為31.36；同一產地不同種類牛肝菌之間的歐氏距離1∶2、1∶3、2∶3分別為310.72、48.64和320.36，表明同一產地不同種類牛肝菌具有一定差異；同一種類不同產地牛肝菌樣品間的歐氏距離2∶8、2∶13、8∶13分別為482.72、344.61和475.64，表明同一種類在不同的環境條件下營養成分及含量具有較大差異，這與2.3節中紫外指紋圖譜反映的信息一致。樣品間的歐氏距離具有較大差異，能直觀地體現樣品間差異性，可用于不同產地、種類牛肝菌樣品快速鑒別。

2.4.3 主成分分析法

表4 主成分的特征根及貢獻率Table 4 Characteristic values and contribution rates of three first principal components

圖8 牛肝菌樣品主成分分析的三維圖Fig.8 Three-dimensional diagram of bolete samples by PCA

圖9 牛肝菌樣品前兩個主成分分析的二維圖Fig.9 Two-dimensional diagram of bolete samples by PCA (PC1-PC2)

用SPSS 17.0軟件對14 種不同產地、種類食用牛肝菌樣品進行主成分分析，前3 個主成分的特征值和貢獻率見表4。由表4可看出，主成分1的累積貢獻率為77.741%，是牛肝菌樣品最重要的成分；前兩個主成分的累積貢獻率為87.07%（大于85%），前3 個主成分的累積貢獻率為93.626%（大于85%），分別能夠表達牛肝菌樣品紫外指紋圖譜全部信息的87.07%和93.626%。以PC1、PC2、PC3構成不同產地、種類牛肝菌主成分的三維投影圖，見圖8。由圖8可看出，樣品6與樣品14重疊在一起，此外，有部分樣品表現成分相似或相近，難以區分所有牛肝菌樣品。比較發現，由PC1、PC2構成的二維圖中（圖9），樣品9與其他樣品化學成分差異明顯，樣品6與樣品14主成分差異較小；樣品間無重疊現象。主成分分析法能夠反映出不同產地、種類牛肝菌樣品成分差異，可用于牛肝菌樣品鑒別和品質評價。

3 結 論

通過單因素試驗確定牛肝菌特征成分的提取條件：最佳提取溶劑（0.5 mol/L NaOH溶液），最適稱樣量（0.100 0 g）和最佳提取時間（40 min）以建立牛肝菌的紫外指紋圖譜；分析得出牛肝菌樣品的重復性、精密度和穩定性的RSD分別在0.09%～1.81%、0.11%～1.92%、0.06%～2.33%之間，表明該方法具有可靠性。不同產地、種類食用牛肝菌樣品紫外光譜曲線具有明顯的指紋特性，采用夾角余弦、歐氏距離和主成分分析法進行相似度分析，結果表明3 種分析方法在一定程度上能反映不同產地、種類牛肝菌的特征，但夾角余弦法用于鑒別牛肝菌有一定局限性；歐氏距離法和主成分分析法能較好地反映牛肝菌樣品間的差異性，可用于不同產地、種類牛肝菌的快速鑒別和質量控制。紫外指紋圖譜分析鑒別技術顯示不同產地、種類食用牛肝菌的成分有明顯差異，這可能與氣候條件、土壤環境等多種生態因子及種間差異有關，今后對食用牛肝菌鑒別分類的研究可以綜合考慮生態因子、種間差異的影響。

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Rapid Identification of Bolete Mushrooms by UV Spectroscopy Combined with Euclidean Distance and Principal Component Analysis

YANG Tian-wei1, LI Tao2, ZHANG Ji3, LI Jie-qing1, LIU Hong-gao1, WANG Yuan-zhong3,*
(1. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. College of Resources and Environment, Yuxi Normal University, Yuxi 653100, China; 3. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China)

In this study, an ultraviolet (UV) spectroscopic method was established for rapid identification of different species of bolete mushrooms from different areas. For preparation of boletes extracts, the optimal extraction extraction solvent, sample amount and extraction time were determined as 0.5 mol/L NaOH, 0.100 0 g and 40 min, respectively. The similarity of UV spectral fingerprint of bolete samples was analyzed by included angle cosine (IAC), Euclidean distance (ED) and principal component analysis (PCA). The results showed that, within 10 h, the RSDs of stability, repeatability and accuracy for bolete extracts were 0.06%-2.33%, 0.09%-1.81% and 0.11%-1.92%, respectively. The difference of IAC values among samples was small, ranging from 0.823 to 0.999. But the difference of ED values among samples was large, ranging from 31.36 to 873.17. PCA showed that the cumulative contribution rate of the first three factors was 93.626%, which could reflect most information about the samples. These findings suggested that the ED and PCA methods can be used for rapid identification and quality control of different specices of boletes from different areas.

ultraviolet spectroscopy; bolete; included angle cosine; Euclidean distance; principal component analysis; identification

TS201.2

A

1002-6630（2014）16-0105-05

10.7506/spkx1002-6630-201416020

2013-08-26

國家自然科學基金地區科學基金項目（31260496；31160409）；云南省自然科學基金項目（2011FB053；2011FZ195）

楊天偉（1989—），男，碩士研究生，主要從事真菌資源研究。E-mail：861825996@qq.com

*通信作者：王元忠（1981—），男，助理研究員，碩士，主要從事真菌資源及藥用植物研究。E-mail：boletus@126.com