液相色譜-質(zhì)譜同時測定水產(chǎn)品中78 種獸藥殘留

李仲超

液相色譜-質(zhì)譜同時測定水產(chǎn)品中78 種獸藥殘留

李仲超1,2

（1.廈門市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，福建 廈門 361004；2.廈門市工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)許可證審查技術(shù)中心，福建 廈門 361004）

運用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)建立水產(chǎn)品（魚、蝦和貝）中78 種獸藥的同時測定方法。含0.1%甲酸的乙腈溶液進行提取，考察不同萃取溶劑及Na2EDTA添加量對目標獸藥回收率影響。目標獸藥在0.1～100 μg/kg范圍內(nèi)線性良好；以基底匹配工作曲線和替代物法分別進行定量和質(zhì)控，4 μg/kg和20 μg/kg兩個加標量條件下魚、蝦、貝肉的加標回收率和相對標準偏差（n=4）分別為40.8%～125.6%和0.1%～16.0%（魚）、42.9%～131.9%和0.1%～14.0%（蝦）、及43.5%～136.4%和0.3%～15.8%（貝），方法檢測限為0.1～0.5 μg/kg。方法靈敏、準確、快速，可應(yīng)用于福建漳州養(yǎng)殖區(qū)蝦樣獸藥污染情況調(diào)查。

液相色譜-質(zhì)譜；同時測定；水產(chǎn)品；獸藥

獸藥是用以防治禽畜和水產(chǎn)品疾病、促進其生長繁育的藥品。主要種類包括抗生素類、激素類和抗寄生蟲藥等[1]。隨著近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，越來越多的獸藥投入使用以提高水產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)量[2]。與此同時，殘留在水產(chǎn)品中的獸藥也引起了廣泛關(guān)注，國際食品法典委員會、歐盟指令條例、日本肯定列表制度等對水產(chǎn)品中多種獸藥規(guī)定了最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）[3-4]。獸藥的MRLs經(jīng)常成為我國水產(chǎn)品出口貿(mào)易中遇到的“綠色壁壘”，造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的巨額損失[5]。現(xiàn)有研究多針對水產(chǎn)品中單一或者熱點種類獸藥、操作繁瑣、儀器檢測限高、應(yīng)對突發(fā)水產(chǎn)品安全事件時的檢測效率低[6-13]。本實驗選擇多種類獸藥作為目標物，液相色譜-質(zhì)譜進行分析檢測[14-15]，建立了在水產(chǎn)品（魚、蝦、貝）中靈敏、準確、快速的同時分析方法，為水產(chǎn)品中獸藥殘留情況調(diào)查提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

巴浪魚和牡蠣，購自福建廈門水產(chǎn)品超市；南美白對蝦，采自漳州紫泥養(yǎng)殖蝦池塘。

標準品分別購自德國奧格斯堡公司和美國Sigma公司，其中包括：17 種磺胺類、9 種喹諾酮類、4 種四環(huán)素類、4 種工業(yè)染料類、9 種β-受體激動劑類、7 種β-內(nèi)酰胺類、8 種硝基呋喃及其代謝物衍生物類、4 種大環(huán)內(nèi)酯類、3 種氯霉素類、5 種雌激素類、2 種雄激素類、乙胺嘧啶、喹乙醇、卡巴氧、螺旋霉素、玉米赤霉醇、尼卡巴嗪、10 種替代物。取適量獸藥標準品，以甲醇為溶劑，配成一定質(zhì)量濃度的單標儲備液；78 種目標獸藥的混合標準溶液用甲醇為溶劑配制，置于-4 ℃冰箱中避光保存。

乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純） 美國Tedia公司；甲酸（色譜純） 美國Fluka公司；Na2EDTA 上海申博化工有限公司；無水硫酸鈉、檸檬酸（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

含0.1%甲酸的乙腈作為萃取溶劑：將1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，得到檸檬酸緩沖溶液；正己烷溶液中加入少量乙腈，劇烈振蕩分層棄去下層乙腈，得到乙腈飽和正己烷溶液；含0.1%甲酸的乙腈-水（1∶4，V/V）作為定容溶劑。

