RP-HPLC法分析萱草屬植物花蕾中游離氨基酸組成

楊 利，李曉東，劉樹英，孫國峰，林秦文，劉洪章,*，張金政

RP-HPLC法分析萱草屬植物花蕾中游離氨基酸組成

楊 利1,2，李曉東2，劉樹英1，孫國峰2，林秦文2，劉洪章1,*，張金政2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.中國科學院植物研究所，北京 100093）

目的：分析萱草屬植物8 個野生種和25 個栽培品種花蕾中游離氨基酸的組成特性。方法：以鄰苯二甲醛作為衍生試劑，采用柱前在線衍生反相高效液相色譜法對該屬植物花蕾中游離氨基酸組成進行分析，利用主成分分析法對游離氨基酸進行綜合評價。結(jié)果：供試樣品游離氨基酸總量在6.864～21.219 mg/g之間；在萱草屬植物花蕾中能檢測出14～16 種游離氨基酸，且含 量存在差異；其中呈味氨基酸以Asp、Gly、Ser和Glu等鮮甜味氨基酸含量最為豐富。通過綜合評價指數(shù)得出：萱草屬植物中食用品種黃花菜、小黃花菜、北黃花菜和‘白花’萱草等的品質(zhì)最優(yōu)，‘金娃娃’萱草和‘春節(jié)’萱草的品質(zhì)較優(yōu)，‘馨口’和‘銀光芙蓉’萱草的品質(zhì)最差。

萱草；游離氨基酸；反相高效液相色譜；鄰苯二甲醛

萱草屬（Hemerocallis L.）植物為百合科（Liliaceae）多年生宿根草本植物，全世界共有14種，其中原產(chǎn)我國約有11 種[1]，直至2002 年底美國萱草協(xié)會已被注冊登記的萱草園藝種已多達5萬個[2]。萱草屬植物的花可以觀賞，部分野生種和栽培品種可以入藥和當蔬菜食用[3]。如其中的黃花菜，又名金針菜就是一種具有較高營養(yǎng)價值的特色蔬菜[4]。該種植物富含糖類、蛋白質(zhì)、維生素、無機鹽、香氣物質(zhì)及多種人體必需的氨基酸，成為人們餐桌上一道特有的美味[5-6]。目前人們食用的萱草屬植物野生種主要包括黃花菜、北黃花菜和小黃花菜[7]。黃花菜產(chǎn)區(qū)湖南主栽品種主要是‘猛子花’、‘沖里花’和‘白花’等，甘肅主栽品種主要是馬連黃花、線黃花和小花黃花菜等[8]。目前萱草屬植物用于觀賞的種或品種占絕大部分，而這些種或品種是否具有潛在的食用或藥用價值，仍不清楚。

游離氨基酸（free amino acid，F(xiàn)AA）指以游離狀態(tài)存在、未經(jīng)水解等處理就能獲得的非蛋白質(zhì)氨基酸[9]。FAA是食品中重要的營養(yǎng)成分，具有增鮮和提高機體免疫力的作用[10-11]。此外，大多數(shù)FAA還是甜味或苦味的前體物質(zhì)[12]，斯特雷克爾退化或美拉德反應中的化合物可能有助于不同途徑芳香化合物的形成[13]。因此，F(xiàn)AA的檢測是食品檢測的一個重要指標。目前FAA的檢測方法包括直接分析法和間接分析法，如高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、衍生化高效液相色譜法和衍生化離子交換色譜法等[14]。柱前衍生反相高效液相色譜法是近年研究較多的一種氨基酸分析方法，以其靈活和易于推廣的特點，成為FAA檢測的常規(guī)手段。

有關(guān)萱草屬植物中FAA的研究，不僅可以加深對該屬植物營養(yǎng)價值的了解，而且對于建立黃花菜食品產(chǎn)業(yè)的質(zhì)量標準具有重要推動作用。而有關(guān)萱草屬植物中FAA組成及含量的研究鮮見報道，限制了更多該屬植物資源的應用。本研究采用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）柱前衍生結(jié)合反相高效液相色譜法，對萱草屬8 個野生種和25 個栽培品種的FAA組成及含量進行分析，以期為進一步擴展萱草屬植物資源的利用途徑以及尋找有食藥價值的育種材料提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萱草屬植物8 個野生種和25 個栽培品種的新鮮花蕾（表1）由中國科學院植物研究所萱草種質(zhì)資源提供，樣品采集后加適量液氮研磨成粉末，于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

