基于高效薄層色譜法的胡麻卵磷脂質(zhì)量分析

古再麗努爾·阿爾肯，劉 然，侯俊峰，艾散江·艾海提，關(guān) 明*

基于高效薄層色譜法的胡麻卵磷脂質(zhì)量分析

古再麗努爾·阿爾肯，劉 然，侯俊峰，艾散江·艾海提，關(guān) 明*

（新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，污染監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054）

目的：建立胡麻卵磷脂的高效薄層色譜質(zhì)量分析方法。方法：將卵磷脂供試品及磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品溶于氯仿-甲醇（3∶2，V/V），以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）為展開系統(tǒng)，考察不同顯色劑、展開系統(tǒng)、點(diǎn)樣量、薄層板、檢視方式、溫度、相對(duì)濕度對(duì)卵磷脂供試品中不同組分分離的影響，進(jìn)行高效薄層色譜定性分析；在確定的色譜條件下，將卵磷脂供試品及磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行展開，掃描磷脂酰膽堿峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法測(cè)定卵磷脂供試品中磷脂酰膽堿的含量。結(jié)果：卵磷脂供試品各組分分離情況良好，適于定性分析；卵磷脂供試品中磷脂酰膽堿的含量為63.33%，板間、板內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.82%和3.73%，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD為1.60%，加標(biāo)平均回收率為98.5%。結(jié)論：建立的方法快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為卵磷脂質(zhì)量分析提供新的技術(shù)參考。

卵磷脂；高效薄層色譜法；磷脂酰膽堿；質(zhì)量分析

卵磷脂是磷脂類混合物，既能促進(jìn)膽固醇及脂肪的代謝，又有調(diào)節(jié)高級(jí)神經(jīng)組織活動(dòng)的作用，可用于減肥、護(hù)膚及延緩衰老等方面的應(yīng)用。除此外，卵磷脂還可表面活性劑、乳化劑等在食品工業(yè)中用途更為廣泛[1-2]。我國(guó)高純度卵磷脂主要依賴大量進(jìn)口，以高純度藥用卵磷脂研制的抗癌新藥“139”針劑，在國(guó)內(nèi)醫(yī)藥行業(yè)市場(chǎng)更是供不應(yīng)求，其開發(fā)是我國(guó)醫(yī)藥科技“十五”計(jì)劃及2010年發(fā)展規(guī)劃的重要任務(wù)[3]。卵磷脂的質(zhì)量分析方法主要有分光光度法[4-8]、紅外光譜法[9]、薄層色譜法[10-12]、高效液相色譜法[13-19]、高效毛細(xì)管電泳法[20]、柱層析法[21]、氧彈燃燒-灰化分光光度法[22]、以及核磁共振光譜法等[23-24]。目前，主要采用薄層色譜法和高效液相色譜法對(duì)卵磷脂中的主要成分磷脂酰膽堿（phosphatidyl choline，PC）進(jìn)行定性定量分析。高效液相色譜法具有快速、自動(dòng)化等特點(diǎn)，但試劑及色譜柱較為昂貴，實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較高；薄層色譜法實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較低，分離條件易掌握，而且結(jié)果直觀[10]。

新疆地區(qū)在生產(chǎn)胡麻植物油的同時(shí)也生產(chǎn)出了胡麻油腳等副產(chǎn)品，油腳是生產(chǎn)卵磷脂的主要原料，胡麻油腳中PC的含量高，可與大豆油腳相媲美[9]，但缺乏深度開發(fā)與利用。本實(shí)驗(yàn)采用高效薄層色譜法，對(duì)從胡麻油腳中制備的卵磷脂進(jìn)行PC的定性、定量分析，并進(jìn)行了方法學(xué)考察與耐受性實(shí)驗(yàn)，旨在為新疆胡麻資源的綜合利用、胡麻油腳原材料的精深加工及胡麻油腳卵磷脂產(chǎn)品的質(zhì)量分析與控制提供參考依據(jù)，以期提高新疆地區(qū)油脂類食品工業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡麻卵磷脂供試品（課題組精制）；甲醇、丙酮、冰醋酸 天津市福晨化學(xué)試劑廠；氯仿、無水乙醇天津市富宇精細(xì)化工有限公司；三乙胺、硫酸（均為分析純） 西安化學(xué)試劑廠；PC標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)P3556，純度≥99%） 美國(guó)Sigma公司；磷鉬酸 北京化工廠；碘 西安化學(xué)試劑廠；重鉻酸鉀 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