6410 Triple Quad液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括1260液相色譜系統(tǒng)和電噴霧電離（electronic spray ionization，ESI）源 美國Agilent公司；色譜分離柱Kinetex C18（100 mm×3 mm，2.6 μm） 美國Phenomenex公司；12通道固相萃取裝置 美國Supelco公司；0.22 μm親水性聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）注射過濾器 天津津騰實驗設(shè)備有限公司；500 mg/6 mL Oasis HLB固相萃取（solid phase extraction，SPE）柱美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 分析儀器條件

1.2.1.1 色譜條件

柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL/min。進樣量：10 μL。目標物分為ESI+項目A、B兩組和ESI-項目C共3組，其中，ESI+項目組的流動相為：含0.10%甲酸的超純水（A1）和含0.10%甲酸的乙腈（B1）；梯度洗脫程序為：0～2 min，10% B1；2～10 min，10%～15% B1；10～12 min，15% B1；12.01～16 min，25% B1；16～24 min，25%～80% B；24～26 min，80% B1；26.01～30 min，10% B1。ESI-項目組的流動相為：超純水（A2）和乙腈（B2）；梯度洗脫程序為：0～1 min，25% B2；1.01～5 min，45% B2；5～9 min，45%～80% B2；9～12 min，80% B2；12.01～15 min，25% B2。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI+和ESI-；離子源溫度：350 ℃；毛細管電壓：4000 V；霧化氣流速：10 L/min；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；目標獸藥及替代物的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表1。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 樣品的制備

魚肉：去鱗，沿背脊取魚肉、皮部分，攪拌機絞碎后放入-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫晃r肉：去頭、殼、腸腺，取肌肉部分，攪拌機絞碎后放入-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫回惾猓喝ぃ】墒秤貌糠郑瑪嚢铏C絞碎后放入-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 樣品的提取

稱取5.0 g制備后樣品于80 mL聚乙烯離心管，加入0.5 g Na2EDTA、30 mL含0.1%甲酸的乙腈提取溶劑和20 mL乙腈飽和的正己烷，中速均質(zhì)2～3 min后以3 500 r/min離心5 min，取中間層乙腈溶液于150 mL旋轉(zhuǎn)燒瓶中，殘渣中再加入20 mL乙腈，超聲萃取10 min，3 500 r/min離心5 min后合并乙腈萃取液。

1.2.3 樣品的凈化

1.2.3.1 有機溶液除油凈化法

上述1.2.2.2節(jié)萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，以定容溶劑定容至1.0 mL，加入1.0 mL乙腈飽和正己烷凈化除油，離心后取下層乙腈液，經(jīng)0.22 μm PVDF濾膜過濾后，待液相色譜-質(zhì)譜檢測。

1.2.3.2 SPE凈化法

將1.2.2.2節(jié)萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加入20 mL超純水后，再加入10 mL正己烷，振搖后棄去正己烷，重復(fù)一次；依次以6 mL甲醇和6 mL水活化HLB柱，吸取旋轉(zhuǎn)燒瓶中的水樣通過HLB柱進行凈化，上柱完畢后以6 mL的甲醇-水（5∶95，V/V）進行淋洗后，抽干后依次用8 mL的甲醇和4 mL甲醇-二氯甲烷（1∶1，V/V）進行洗脫；接取的洗脫液在40 ℃氮吹濃縮至干，以定容溶劑定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm PVDF過濾器過濾后，待液相色譜-質(zhì)譜檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標物質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

以適當濃度目標物和替代物的單標溶液進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。首先進行全掃描，優(yōu)化目標物的[M+H]+或[M-H]-準分子離子峰響應(yīng)；然后對準分子離子進行轟擊，監(jiān)測二次碎裂產(chǎn)生的子離子，最后將準分子離子和2～3 個信號強度適宜的子離子組成監(jiān)測離子對，以MRM模式進行檢測。優(yōu)化后的目標物母離子（parent ion，PI）、源內(nèi)碎裂電壓（fragmenter voltage，F(xiàn)V）、子離子（daughter ions，DI）、碰撞能（collision energy，CE）等質(zhì)譜參數(shù)和以5 倍信噪比計算的儀器測定限（instrument detection limit，IDL）見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