乙腈和甲醇（色譜純） 美國Sigma公司；超純水由美國Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；乙醇、冰乙酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉、鄰苯二甲醛、巰基乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

DionexU3000HPLC高效液相色譜系統(tǒng)（配DGP-3600泵、WPS-3000自動進樣器、TCC-3100自動控溫柱箱、DAD-3000檢測器）、電子天平 日本島津公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒公司；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器有限公司；3-30k高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取條件優(yōu)化

準確稱取6 份1.0 g新鮮樣品，用7 mL不同溶劑（純水、體積分數(shù)10%乙酸溶液和體積分數(shù)80%乙醇溶液）研磨后裝入試管中分別進行90 ℃水浴20 min和室溫超聲振蕩30 min 2種方法處理，離心（12 000 r/min，10 min），濾渣按上法重新提取一次。合并2 次上清液；0.22 μm濾膜過濾后保存在-20 ℃冰箱，用于反相高效液相色譜分析，每個處理重復3 次；優(yōu)化后的提取方法用于后續(xù)萱草屬植物游離氨基酸分析提取方法。

1.3.2 在線衍生化

用自動進樣針吸取5.0 μL pH 9.5的硼酸緩沖液，再吸取1.0 μL的OPA，洗針一次，再吸取2.0 μL樣品，洗針一次，原位混合6 次，等待90 s，進樣。

表1 萱草野生種、品種表Table 1 Wild and cultivated species and cultivars of Hemerocaalllliiss

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；檢測波長338 nm；流速1 mL/min。流動相A：V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（水）= 45∶45∶10；流動相B：10 mmol/L pH 7.5磷酸二氫鈉。洗脫程序：0 min，100%B；10 min，82%B；15 min，76%B；21 min，59%B；23 min，57.8%B；25 min，42%B；27 min，41%B；31 min，100%B。

1.3.4 定性與定量分析

以16 種氨基酸標準品的保留時間定性；以氨基酸質(zhì)量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，求得16 種氨基酸的線性方程，面積歸一化法對測試樣品的游離氨基酸進行定量分析。重復3 次，單位為mg/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取條件優(yōu)化

圖1 不同提取條件下TAA（A）以及Asp（B）含量Fig.1 Effects of extraction solvents and techniques on the assay of total amino acids and Asp

由圖1可以看出，新鮮花蕾中游離氨基酸總量的提取效果分別為純水超聲＞體積分數(shù)80%乙醇水浴＞純水水浴＞體積分數(shù)80%乙醇超聲＞體積分數(shù)10%乙酸超聲＞體積分數(shù)10%乙酸水浴，水對于總游離氨基酸（total amino acid，TAA）的浸出效果優(yōu)于乙醇。單個氨基酸天冬氨酸（Asp）含量的提取效果為體積分數(shù)80%乙醇水浴優(yōu)于純水超聲和純水水浴，乙醇和水的提取效果明顯優(yōu)于乙酸提取。綜合考慮單個游離氨基酸提取效率和總氨基酸含量，在萱草屬植物游離氨基酸分析中選擇水作為提取溶劑，超聲波輔助提取。

2.2 氨基酸標準品的色譜圖

經(jīng)OPA在線衍生后用建立的色譜方法能夠較好地分離16 種氨基酸混合標準品及樣品（圖2）。在所檢測的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，響應值與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.998 6。

圖2 氨基酸混合標準品（A）以及黃花菜中氨基酸（B）色譜圖Fig.2 HPLC-DAD chromatograms of free amino acids from mixed standard solution and H. citrina

2.3 萱草屬植物游離氨基酸組成

所測萱草屬植物中檢出16 種已知游離氨基酸中的14～16 種（表2），其中包括7 種必需氨基酸（Lys、Thr、Val、Met、Phe、Ile、Leu），1 種條件必需氨基酸（Tyr），2 種營養(yǎng)半必需氨基酸（His、Arg）和6 種非必需氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、Ala、Cys）。

萱草屬植物游離氨基酸總量差異較大，在6.864～21.219 mg/g間波動，其中黃花菜TAA含量最高，為21.219 mg/g。萱草屬植物中Glu、Leu、Ile、Asp、Ser、Thr和His為主要游離氨基酸，其含量超過游離氨基酸總量的75%。Glu在第1類樣品和第3類樣品中含量均高達4 mg/g以上。Phe、Ala、Val、Lys和Tyr，含量較低。在9 個萱草屬植物如小黃花菜、北萱草和猛子花等中未檢測到Val，在5 個萱草屬植物中未檢測到Tyr，在‘摩盒’、‘馨口’和‘銀光芙蓉’萱草中未檢測到Lys。

