響應(yīng)面法優(yōu)化鐮刀霉菌JN158產(chǎn)色素培養(yǎng)基

王永威，廖祥儒，黎循航，蔡宇杰

（江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

響應(yīng)面法優(yōu)化鐮刀霉菌JN158產(chǎn)色素培養(yǎng)基

王永威，廖祥儒，黎循航，蔡宇杰*

（江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

用Plackett-Burman試驗設(shè)計和響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）對鐮刀霉菌JN158產(chǎn)色素的發(fā)酵培養(yǎng)基7種營養(yǎng)物質(zhì)配比進行優(yōu)化。結(jié)果表明：蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的添加量顯著影響色素產(chǎn)量；用最陡爬坡試驗使這3個顯著因素的添加量接近最大響應(yīng)區(qū)域，優(yōu)化后，鐮刀霉菌產(chǎn)色素的培養(yǎng)基添加量分別為：蔗糖30.18 g/L、花生餅粉4.86 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl20.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.0122 g/L，預測的最大色素產(chǎn)量是1.268 g/L，驗證實驗得到的色素產(chǎn)量為（1.252±0.011）g/L，與預測值相近，優(yōu)化后色素的產(chǎn)量是以前的2.9倍。

鐮刀霉菌；色素；Plackett-Burman設(shè)計；響應(yīng)面；培養(yǎng)基

色素在人們的生活中起著重要的作用。色素可以改善食品的顏色，是決定產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一，同時，有的色素還具有營養(yǎng)保健和抗腫瘤的作用[1-6]。色素一般分為天熱素色和合成色素。天然色素主要來源于植物、動物和微生物等，一般具有營養(yǎng)保健功能，合成色素雖然有很多優(yōu)點，但是合成色素一般有毒性和致癌性[7-8]，因此，合成色素逐漸被天然色素取代。微生物色素是天然色素的重要發(fā)展方向，微生物色素不僅可以一年四季連續(xù)不斷的發(fā)酵生產(chǎn)，能滿足日益增加的社會需求，而且大部分微生物色素具有活性和醫(yī)療作用[9-11]。

有許多文獻報道真菌在抗腫瘤方面的研究[12]，報道做多的是真菌多糖，常見的是冬蟲夏草多糖[13]和靈芝多糖[14]，關(guān)于鐮刀霉菌色素抗腫瘤的研究很少。本實驗室篩選到一株產(chǎn)色素的鐮刀霉菌（Fusarium sp.）JN158，初步研究表明，該菌株產(chǎn)生的色素具有抗腫瘤[15]作用，且該色素的溶解性質(zhì)也很少見，因為只能溶解于酸性的有機溶劑中，極有可能有是一種新的色素結(jié)構(gòu)，但是，該菌株的色素產(chǎn)量特別低，因此，有必要對該菌株進行發(fā)酵優(yōu)化，提高色素產(chǎn)量，為色素的結(jié)構(gòu)鑒定和抗腫瘤[15]作用研究提供足量的樣品。

響應(yīng)面優(yōu)化法試驗次數(shù)少、周期短、回歸方程精度高[15]，可研究因素之間的交互作用。本實驗首先用Plackett-Burman試驗篩選出對色素產(chǎn)量有顯著影響作用的因素[14]，然后用最陡爬坡試驗逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后進行響應(yīng)面的試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析，得出最佳培養(yǎng)基成分配比，可為后續(xù)有關(guān)此色素的結(jié)構(gòu)鑒定與抗腫瘤方面的實驗奠定產(chǎn)量基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

鐮刀霉菌Fusarium sp. JN158菌株 江南大學生物工程學院篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA種子斜面培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、葡萄糖20、瓊脂20，pH值自然。種子培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、葡萄糖20，pH值自然。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖40、花生餅粉4、K2HPO4·3H2O 0.5、NaCl 0.5、CaCl20.5、MgSO4·7H2O 0.5、FeSO4·7H2O 0.01，pH值自然。

1.1.3 試劑與儀器

高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；ALC-210.3電子天平 德國賽多利斯公司；PB-10 pH計 賽多利斯科學儀器有限公司；EZ585Q冷凍干燥機 美國FTS公司；Agilent1200液相色譜儀 美國安捷倫公司；722分光光度計 上海第三分析儀器廠；DHG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏試驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

在超凈臺內(nèi)，從種子斜面上挑取一環(huán)菌落轉(zhuǎn)移至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，于30℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)28 h，至種子液OD560nm值為3.0。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

按6%的接種量移取鐮刀霉菌種子液（OD560nm值為3.0）至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，在200 r/min、30℃條件下的搖床中培養(yǎng)3d，獲得色素發(fā)酵液。