高效薄層色譜儀（Linomat 5點(diǎn)樣儀、TLC Scanner 3薄層色譜掃描儀、Reprostar 3薄層色譜攝像儀、TLC Plate Heater Ⅲ 薄層板加熱器） 瑞士Camag公司；100 μL微量進(jìn)樣針、雙槽展開缸（15 cm×10 cm×20 cm）；硅膠G高效板（規(guī)格（長(zhǎng)×寬）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 青島譜科分離材料有限公司；硅膠G板（規(guī)格（長(zhǎng)×寬）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 青島海洋化工廠；硅膠G板（規(guī)格（長(zhǎng)×寬）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm）、硅膠GF254板（規(guī)格（長(zhǎng)×寬）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 自制。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取PC標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于1 mL氯仿-甲醇（3∶2，V/V）中，制得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取卵磷脂供試品10 mg，溶于1 mL氯仿-甲醇（3∶2，V/V）中，制得質(zhì)量濃度為10 mg/mL的供試品溶液。

1.3.3 薄層色譜條件

采用課題組自制硅膠G板，以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）為展開系統(tǒng)，室溫、室內(nèi)進(jìn)行展開，以5%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的點(diǎn)樣量分別為2 μL和4 μL，可見光下檢視、拍照。含量測(cè)定波長(zhǎng)為235 nm，狹縫寬度0.8 mm×0.8 mm，采用背景校正，掃描速率25 mm/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜條件的確定

2.1.1 展開系統(tǒng)的選擇

吸取標(biāo)準(zhǔn)品2 μL與供試品溶液4 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，分別以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）、氯仿-甲醇-冰醋酸（24∶18∶0.04，V/V）、氯仿-無水乙醇-三乙胺-水（10∶13∶5∶3，V/V）、氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水（35∶25∶4∶14∶2，V/V）為展開系統(tǒng)，展開8 cm，取出，晾干，顯色，105 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，可見光下檢視、照相，結(jié)果見圖1。

圖1 不同展開系統(tǒng)的薄層色譜圖Fig.1 Thin-layer chromatogram using different developing systems

由圖1可見，A板中PC斑點(diǎn)清晰、大小適中、無明顯拖尾，與相鄰斑點(diǎn)保持較好的分離度，分離效果較好；B板展開的PC斑點(diǎn)距離下沿較近，除PC斑點(diǎn)外其他斑點(diǎn)顏色較淺，不便于觀察；C板展開顯色后未見PC斑點(diǎn)，不利于分析；D板除PC斑點(diǎn)外其他斑點(diǎn)顏色較淺，不便于觀察。通過觀察PC斑點(diǎn)的分離與拖尾情況，最終確定氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）為最佳展開系統(tǒng)。

2.1.2 顯色劑的選擇

取5 張展開后的薄層板進(jìn)行顯色，薄層板A放置于充滿飽和碘蒸氣的密閉容器中，其余薄層板分別噴以4%磷鉬酸-乙醇溶液、5%磷鉬酸-乙醇溶液、8%磷鉬酸-乙醇溶液、55%硫酸（含6%重鉻酸鉀）溶液顯色劑后，105 ℃加熱5 min至斑點(diǎn)清晰，可見光下檢視、照相，結(jié)果見圖2。