在流速0.25 mL/min、進樣量10 μL的條件下，分別用流動相A1和B1優(yōu)化正離子目標獸藥的分離；用流動相A2和B2來優(yōu)化負離子目標獸藥的分離。首先通過洗脫程序較長且梯度較緩的慢梯度程序確定各目標物的大致出峰時間順序和分離情況，再分段調(diào)整梯度洗脫程序，實現(xiàn)最佳分離效果。優(yōu)化后目標獸藥分組分析梯度程序見1.2.1.1節(jié)，MRM譜圖見圖1。

圖1 目標獸藥分組分析的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測譜圖Fig.1 MRM chromatograms of grouped target veterinary drugs

2.3 水產(chǎn)品萃取條件優(yōu)化

2.3.1 萃取溶劑優(yōu)化

水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)和脂肪雜質(zhì)較多，需要選擇合適的萃取溶劑。本研究以養(yǎng)殖的南美白對蝦為基底，添加目標獸藥混標至10 μg/kg，參照1.2.2節(jié)進行前處理，考察含0.1%甲酸的乙腈溶液、乙腈-檸檬酸-磷酸緩沖溶液（4∶3，V/V）和乙腈-檸檬酸-磷酸緩沖溶液（9∶1，V/V）對目標獸藥的萃取回收率，最終選擇回收率高且具有較好的蛋白質(zhì)沉淀作用的含0.1%甲酸的乙腈進行萃取。

2.3.2 Na2EDTA添加量的優(yōu)化

水產(chǎn)品中的重金屬可能會對萃取效果產(chǎn)生影響。本研究以養(yǎng)殖的南美白對蝦為基底，添加目標獸藥混標至理論添加量10 μg/kg，加入0.0、0.5 g和1.0 g的Na2EDTA，參照1.2.2節(jié)進行前處理，結(jié)果顯示添加Na2EDTA后，樣品中喹諾酮類和硝基呋喃類目標獸藥的回收率顯著優(yōu)于未添加組，而添加0.5 g 和1.0 g時的回收率無明顯區(qū)別，因此，后續(xù)研究選擇在5.0 g樣品萃取前加入0.5 g Na2EDTA。

表1 目標獸藥的質(zhì)譜檢測參數(shù)、工作曲線線性范圍、相關(guān)系數(shù)和IDLsTable 1 Tandem mass parameters, linear ranges, correlation coefficients and IDLs of target veterinary drugs

續(xù)表1

2.4 凈化方式的選擇

與水產(chǎn)品共萃出的脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)須在前處理中盡量去除，避免干擾檢測、污染和損害檢測儀器。本研究以蝦肉為基底，參照1.2.2節(jié)進行前處理，采用有機溶液除油凈化和SPE凈化兩種常見方式對萃取液進行凈化，在m/z 100～1 000范圍內(nèi)進行質(zhì)譜全掃描，如圖2所示。可以發(fā)現(xiàn)，SPE凈化的譜圖凈化效果并不顯著。

圖2 水產(chǎn)品樣品SPE凈化與否的總離子流色譜圖對比Fig.2 Comparison of TICs of aquatic product samples with and without SPE clean-up

在液相色譜-質(zhì)譜分析中，由于基底雜質(zhì)的干擾，目標物被ESI電離源電離的能力受到影響，造成目標物信號強度改變的現(xiàn)象稱為基底效應(yīng)[16-21]，根據(jù)公式（1）對兩種凈化方式中水產(chǎn)品的基底效應(yīng)進行考察，發(fā)現(xiàn)在SPE凈化方式下，喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和部分β-受體激動劑類目標獸藥的基底效應(yīng)有一定改善，但是同時也發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類、雌激素類和工業(yè)染料類目標獸藥的回收率有一定損失。

綜合考慮方法的準確性、靈敏度與成本、效率，本研究在采用基底匹配工作曲線法盡可能克服基底效應(yīng)干擾的前提下，采用有機溶劑除油法對萃取液進行凈化處理。

2.5 定量方法選擇

在最優(yōu)條件下，以南美白對蝦基底為例，添加目標獸藥混標至理論添加量10 μg/kg，參照1.2.2節(jié)進行前處理，比較了外標法、替代物法、基底匹配法的定量結(jié)果。其中，基底匹配法是將未檢出目標物的空白樣品基底經(jīng)過與樣品相同的前處理后，加入系列梯度水平的目標物標準溶液，以此繪制工作曲線用來計算檢測結(jié)果定量的回收率[22-23]，其結(jié)果較外標法和替代物法均有顯著改善，有效克服了基底效應(yīng)的干擾，因此，選擇基底匹配法作為后續(xù)研究的定量方式。