1.2.3 色素提取

色素發(fā)酵液于8 000 r/min、4℃條件下的冷凍離心機中離心，去除上清液，用蒸餾水洗滌菌體后再次離心，重復3次，得紫色色素菌體；色素菌體在60℃的烘箱中烘干至恒質(zhì)量，得干菌體；干菌體放于裝有50 mL用鹽酸調(diào)至pH 1的無水乙醇的250 mL三角瓶中，在200 r/min、30℃的搖床中浸提10 h，然后，8 000 r/min、4℃冷凍離心，得到紅色色素提取液，用1mol/L的NaOH溶液中和色素浸提液至pH7，此時，色素沉淀，再次冷凍離心，得到藍色色素粗品，色素樣品在510nm波長處有最大吸收[15]。

1.2.4 Plackett-Burman設(shè)計

用Design-Expert 8.0軟件進行Plackett-Burman試驗設(shè)計[16-19]，對色素液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的7種營養(yǎng)成分進行篩選：蔗糖、花生餅粉、K2HPO4·3H2O、NaCl、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O，每個變量分別取高（+）和低（—）兩個水平，以中心點添加量的1/4為Plackett-Burman設(shè)計步長，即高水平添加量為中心點添加量的1.25倍，中心點的添加量是低水平添加量的1.25倍，中心點試驗3次，共15組試驗，每組3次平行，忽略各因素之間的交互作用，設(shè)計結(jié)果見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素水平Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman design

1.2.5 最陡爬坡試驗設(shè)計

由Plackett-Burman試驗數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O對色素產(chǎn)量有顯著影響，以其試驗結(jié)果數(shù)據(jù)擬合得模型方程為依據(jù)，遵循最陡爬坡試驗方法設(shè)計試驗[20]，設(shè)計結(jié)果見表2。

表2 最陡爬坡試驗設(shè)計Table 2 Factors and levels for steepest ascent design

1.2.6 中心組合試驗設(shè)計（central composition design，CCD）

以尋找到的中心點為出發(fā)點進行CCD試驗設(shè)計[21]，每個因素取3個水平。對實驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行多項式回歸分析得到一個二次多項式方程，此方程反映了響應(yīng)量與自變量的關(guān)系，由此可以找出響應(yīng)面最高點，就是最佳的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的含量。中心組合試驗設(shè)計及水平取值見表3。

表3 中心組合試驗設(shè)計水平及編碼Table 3 Factor and levels for central composite design

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果與分析

通過Plackett-Burman試驗，篩選出對鐮刀霉菌JN158液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素有顯著影響作用的營養(yǎng)成分。實驗結(jié)果見表4，方差及回歸分析分別見表5和表6。

由表5方差分析可知，該模型在95%概率水平下是顯著的（P＜0.05），失擬合也顯著（P＜0.05）；由表6回歸分析的結(jié)果可知，對于色素的合成，X1、X2和X7在95%概率水平上有顯著影響，即蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的添加量，其中，蔗糖表現(xiàn)為負效應(yīng)，花生餅粉和FeSO4·7H2O表現(xiàn)為正效應(yīng)，其余各因素均為不顯著。利用Design-Expert8.0軟件對色素產(chǎn)量回歸分析得一元回歸方程：

此模型P=0.0216＜0.05，說明回歸方程顯著；模型的決定系數(shù)：R2=0.908，表明90%實驗數(shù)據(jù)的變化可用該模型解釋。

表4 Plackett-Burman設(shè)計及結(jié)果分析Table 4 Experimental design and results of the Plackett-Burman design

表5 Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析Table 5 Analysis of variance for the results of Plackett-Burman experimental design sign

表6 Plackett-Burman試驗設(shè)計對色素產(chǎn)量回歸分析Table 6 Regression analysis for pigment production based on Plackett-Burman experimental design

2.2 最陡爬坡試驗結(jié)果與分析

由模型方程（1）和回歸分析的結(jié)果可以確定最陡爬坡路徑。對于色素的產(chǎn)量，K2HPO4·3H2O（X3）、MgSO4·7H2O（X4）、NaCl（X5）、CaCl2（X6）在95%概率水平上差異不顯著，故添加量不變。蔗糖（X1）、花生餅粉（X2）、FeSO4·7H2O（X7）在95%概率水平上差異顯著，改變?nèi)叩奶砑恿繉ι氐漠a(chǎn)量的變化有著重要的影響。

表2列出了蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的改變方向及變化步長。由表7可知，試驗4組對應(yīng)的色素產(chǎn)量最高，達到1.023 g/L。所以，以試驗4組所對應(yīng)的蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的添加量為出發(fā)點進行后面響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，即蔗糖28 g/L、花生餅粉4.75 g/L、FeSO4·7H2O 0.0121 g/L。