表2 萱草花蕾中游離氨基酸的組成及含量分析Table 2 Free amino acids and their relative amounts in flower buds of Hemerocallis genus plants mg/g

2.4 萱草屬植物中必需氨基酸和呈味氨基酸的組成

萱草屬植物中必需氨基酸含量豐富，第1類樣品和第3類樣品必需氨基酸含量相差不大，第4類樣品中必需氨基酸含量最低。氨基酸在結(jié)構(gòu)上的差別取決于側(cè)鏈基團的不同，這一差別也影響了氨基酸的口味感官[15]。按照氨基酸的味覺強度，可以大致把氨基酸分為鮮味氨基酸（Asp＋Glu＋Gly＋Ala＋Lys）、甜味氨基酸（Ser＋Thr＋His）、芳香氨基酸（Cys＋Tyr＋Phe）、苦味氨基酸（Arg＋Val＋Met＋Ile＋Leu）。綜合表2和圖3可知，第1類測試樣品中鮮味氨基酸含量明顯高于其他3 類，鮮味氨基酸的含量高于其余3 種味覺氨基酸的含量，鮮味氨基酸是賦予黃花菜的鮮美口味的重要因素。第3類測試樣品中甜味氨基酸均值含量偏低，苦味氨基酸含量較高。然而從表3可以看出苦味氨基酸的味覺閾值較高因此萱草屬植物中未感覺到苦味感官，而鮮味氨基酸的味覺閾值較低，尤其Asp和Glu所具有的鮮味特征增強了黃花菜中整體風味的鮮味感官。

圖3 4 類萱草屬樣品中各呈味氨基酸和必需氨基酸的含量均值Fig.3 Average values of flavor amino acids and essential amino acids in four classes of Hemerocallis samples

表3 各種風味氨基酸的味覺閾值Table 3 Taste threshold of each flavor amino acid

2.5 萱草屬植物中游離氨基酸綜合評價

以萱草屬植物中檢測到的16 種游離氨基酸含量進行主成分分析，結(jié)果見圖4。除了小萱草和重瓣萱草外，第1類、第2類和第3類測試樣品均分布在A區(qū)，影響A、B區(qū)域樣品分布的主要因素是Glu、His和Arg的含量差異。從圖4可以看出，Glu、Asp和Gla 3 種氨基酸的含量差異是影響A區(qū)測試樣品的主要因素，影響B(tài)區(qū)測試樣品分布的因素主要是Arg、His和Thr 3 種氨基酸的含量變化。

圖4 主成分因子得分圖Fig.4 PCA scatter diagram of samples based on FAA profile

游離氨基酸的種類和含量在一定程度上影響植物的營養(yǎng)價值和風味，游離氨基酸可以直接被人體小腸吸收、利用，為機體提供營養(yǎng)；同時呈現(xiàn)甜味、酸味以及鮮味的不同氨基酸共同作用影響風味[16]。根據(jù)綜合評價指數(shù)分值可知（表2），黃花菜綜合評分最高為3.086，小黃花菜次之為2.615。從表2可以看出，黃花菜的TAA含量也是最高的，觀賞品種‘金娃娃’萱草綜合評分為0.366，該品種TAA含量為15.351 mg/g與‘猛子花’萱草TAA含量接近。由圖4可以看出，主成分1主要由鮮味（Glu＋Asp）和苦味氨基酸（Leu＋Met＋Ile）組成，主成分2主要由甜味氨基酸（His＋Thr＋Ser）組成。黃花菜鮮味氨基酸含量最高，小黃花菜鮮味和甜味氨基酸含量均較高，‘金娃娃’萱草和‘春節(jié)’萱草甜味氨基酸含量最高鮮味氨基酸含量較低。通過主成分分析對萱草屬植物的游離氨基酸進行綜合評價，通常綜合指數(shù)數(shù)值越大，綜合質(zhì)量就越好[15,17]。就游離氨基酸含量分析，萱草屬植物中食用品種黃花菜、小黃花菜、北黃花菜和‘白花’萱草等的品質(zhì)最優(yōu)，‘金娃娃’萱草和‘春節(jié)’萱草的品質(zhì)較優(yōu)，‘馨口’和‘銀光芙蓉’萱草的品質(zhì)最差。