2.6 水產(chǎn)品基底加標回收率、重現(xiàn)性和方法檢測限

在最優(yōu)化的條件下，以1.1節(jié)所述的水產(chǎn)品為基底，加入獸藥混合標準品至理論添加量4 μg/kg和20 μg/kg，每個添加平行4 份，參照1.2.2節(jié)進行前處理，以基底匹配工作曲線法進行定量、替代物進行質(zhì)控，考察了目標獸藥的回收率與重復(fù)性，根據(jù)表1所列IDLs，綜合考慮水產(chǎn)品的基質(zhì)效應(yīng)和低濃度加標條件下的回收率情況最終確定MDLs，結(jié)果顯示除了少數(shù)目標獸藥在低加標條件下未能檢出外，78 種目標獸藥在兩個加標水平下的回收率均較佳，魚、蝦、貝的加標回收率分別為40.8%～125.6%、42.9%～131.9%和43.5%～136.4%；RSD（n=4）分別為0.1%～16.0%、0.1%～14.0%和0.3%～15.8%，方法滿足質(zhì)量控制要求[24]；大部分獸藥的MDLs在0.1～0.5 μg/kg，可以滿足水產(chǎn)品中多種類獸藥殘留的檢測。

2.7 方法應(yīng)用

2011年3—11月，運用建立的方法對福建漳州養(yǎng)殖蝦塘中的養(yǎng)殖蝦進行獸藥殘留污染檢測，養(yǎng)殖蝦中檢出6 種獸藥，含量在0.02～2.6 μg/kg，均低于國內(nèi)外相關(guān)標準的MRLs，其中，環(huán)丙沙星和結(jié)晶紫在3月的蝦樣中普遍檢出，諾氟沙星、恩諾沙星和氧氟沙星在7月的蝦樣中普遍檢出，氟甲砜霉素在11月的蝦樣中多數(shù)檢出。

3 結(jié) 論

本研究建立了水產(chǎn)品（魚、蝦、貝）中多種類獸藥靈敏、準確、快速同時分析方法，方法質(zhì)量控制合格、可以滿足水產(chǎn)品中多種類獸藥殘留的檢測要求，并成功應(yīng)用于福建漳州養(yǎng)殖蝦塘中養(yǎng)殖蝦地檢測。

[1] 龐國芳. 農(nóng)藥獸藥殘留現(xiàn)代分析技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2007: 14-16.

[2] CHEN yongshan, ZHANG Haibo, LUO yongming, et al. Occurrence and assessment of veterinary antibiotics in swine manures: a case study in East China[J]. Chinese Science Bulletin, 2012, 57(6): 606-614.

[3] 陸婉清. 環(huán)境水樣和水產(chǎn)品中多種類獸藥殘留的同時分析方法研究[D]. 廈門: 廈門大學(xué), 2010.

[4] 郝凱. 水產(chǎn)品中甲砜霉素殘留控制研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2006.

[5] 王秋芳. 綠色壁壘對我國水產(chǎn)品可持續(xù)出口的影響效應(yīng)及對策[D].青島: 中國海洋大學(xué), 2008.

[6] 楊方, 龐國芳, 劉正才. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中15 種喹諾酮類藥物殘留量[J]. 分析試驗室, 2008, 27(12): 27-33.

[7] LI Hui, KIJAK P J, TUMIPSEED S B, et al. Analysis of veterinary drug residues in shrimp: a multi-class method by liquid chromatography-quadrupole ion trap mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2006, 836(1/2): 22-38.

[8] 劉正才, 楊方, 余孔捷, 等. 超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測鰻魚中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素族抗生素藥物殘留[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(14): 167-170.

[9] 田豐, 王飛, 呂鵬, 等. HPLC-ESI-MS/MS檢測河豚魚中5種抗生素殘留的方法[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(18): 206-210.

[10] 湯軼偉, 勵建榮, 孟良玉, 等. 水產(chǎn)品中氯霉素藥物殘留檢測方法研究進展[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(11): 333-337.

