液相色譜-質譜同時測定水產品中78 種獸藥殘留

李仲超

液相色譜-質譜同時測定水產品中78 種獸藥殘留

李仲超1,2

（1.廈門市產品質量監督檢驗院，福建 廈門 361004；2.廈門市工業產品生產許可證審查技術中心，福建 廈門 361004）

運用液相色譜-質譜技術建立水產品（魚、蝦和貝）中78 種獸藥的同時測定方法。含0.1%甲酸的乙腈溶液進行提取，考察不同萃取溶劑及Na2EDTA添加量對目標獸藥回收率影響。目標獸藥在0.1～100 μg/kg范圍內線性良好；以基底匹配工作曲線和替代物法分別進行定量和質控，4 μg/kg和20 μg/kg兩個加標量條件下魚、蝦、貝肉的加標回收率和相對標準偏差（n=4）分別為40.8%～125.6%和0.1%～16.0%（魚）、42.9%～131.9%和0.1%～14.0%（蝦）、及43.5%～136.4%和0.3%～15.8%（貝），方法檢測限為0.1～0.5 μg/kg。方法靈敏、準確、快速，可應用于福建漳州養殖區蝦樣獸藥污染情況調查。

液相色譜-質譜；同時測定；水產品；獸藥

獸藥是用以防治禽畜和水產品疾病、促進其生長繁育的藥品。主要種類包括抗生素類、激素類和抗寄生蟲藥等[1]。隨著近年來水產養殖業的發展，越來越多的獸藥投入使用以提高水產品的質量與產量[2]。與此同時，殘留在水產品中的獸藥也引起了廣泛關注，國際食品法典委員會、歐盟指令條例、日本肯定列表制度等對水產品中多種獸藥規定了最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）[3-4]。獸藥的MRLs經常成為我國水產品出口貿易中遇到的“綠色壁壘”，造成水產養殖業的巨額損失[5]?，F有研究多針對水產品中單一或者熱點種類獸藥、操作繁瑣、儀器檢測限高、應對突發水產品安全事件時的檢測效率低[6-13]。本實驗選擇多種類獸藥作為目標物，液相色譜-質譜進行分析檢測[14-15]，建立了在水產品（魚、蝦、貝）中靈敏、準確、快速的同時分析方法，為水產品中獸藥殘留情況調查提供了技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

巴浪魚和牡蠣，購自福建廈門水產品超市；南美白對蝦，采自漳州紫泥養殖蝦池塘。

標準品分別購自德國奧格斯堡公司和美國Sigma公司，其中包括：17 種磺胺類、9 種喹諾酮類、4 種四環素類、4 種工業染料類、9 種β-受體激動劑類、7 種β-內酰胺類、8 種硝基呋喃及其代謝物衍生物類、4 種大環內酯類、3 種氯霉素類、5 種雌激素類、2 種雄激素類、乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧、螺旋霉素、玉米赤霉醇、尼卡巴嗪、10 種替代物。取適量獸藥標準品，以甲醇為溶劑，配成一定質量濃度的單標儲備液；78 種目標獸藥的混合標準溶液用甲醇為溶劑配制，置于-4 ℃冰箱中避光保存。

乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純） 美國Tedia公司；甲酸（色譜純） 美國Fluka公司；Na2EDTA 上海申博化工有限公司；無水硫酸鈉、檸檬酸（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

含0.1%甲酸的乙腈作為萃取溶劑：將1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，得到檸檬酸緩沖溶液；正己烷溶液中加入少量乙腈，劇烈振蕩分層棄去下層乙腈，得到乙腈飽和正己烷溶液；含0.1%甲酸的乙腈-水（1∶4，V/V）作為定容溶劑。

6410 Triple Quad液相色譜-質譜聯用儀（包括1260液相色譜系統和電噴霧電離（electronic spray ionization，ESI）源 美國Agilent公司；色譜分離柱Kinetex C18（100 mm×3 mm，2.6 μm） 美國Phenomenex公司；12通道固相萃取裝置 美國Supelco公司；0.22 μm親水性聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）注射過濾器 天津津騰實驗設備有限公司；500 mg/6 mL Oasis HLB固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）柱美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 分析儀器條件

1.2.1.1 色譜條件

柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL/min。進樣量：10 μL。目標物分為ESI+項目A、B兩組和ESI-項目C共3組，其中，ESI+項目組的流動相為：含0.10%甲酸的超純水（A1）和含0.10%甲酸的乙腈（B1）；梯度洗脫程序為：0～2 min，10% B1；2～10 min，10%～15% B1；10～12 min，15% B1；12.01～16 min，25% B1；16～24 min，25%～80% B；24～26 min，80% B1；26.01～30 min，10% B1。ESI-項目組的流動相為：超純水（A2）和乙腈（B2）；梯度洗脫程序為：0～1 min，25% B2；1.01～5 min，45% B2；5～9 min，45%～80% B2；9～12 min，80% B2；12.01～15 min，25% B2。