表7 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 中心組合試驗結(jié)果與分析

以最陡爬坡試驗得到的中心點為基點，進行色素產(chǎn)量優(yōu)化的中心組合設(shè)計。試驗設(shè)計和結(jié)果見表8。

表8 中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8 Experimental design and results of CCD

利用Design-Expert8.0軟件對CCD的試驗數(shù)據(jù)回歸擬合得二次多項式方程：

由表9方差分析及表10回歸分析結(jié)果可知，此模型在99%概率水平下是顯著的（P＜0.05），失擬合顯著（P＜0.05），表明該模型不需要添加更多的因素；另外，此模型的決定系數(shù)R2=0.9707，則此模型可解釋97%的實驗數(shù)據(jù)變化，R2adj=0.9179，與0.9707相近，為色素發(fā)酵提供一個合適的方程模型。

表9 中心組合設(shè)計方差分析Table 9 Analysis of variance for the experimental results of CCD

表10 中心組合試驗設(shè)計回歸分析結(jié)果Table 10 Regression analysis for pigment production based on CCD

由圖1響應(yīng)面可知，蔗糖、花生餅粉和FeSO4·3H2O這三者之間相互有交互作用，對該回歸方程求導得到此模型的最大值，X1=0.545，X2=0.439，X3=0.098，對應(yīng)蔗糖、花生餅粉和FeSO4·7H2O的添加量分別為30.18、4.86g/L和0.0122g/L，最大響應(yīng)值為1.268g/L。優(yōu)化后的培養(yǎng)基：蔗糖30.18g/L、花生餅粉4.86g/L、K2HPO4·3H2O 1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、CaCl20.5 g/L、FeSO4·3H2O 0.0122 g/L。為驗證預測結(jié)果，在此條件下進行色素發(fā)酵實驗，得色素產(chǎn)量為（1.252±0.011）g/L，預測值和實際值相近，說明擬合性較好，菌株優(yōu)化后的色素產(chǎn)量是優(yōu)化前（0.432 g/L）的2.9倍。

圖1 蔗糖、花生餅粉與FeeSSOO4·77HH2O的交互作用影響色素產(chǎn)量的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots showing the effects of sucrose, peanut meal and FeSO4·7H2O on pigment production

3 結(jié) 論

用Plackett-Burman試驗篩選出了對鐮刀霉菌產(chǎn)色素有顯著影響作用的3個因素：蔗糖、花生餅粉、FeSO4·7H2O；由最陡爬坡試驗找到接近最大相應(yīng)區(qū)域的一點：蔗糖28 g/L、花生餅粉4.75 g/L、FeSO4·7H2O 0.0121 g/L；由響應(yīng)面試驗得出最佳培養(yǎng)及配比：蔗糖30.18 g/L、花生餅粉4.86 g/L、K2HPO4·3H2O 1g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCl20.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.0122 g/L，預測的最大色素產(chǎn)量是1.268 g/L，驗證實驗得到的色素產(chǎn)量為（1.252±0.011）g/L，與預測值相近，優(yōu)化后色素的產(chǎn)量是原來的2.9倍，初步研究表明，色素有抗氧化活性和抗癌[12]作用。因此，色素產(chǎn)量的提高，為下一步的色素結(jié)構(gòu)鑒定和抗癌作用方面研究提供足量的色素樣品。

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Optimization of Medium Composition for Pigment Production by Fusarium sp. JN158 with Response Surface Methodology

WANG Yong-wei, LIAO Xiang-ru, LI Xun-hang, CAI Yu-jie*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Plackett-Burman design and response surface methodology (RSM) were applied to optimize 7 components in the medium for pigment production by Fusarium sp.JN158. The results showed that the yield of pigment was mainly infl uenced by the concentrations of glucose, peanut meal and FeSO4·7H2O. With central composite design and RSM, the optimal medium composition and concentrations was determined to be sucrose (30.18 g/L), peanut meal (4.86 g/L), K2HPO4·3H2O(1 g/L)，NaCl (0.5 g/L), MgSO4·7H2O (0.5 g/L), CaCl2(0.5 g/L), and FeSO4·7H2O (0.0122 g/L). The experimental yield of pigment produced by Fusarium sp. JN158 in the optimized medium was (1.252±0.011) g/L, which was close to the predicted value of 1.268 g/L.

Fusarium; pigment; Plackett-Burman design; response surface methodology; medium

Q81

A

1002-6630(2014)01-0120-05

10.7506/spkx1002-6630-201401023

2012-10-25

國家自然科學基金項目（21045007）；江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化（重大科技支撐與自主創(chuàng)新）專項（BY2010117）

王永威（1987—），男，碩士，研究方向為酶與色素。E-mail：weiwei20088725@126.com

*通信作者：蔡宇杰（1973—），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：yu_jie_cai@yahoo.com.cn