3 討論與結(jié)論

3.1 游離氨基酸的組成

產(chǎn)物的風味主要決定于游離氨基酸含量的多少，特別是那些具有鮮味的氨基酸含量的多少[16]。因此，一般認為，游離氨基酸含量可以作為食品鮮美度的評價指標[18-19]或重要影響指標[20]。Yoshie等[21]研究指出，F(xiàn)AA含量越高且Ala、Asp、Gly和Glu等呈味氨基酸越多，越能讓人感到味美鮮甜。唐道邦等[22]對鮮黃花菜花蕾氨基酸測定，含量在1.308 g/100 g左右，必需氨基酸含量豐富。本研究以萱草屬植物8 個野生種和25 個栽培品種的花蕾為材料，利用PR-HPLC技術(shù)檢測了萱草屬植物花蕾中16 種一級游離氨基酸，測試樣品游離氨基酸中必需氨基酸含量豐富，包括7 種必需氨基酸、1 種條件必需氨基酸和2 種營養(yǎng)半必需氨基酸，7種必需氨基酸總含量在2.578～8.583 mg/g之間，與唐道邦等[22]研究相符。黃花菜味美鮮甜的口感可能是其富含游離氨基酸相關(guān)，糖類和氨基酸化合物進行美拉德反應，能獲得各種不同的風味[23]。但不同氨基酸的味覺閾值不同，含量高的風味氨基酸并非一定對食品的風味貢獻大，且同一氨基酸不同的構(gòu)型呈現(xiàn)不同的口感，有的甚至呈現(xiàn)相反的口感[24]，因此從游離氨基酸種類來看，評價風味品質(zhì)還需對各氨基酸的構(gòu)型作更深入的研究工作。

3.2 萱草屬植物中游離氨基酸綜合評價

本研究比較了33 種（品種）萱草屬植物花蕾中游離氨基酸組成與含量的差異，利用綜合評分指數(shù)對萱草屬植物游離氨基酸含量進行評價，綜合評分指數(shù)越高說明其氨基酸綜合質(zhì)量越好，篩選出萱草屬植物中游離氨基酸綜合質(zhì)量較高的種類。單純考慮游離氨基酸的含量，萱草屬植物中食用品種黃花菜、小黃花菜、北黃花菜和‘白花’萱草等的品質(zhì)最優(yōu)，‘金娃娃’萱草和‘春節(jié)’萱草的品質(zhì)較優(yōu)，‘馨口’和‘銀光芙蓉’萱草的品質(zhì)最差。

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Analysis of Free Amino Acids in Flower Buds of Hemerocallis Genus Plants by RP-HPLC

YANG Li1,2, LI Xiao-dong2, LIU Shu-ying1, SUN Guo-feng2, LIN Qin-wen2, LIU Hong-zhang1,*, ZHANG Jin-zheng2
(1. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

Objective: To analyze the composition of free amino acids in flower buds of plants from 8 wild species and 25 cultivated species of the genus Hemerocallis. Methods: A high performance liquid chromatography (HPLC) method to determine free amino acids in flower buds of Hemerocallis genus plants was proposed using on-line precolumn derivatization with o-phthalaldehyde. Comprehensive evaluatio n of these Hemerocallis species based on free amino acid composition was performed by principal component analysis. Results: The results showed that the total amount of free amino acids varied from 6.864 to 21.219 mg/g in flower buds of the 33 Hemerocallis species tested；14-16 kinds of free amino acids were detected and their contents differed among different Hemerocallis species. All the investigated samples were richest in asparagine, glycine, serine and glutamic acid among the flavor amino acids identified. Based on comprehensive evaluation index, the edible species of Hemerocallis, Hemerocallis citrine, Hemerocallis minor, Hemerocallis lilioasphodelus and Hemerocallis bearing white flowers, had the best quality followed by Hemerocallis ‘Stella Deoro’ and Hemerocallis ‘First Spring’, whereas Hemerocallis ‘Xinkou’ and Hemerocallis ‘yinguangfurong’ showed the poorest quality.

Hemerocallis; free amino acids; reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC); o-phthalaldehyde

TS207

A

1002-6630（2014）16-0143-05

10.7506/spkx1002-6630-201416028

2013-11-19

中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向資助項目（KSCX2-EW-B-2；KSCX2-EW-B-5）

楊利（1987—），女，碩士研究生，研究方向為經(jīng)濟作物資源。E-mail：ylim15@163.com

*通信作者：劉洪章（1957—），男，教授，博士，研究方向為經(jīng)濟作物資源。E-mail：lhz999@126.com