圖2 不同顯色劑的薄層色譜圖Fig.2 Thin-layer chromatogram using different chromogenic agents

由圖2可見，A板采用碘蒸氣為顯色劑，顯色后斑點(diǎn)呈藍(lán)色，但所需顯色時(shí)間較長(zhǎng)，邊緣模糊，不利于分析；B板采用55%硫酸（含6%重鉻酸鉀）溶液為顯色劑，顯色后斑點(diǎn)呈土黃色，除PC斑點(diǎn)外其他斑點(diǎn)顏色較淺，不便于觀察；C板采用4%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，顯色后斑點(diǎn)呈深藍(lán)色，除PC斑點(diǎn)外其他斑點(diǎn)顏色較淺，邊緣模糊，不利于分析；D板采用5%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，顯色后斑點(diǎn)呈深藍(lán)色，且斑點(diǎn)清晰；E板采用8%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，顯色后斑點(diǎn)呈深藍(lán)色，且斑點(diǎn)較為清晰，與D板效果接近。通過觀察斑點(diǎn)顏色和清晰度，最終確定5%磷鉬酸乙醇溶液為最佳顯色劑。

2.1.3 點(diǎn)樣量的選擇

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 μL點(diǎn)樣于同一薄層板上，展開顯色后，可見光下檢視、照相。結(jié)果表明：點(diǎn)樣量過大時(shí)斑點(diǎn)面積過大，顏色過深，拖尾較嚴(yán)重；點(diǎn)樣量過小時(shí)，斑點(diǎn)顏色過淺，不便于觀察。通過觀察PC斑點(diǎn)的分離與拖尾情況，最終確定標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的點(diǎn)樣量分別為2 μL和4 μL。

2.2 耐用性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 薄層板的考察

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品2 μL與供試品溶液4 μL，點(diǎn)于不同薄層板上，展開顯色后，可見光下檢視、照相。結(jié)果見圖3。A板為自制硅膠G板，圖中顯示PC斑點(diǎn)清晰、大小適中、無明顯拖尾，與相鄰斑點(diǎn)保持較好的分離度，分離效果較好；B板為青島海洋硅膠G板，硅膠較薄，斑點(diǎn)偏向邊緣，且部分斑點(diǎn)堆積在距離上沿較近處，不利于分析；C板為自制硅膠GF254板，斑點(diǎn)面積較大，距離上沿過近，不利于分析；D板為青島譜科高效板，硅膠較薄，分離效果與A板接近。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同的展開系統(tǒng)、顯色劑及點(diǎn)樣量條件下，不同薄層板薄層色譜圖中卵磷脂樣品各組分的斑點(diǎn)均得到較好分離，分離效果接近，表明薄層板對(duì)斑點(diǎn)分離影響不大，重復(fù)性較好，自制硅膠G板完全可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 不同薄層板的薄層色譜圖Fig.3 Thin-layer chromatograms using different thin layer plates

2.2.2 檢視方式的考察

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品2 μL與供試品溶液4 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，展開顯色后，分別在可見光、紫外光254 nm和366 nm波長(zhǎng)處檢視、照相。結(jié)果見圖4。

圖4 不同檢視方式的薄層色譜圖Fig.4 Thin-layer chromatograms observed at different wavelengths

由圖4可見，不同檢視情況下，色譜圖中的斑點(diǎn)呈現(xiàn)未見明顯差別，比較而言，可見光下檢視的斑點(diǎn)更為清晰，對(duì)比度更明顯，表明不同檢視方式對(duì)色譜分析影響不大，重復(fù)性較好，選擇可見光下檢視效果更好。