1.2.1.2 質譜條件

離子源：ESI+和ESI-；離子源溫度：350 ℃；毛細管電壓：4000 V；霧化氣流速：10 L/min；檢測模式：多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；目標獸藥及替代物的質譜參數優化結果見表1。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 樣品的制備

魚肉：去鱗，沿背脊取魚肉、皮部分，攪拌機絞碎后放入-4 ℃冰箱中保存備用；蝦肉：去頭、殼、腸腺，取肌肉部分，攪拌機絞碎后放入-4 ℃冰箱中保存備用；貝肉：去殼，取可食用部分，攪拌機絞碎后放入-4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.2.2 樣品的提取

稱取5.0 g制備后樣品于80 mL聚乙烯離心管，加入0.5 g Na2EDTA、30 mL含0.1%甲酸的乙腈提取溶劑和20 mL乙腈飽和的正己烷，中速均質2～3 min后以3 500 r/min離心5 min，取中間層乙腈溶液于150 mL旋轉燒瓶中，殘渣中再加入20 mL乙腈，超聲萃取10 min，3 500 r/min離心5 min后合并乙腈萃取液。

1.2.3 樣品的凈化

1.2.3.1 有機溶液除油凈化法

上述1.2.2.2節萃取液旋轉蒸發至干后，以定容溶劑定容至1.0 mL，加入1.0 mL乙腈飽和正己烷凈化除油，離心后取下層乙腈液，經0.22 μm PVDF濾膜過濾后，待液相色譜-質譜檢測。

1.2.3.2 SPE凈化法

將1.2.2.2節萃取液旋轉蒸發至干后，加入20 mL超純水后，再加入10 mL正己烷，振搖后棄去正己烷，重復一次；依次以6 mL甲醇和6 mL水活化HLB柱，吸取旋轉燒瓶中的水樣通過HLB柱進行凈化，上柱完畢后以6 mL的甲醇-水（5∶95，V/V）進行淋洗后，抽干后依次用8 mL的甲醇和4 mL甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）進行洗脫；接取的洗脫液在40 ℃氮吹濃縮至干，以定容溶劑定容至1 mL，經0.22 μm PVDF過濾器過濾后，待液相色譜-質譜檢測。

2 結果與分析

2.1 目標物質譜參數優化

以適當濃度目標物和替代物的單標溶液進行質譜參數優化。首先進行全掃描，優化目標物的[M+H]+或[M-H]-準分子離子峰響應；然后對準分子離子進行轟擊，監測二次碎裂產生的子離子，最后將準分子離子和2～3 個信號強度適宜的子離子組成監測離子對，以MRM模式進行檢測。優化后的目標物母離子（parent ion，PI）、源內碎裂電壓（fragmenter voltage，FV）、子離子（daughter ions，DI）、碰撞能（collision energy，CE）等質譜參數和以5 倍信噪比計算的儀器測定限（instrument detection limit，IDL）見表1。

2.2 色譜條件的優化

在流速0.25 mL/min、進樣量10 μL的條件下，分別用流動相A1和B1優化正離子目標獸藥的分離；用流動相A2和B2來優化負離子目標獸藥的分離。首先通過洗脫程序較長且梯度較緩的慢梯度程序確定各目標物的大致出峰時間順序和分離情況，再分段調整梯度洗脫程序，實現最佳分離效果。優化后目標獸藥分組分析梯度程序見1.2.1.1節，MRM譜圖見圖1。

圖1 目標獸藥分組分析的質譜多反應監測譜圖Fig.1 MRM chromatograms of grouped target veterinary drugs

2.3 水產品萃取條件優化

2.3.1 萃取溶劑優化

水產品中蛋白質和脂肪雜質較多，需要選擇合適的萃取溶劑。本研究以養殖的南美白對蝦為基底，添加目標獸藥混標至10 μg/kg，參照1.2.2節進行前處理，考察含0.1%甲酸的乙腈溶液、乙腈-檸檬酸-磷酸緩沖溶液（4∶3，V/V）和乙腈-檸檬酸-磷酸緩沖溶液（9∶1，V/V）對目標獸藥的萃取回收率，最終選擇回收率高且具有較好的蛋白質沉淀作用的含0.1%甲酸的乙腈進行萃取。

2.3.2 Na2EDTA添加量的優化

水產品中的重金屬可能會對萃取效果產生影響。本研究以養殖的南美白對蝦為基底，添加目標獸藥混標至理論添加量10 μg/kg，加入0.0、0.5 g和1.0 g的Na2EDTA，參照1.2.2節進行前處理，結果顯示添加Na2EDTA后，樣品中喹諾酮類和硝基呋喃類目標獸藥的回收率顯著優于未添加組，而添加0.5 g 和1.0 g時的回收率無明顯區別，因此，后續研究選擇在5.0 g樣品萃取前加入0.5 g Na2EDTA。

表1 目標獸藥的質譜檢測參數、工作曲線線性范圍、相關系數和IDLsTable 1 Tandem mass parameters, linear ranges, correlation coefficients and IDLs of target veterinary drugs