[11] ROMERO-GONZALEZ R, LOPEZ-MARTINEZ J C, GOMEZMILAN E, et al. Simultaneous determination of selected veterinary antibiotics in gilthead seabream (Sparus aurata) by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2007, 857(1): 142-148.

[12] SANABIDOU V, EVAGGELOPOULOU E, TR?TZMüLLER M, et al. Multi-residue determination of seven quinolones antibiotics in gilthead seabream using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1203(2): 115-123.

[13] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局, 國家標準化管理委員會. GB/T 21316—2007 動物源食品中磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2007.

[14] HAMMEL y A, MOHAMED R, GREMAUD E, et al. Multi-screening approach to monitor and quantify 42 antibiotic residues in honey by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1177(1): 58-76.

[15] SAMANIDOU V, EVAGGELOPOULOU E, TR?TZMüLLER M, et al. Multi-residue determination of seven quinolones antibiotics in gilthead seabream using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1203(2): 115-123.

[16] 謝家樹, 葛慶華. LC/MS測定中生物樣品的基質(zhì)效應(yīng)問題[J]. 藥物分析雜志, 2008, 28(8): 1386-1389.

[17] KEBARLE P, TANG L. From ions in solution to ions in the gas phase the mechanism of electrospray mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry, 1993, 65(2): 972A-986A.

[18] KING R C, BONFIGLIO R, FEMANDEZ-METZLER C, et al. Mechanistic investigation of ionisation suppression in electrospray ionization[J]. Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2000, 11(11): 942-950.

[19] CECH N B, ENKE C G. Relating electrospray ionisation response to nonpolar character of small peptides[J]. Analytical Chemistry, 2000, 72(13): 2717-2723.

[20] ZHOU Shaolian, COOK K D. A mechanistic study of electrospray mass spectrometry: charge gradients within electrospray droplets and their infl uence on ion response[J]. Journal of The American Society for Mass Spectrometry, 2001, 12(2): 206-214.

[21] WU Jingming, QIAN Xiaoqing, yANG Zhaoguang, et al. Study on the matrix effect in the determination of selected pharmaceutical residues in seawater by solid-phase extraction and ultra-high-performance liquid chromatography-electrospray ionization low-energy collisioninduced dissociation tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(9): 1471-1475.

[22] TRUFELLI H, PALMA P, FAMIGLINI G, et al. An overview of matrix effects in liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Mass Spectrometry Reviews, 2011, 30(3): 491-509.

[23] 王立琦, 賀利民, 曾振靈, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測獸藥殘留中的基質(zhì)效應(yīng)研究進展[J]. 質(zhì)譜學(xué)報, 2011, 32(6): 321-332.

[24] 李權(quán)龍, 袁東星, 陳猛. 替代物和內(nèi)標物在環(huán)境樣品分析中的作用及應(yīng)用[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2002, 21(4): 46-49.

Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Aquatic Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS-MS)

LI Zhong-chao1,2
(1. Xiamen Products Quality Supervision and Inspection Institute, Xiamen 361004, China; 2. Xiamen Industrial Products Production License Review Technology Center, Xiamen 361004, China)

A method for the simultaneous determination of 78 veterinary drugs in aquatic products (fish, shrimp and shellfish) was established using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Effects of experimental conditions such as extraction solvents and Na2EDTA adding on extraction efficiency were investigated. Under the optimized conditions, recoveries of 78 target drugs calculated from matrix match calibration curve at spiked level of 4 and 20 μg/kg were 40.8%-125.6% for fish, 42.9%-131.9% for shrimp and 43.5%-136.4% for shellfish with RSD (n = 4) of 0.1%-16.0%, 0.1%-14.0% and 0.3%-15.8%, respectively. The detection limits drugs ranged from 0.1 to 0.5 μg/kg. The method is sensitive, accurate and fast and can be successfully applied in the analysis of residual veterinary drugs in shrimp samples from the aquatic farming areas of Zhangzhou, Fujian province.

liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS); simultaneous determination; aquatic products; veterinary drugs

TS207.53

A

1002-6630（2014）16-0217-05

10.7506/spkx1002-6630-201416042

2013-09-07

李仲超（1958—），男，高級工程師，本科，研究方向為食品檢測。E-mail：13806013025@139.com