2.2.3 溫度考察

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品2 μL與供試品溶液4 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，于4 ℃、室溫（約20 ℃）、35 ℃條件下，展開顯色后，可見光下檢視、照相。結(jié)果見圖5及表1。A板在4 ℃條件下展開，板上沿產(chǎn)生波紋，斑點(diǎn)出現(xiàn)較為明顯的拖尾，不利于分析，而且4 ℃這一環(huán)境并不便于在任何季節(jié)隨時(shí)創(chuàng)造；B板在室溫條件下展開，展開后PC斑點(diǎn)清晰、大小適中、無明顯拖尾，與相鄰斑點(diǎn)保持較好的分離度，分離效果較好；C板在35 ℃條件下展開，斑點(diǎn)邊緣模糊，展開距離較長(zhǎng)，不利于分析。通過觀察斑點(diǎn)分離情況并計(jì)算PC斑點(diǎn)的Rf，結(jié)果表明，在4～35 ℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)各組分的分離有一定影響，選擇在室溫條件下展開效果更好。

圖5 不同溫度的薄層色譜圖Fig.5 Thin-layer chromatograms at different temperatures

表1 不同溫度對(duì)PC比移值的影響Table 1 Effect of different temperatures on Rf of phosphatidylcholine

2.2.4 不同相對(duì)濕度的考察

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品2 μL與供試品溶液4 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，于室內(nèi)環(huán)境（相對(duì)濕度（relative humidity，RH）約為22%～26%）、RH 42%和65%條件下，展開顯色后，可見光下檢視，照相。結(jié)果見圖6和表2。A板在室內(nèi)環(huán)境下展開，展開后PC斑點(diǎn)清晰、大小適中、無明顯拖尾，與相鄰斑點(diǎn)保持較好的分離度，分離效果較好；B板在RH 42%條件下展開，展開系統(tǒng)受濕度影響在板上沿產(chǎn)生波紋，斑點(diǎn)形狀不規(guī)則，拖尾較明顯，不利于分析；C板在RH 65%下展開，斑點(diǎn)堆積，不利于分析。通過觀察斑點(diǎn)分離情況并計(jì)算PC斑點(diǎn)的Rf，結(jié)果表明，濕度對(duì)各組分的分離影響較大，選擇在室內(nèi)環(huán)境下展開可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖6 不同相對(duì)濕度的薄層色譜圖Fig.6 Thin-layer chromatograms at different humidity levels

表2 不同相對(duì)濕度對(duì)PC比移值的影響Table 2 Effect of different humidity levels on Rf of phosphatidylcholine

2.3 系統(tǒng)驗(yàn)證

以最佳色譜條件進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證。即采用課題組自制硅膠G板，以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）為展開系統(tǒng)，室溫、室內(nèi)環(huán)境下展開，以5%磷鉬酸-乙醇溶液為顯色劑，標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的點(diǎn)樣量分別為2 μL和4 μL，可見光下進(jìn)行檢視、拍照。結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，供試品中的PC在與標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，而且分離效果良好，可以滿足定性、定量分析的要求。

圖7 系統(tǒng)驗(yàn)證色譜圖Fig.7 Thin-layer chromatogram from the system verification

2.4 PC含量測(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL分別點(diǎn)于薄層板上，展開，紫外燈下定位，掃描PC斑點(diǎn)峰面積。以PC含量（x）為橫坐標(biāo)，PC峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=817.54x＋102.35，r=0.999 9。結(jié)果表明，在5.0～30.0 μg范圍內(nèi)PC含量與其斑點(diǎn)峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取供試品溶液4 μL，依次于同一薄層板上點(diǎn)5 次供試品溶液，重復(fù)操作5 次，制得5 塊薄層板，分別展開，紫外燈下定位，掃描測(cè)定PC斑點(diǎn)峰面積，分別計(jì)算板內(nèi)、板間相同位置PC斑點(diǎn)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），板內(nèi)及板間精密度RSD分別為1.82%和3.73%，表明儀器具有良好的精密度和重復(fù)性。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取供試品溶液4 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，展開，紫外燈下定位，每隔10 min掃描測(cè)定一次PC斑點(diǎn)峰面積，計(jì)算1 h內(nèi)峰面積的RSD，結(jié)果表明，RSD為1.60%，卵磷脂在1 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