續表1

2.4 凈化方式的選擇

與水產品共萃出的脂肪、蛋白質等雜質須在前處理中盡量去除，避免干擾檢測、污染和損害檢測儀器。本研究以蝦肉為基底，參照1.2.2節進行前處理，采用有機溶液除油凈化和SPE凈化兩種常見方式對萃取液進行凈化，在m/z 100～1 000范圍內進行質譜全掃描，如圖2所示。可以發現，SPE凈化的譜圖凈化效果并不顯著。

圖2 水產品樣品SPE凈化與否的總離子流色譜圖對比Fig.2 Comparison of TICs of aquatic product samples with and without SPE clean-up

在液相色譜-質譜分析中，由于基底雜質的干擾，目標物被ESI電離源電離的能力受到影響，造成目標物信號強度改變的現象稱為基底效應[16-21]，根據公式（1）對兩種凈化方式中水產品的基底效應進行考察，發現在SPE凈化方式下，喹諾酮類、大環內酯類和部分β-受體激動劑類目標獸藥的基底效應有一定改善，但是同時也發現，β-內酰胺類、雌激素類和工業染料類目標獸藥的回收率有一定損失。

綜合考慮方法的準確性、靈敏度與成本、效率，本研究在采用基底匹配工作曲線法盡可能克服基底效應干擾的前提下，采用有機溶劑除油法對萃取液進行凈化處理。

2.5 定量方法選擇

在最優條件下，以南美白對蝦基底為例，添加目標獸藥混標至理論添加量10 μg/kg，參照1.2.2節進行前處理，比較了外標法、替代物法、基底匹配法的定量結果。其中，基底匹配法是將未檢出目標物的空白樣品基底經過與樣品相同的前處理后，加入系列梯度水平的目標物標準溶液，以此繪制工作曲線用來計算檢測結果定量的回收率[22-23]，其結果較外標法和替代物法均有顯著改善，有效克服了基底效應的干擾，因此，選擇基底匹配法作為后續研究的定量方式。

2.6 水產品基底加標回收率、重現性和方法檢測限

在最優化的條件下，以1.1節所述的水產品為基底，加入獸藥混合標準品至理論添加量4 μg/kg和20 μg/kg，每個添加平行4 份，參照1.2.2節進行前處理，以基底匹配工作曲線法進行定量、替代物進行質控，考察了目標獸藥的回收率與重復性，根據表1所列IDLs，綜合考慮水產品的基質效應和低濃度加標條件下的回收率情況最終確定MDLs，結果顯示除了少數目標獸藥在低加標條件下未能檢出外，78 種目標獸藥在兩個加標水平下的回收率均較佳，魚、蝦、貝的加標回收率分別為40.8%～125.6%、42.9%～131.9%和43.5%～136.4%；RSD（n=4）分別為0.1%～16.0%、0.1%～14.0%和0.3%～15.8%，方法滿足質量控制要求[24]；大部分獸藥的MDLs在0.1～0.5 μg/kg，可以滿足水產品中多種類獸藥殘留的檢測。

2.7 方法應用

2011年3—11月，運用建立的方法對福建漳州養殖蝦塘中的養殖蝦進行獸藥殘留污染檢測，養殖蝦中檢出6 種獸藥，含量在0.02～2.6 μg/kg，均低于國內外相關標準的MRLs，其中，環丙沙星和結晶紫在3月的蝦樣中普遍檢出，諾氟沙星、恩諾沙星和氧氟沙星在7月的蝦樣中普遍檢出，氟甲砜霉素在11月的蝦樣中多數檢出。

3 結 論

本研究建立了水產品（魚、蝦、貝）中多種類獸藥靈敏、準確、快速同時分析方法，方法質量控制合格、可以滿足水產品中多種類獸藥殘留的檢測要求，并成功應用于福建漳州養殖蝦塘中養殖蝦地檢測。

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Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Aquatic Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS-MS)

LI Zhong-chao1,2
(1. Xiamen Products Quality Supervision and Inspection Institute, Xiamen 361004, China; 2. Xiamen Industrial Products Production License Review Technology Center, Xiamen 361004, China)

A method for the simultaneous determination of 78 veterinary drugs in aquatic products (fish, shrimp and shellfish) was established using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Effects of experimental conditions such as extraction solvents and Na2EDTA adding on extraction efficiency were investigated. Under the optimized conditions, recoveries of 78 target drugs calculated from matrix match calibration curve at spiked level of 4 and 20 μg/kg were 40.8%-125.6% for fish, 42.9%-131.9% for shrimp and 43.5%-136.4% for shellfish with RSD (n = 4) of 0.1%-16.0%, 0.1%-14.0% and 0.3%-15.8%, respectively. The detection limits drugs ranged from 0.1 to 0.5 μg/kg. The method is sensitive, accurate and fast and can be successfully applied in the analysis of residual veterinary drugs in shrimp samples from the aquatic farming areas of Zhangzhou, Fujian province.

liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); simultaneous determination; aquatic products; veterinary drugs

TS207.53

A

1002-6630（2014）16-0217-05

10.7506/spkx1002-6630-201416042

2013-09-07

李仲超（1958—），男，高級工程師，本科，研究方向為食品檢測。E-mail：13806013025@139.com