2.4.4 樣品測(cè)定

分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各2 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下展開，用外標(biāo)法計(jì)算供試品中PC含量。結(jié)果見表3，供試品中PC含量為63.33%，RSD為3.72%。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果（n=5）Table 3 Results of replicate determinations of PC in the sample (n=5)

2.4.5 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取3 份供試品溶液1.0 μL，在供試品溶液中分別加入0.8、1.0、1.2 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，平行操作3 次，分別展開，紫外燈下定位，掃描測(cè)定PC斑點(diǎn)峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果見表4，平均回收率為98.5%，RSD為3.89%，表明本實(shí)驗(yàn)回收率良好，方法準(zhǔn)確度高。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery tests

3 結(jié) 論

利用高效薄層色譜法，在考察不同展開系統(tǒng)、顯色劑、點(diǎn)樣量、薄層板、檢視方式、溫度、相對(duì)濕度等條件對(duì)卵磷脂不同組分薄層色譜分離影響的基礎(chǔ)上，篩選確定了最佳展開條件，對(duì)卵磷脂供試品進(jìn)行了較為系統(tǒng)的質(zhì)量分析，建立了胡麻油腳卵磷脂質(zhì)量分析的新方法。與高效液相色譜法[13-19]及高效毛細(xì)管電泳法[20]相比，本實(shí)驗(yàn)建立的方法色譜分離條件易掌握，實(shí)驗(yàn)成本明顯降低。與薄層色譜分析[10]對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)獲得的薄層色譜圖各組分分離情況吻合，且PC與其他組分分離效果較好，斑點(diǎn)清晰，結(jié)果直觀，便于定性分析；比較薄層掃描法[11-12]，本實(shí)驗(yàn)的高效薄層定量分析方法更為簡(jiǎn)便快捷，且精密度及穩(wěn)定性良好、準(zhǔn)確度高，為高效薄層色譜法應(yīng)用于磷脂類混合物的定量分析提供了技術(shù)參考。

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Quality Analysis of Flax Lecithin Based on High Performance Thin Layer Chromatography

GUZAILINUER Aerken, LIU Ran, HOU Jun-feng, AISANJIANG Aihaiti, GUAN Ming*
(Key Laboratory of Pollution Monitoring and Control, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, ürümqi 830054, China)

Objective: To establish a method for the quality analysis of lecithin extracted from flax by high performance thin layer chromatography (HPTLC). Methods: Test samples of lecithin and phosphatidylcholine standard were dissolved separately in chloroform-methanol (3:2, V/V) before analysis by HPTLC. The developing system consisted of chloroform, methanol and water (65:25:4, V/V). The effects of chromogenic agents, developing systems, amounts of spotted sample, thin layer chromatography plates, temperature and relative humidity on the separation of each component in sample were investigated. Under the best chromatography condition, the lecithin in the sample and the standard were developed, and the peak area of phosphatidylcholine was scanned. A standard curve was established and phosphatidylcholine in sample was quantified by an external standard method. Results: The separation of each component in sample was suitable for qualitative analysis. The average content of phosphatidylcholine in lecithin sample was 63.33% with plate-to-plate and within-plate precision (relative standard deviation, RSD) of 1.82% and 3.73%, respectively, and stability (RSD) of 1.60%, and the average recovery was 98.5%. Conclusion: The method is rapid, accurate and reproducible, which can provide a new technical reference for the quality analysis of lecithin.

lecithin; high performance thin layer chromatography; phosphatidylcholine; quality analysis

TS207.3

A

1002-6630（2014）16-0160-05

10.7506/spkx1002-6630-201416031

2013-10-19

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011211A031）；新疆師范大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目

古再麗努爾·阿爾肯（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離與分析。E-mail：657301650@qq.com

*通信作者：關(guān)明（1974—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橘Y源植物化學(xué)。E-mail：guanm@xjnu.edu.cn