米糠甾醇對非酒精性脂肪性肝炎大鼠的治療作用

王一然，賀 蘭，劉進輝，徐 芳，劉湘新，賀建華*

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.益陽市赫山區滄水鋪人民醫院，湖南 益陽 413064； 4.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種由肝細胞脂肪變性發展到炎癥、肝纖維化的一組疾病。隨病程進展表現不一，包括單純性脂肪肝（nonalcoholic simple fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化及其肝硬化和隱源性肝硬化3個階段[1]。其中N ASH降低了同患心血管疾病的NASH患者的存活率，升高了同患Ⅱ型糖尿病的NASH患者罹患肝癌的風險[2]，NAFL和NASH是一個連續病變過程，如在NASH形成前積極干預，可預防NASH的形成及減少肝纖維化及其相關肝硬化的發生。

植物甾醇及其衍生物廣泛應用于食品與美容行業，因其明顯的降脂降膽固醇作用，近年來更作為營養添加劑得到人們關注[3-4]。大量研究結果顯示，植物甾醇具有預防和治療心血管疾病作用，而非酒精性脂肪性肝病是導致心血管疾病的危險因素[5-6]。Xu Zuyuan等[7]研究發現apoE（-/-）小鼠在長期的植物甾醇處理下，能改變apoE（-/-）小鼠肝臟的基因表達，其作用機制可能與植物甾醇抑制膽固醇的吸收有關。Calpe-Berdiel等[8]用全基因組測序和聚合酶鏈式反應法研究了植物甾醇對apoE（-/-）小鼠的小腸和肝臟的作用，結果發現，所有類型小鼠的腸膽固醇吸收都有降低，而血漿膽固醇的降低只發生于apoE（-/-）和LDLR（-/-）小鼠。Hirai等[9]用雌性大鼠研究了膳食脂肪和植物甾醇對血清脂肪酸成分和脂蛋白膽固醇的影響，結果顯示，添加5%植物甾醇到含10%黃油-膽固醇膳食里，減少了原有總膽固醇水平，升高了高密度脂蛋白與低密度脂蛋白+極低密度脂蛋白的比值。

米糠是稻谷加工的副產品，我國年產量約1000萬t，居世界之首，但比起發達國家，我國米糠的經濟利用效率仍有一定差距。米糠油比大豆油含有更豐富的植物甾醇，主要成分為谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇[10-11]，米糠油提取的米糠植物甾醇具有眾多生物活性作用，糠甾醇片也是我國特殊的牙科用藥，可治療牙周炎等牙疾病，具有良好消炎功效。鑒于米糠的上述作用和特性，課題組認為米糠甾醇（rice bran sterol，RBS）可能對非酒精性脂肪性肝炎大鼠具有干預治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

體質量160～190g的健康成年雄性SD大鼠50只，購自長沙市開福區東創實驗動物科技服務部（編號HNACSDC20120324；許可證號SCXK（湘）2009-0012）。

米糠甾醇（純度：75%） 濟寧安康制藥有限責任公司。

造模用高脂飼料配方原料：基礎飼料78.9%、豬油10%、全脂奶粉5%、蛋黃粉5%、膽固醇1%、豬膽鹽0.1%。

基礎飼料 長沙東創實驗動物科技服務部；豬油自制；全脂奶粉 伊利實業集團股份有限公司；蛋黃粉：50%自制，50%購自吉林金翼蛋業有限責任公司；膽固醇（分析純）、豬膽鹽 北京索萊寶科技有限公司。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）試劑盒 南京建成生物工程研究所；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）檢測試劑盒 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒（自制）。

1.2 儀器與設備

KQ2200DV超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司；Thermo1510酶標儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BS200全自動生化分析儀 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；5417R低溫高速離心機 美國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理

SD系雄性大鼠，隨機分成5組，每組10只：Ⅰ組為正常對照組，Ⅱ組為NASH模型組，Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組分別為RBS低、中、高劑量組（65、130、195mg/kg）。美國食品藥品監督總局推薦人每天至少攝入1.3g植物甾醇酯（0.8g植物甾醇）[12]，實驗組米糠甾醇低劑量根據此標準折算（0.8g/70kg×6）。適應性飼喂7d后開始造模，Ⅰ組飼喂普通飼料，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組飼喂高脂飼料，于造模日開始，Ⅰ組和Ⅱ組灌服2%吐溫-80溶液，米糠甾醇各組灌服含2%吐溫-80的米糠甾醇溶液干預，連續13周。

1.3.2 米糠甾醇溶液的制備

米糠甾醇不溶于水和油，為增加大鼠對米糠甾醇的吸收利用，用2%吐溫-80溶液作為米糠甾醇溶劑。配制方法：精密稱取所需劑量米糠甾醇粉末，放入研缽內不間斷研磨20min后，邊研磨邊緩慢加入2%吐溫-80溶劑，繼續研磨至充分混勻。將充分研磨混勻的米糠甾醇溶液隔水放入超聲波儀，超聲0.5h，得米糠甾醇混懸液，冷藏保存，每天給大鼠灌胃前隔水加熱至35℃，米糠甾醇溶液每3d配制一批。

1.3.3 標本的采集和處理

第13周周末最后一次灌胃后，禁食12h，稱體質量。4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，使用真空采血管進行心臟采血，解剖取肝臟、脾臟稱質量。計算其肝臟指數和脾臟指數。

采集的血液放4℃冰箱冷藏過夜，低溫離心機3500r/min離心10min，取上層血清放-70℃冷凍保存備用。肝臟在稱質量后立即放入4%甲醛溶液固定保存，數周后用石蠟包埋切片，HE法染色，光鏡下觀察組織病理學變化。

1.3.4 指標測定

SOD、NOS：實驗第13周周末，心臟采血，4℃、3500r/min離心15min，取上層血清，按試劑盒說明操作。

血清血脂指標檢測：實驗第13周周末，心臟采血，4℃、3500r/min離心15min，取上層血清，用全自動生化分析儀檢測TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。ALT、AST活力的測定按《基礎生物化學實驗方法和技術》[13]中方法檢測。

1.3.5 數據處理方法

2 結果與分析

2.1 肝臟解剖結構觀察

正常對照組肝臟表面光滑，顏色深紅，邊緣清晰。NASH模型組肝臟體積明顯腫大，色澤灰黃，肉眼可見明顯粗顆粒感，表面不光滑；米糠甾醇處理各劑量組肝臟的大體解剖結構相對于NASH模型組都有一定程度改善，但與正常對照組比較仍可見脂肪性病變。

2.2 肝臟組織學觀察

圖1 肝臟組織形態結構（×220000）Fig.1 Morphological structure of liver tissue (×200)

如圖1所示，圖1a中可觀察到炎癥細胞聚集浸潤（→）；肝細胞明顯變大腫脹，細胞內脂滴形成的空泡呈大囊泡性，且大囊泡已融合形成脂囊，胞漿內脂滴將肝細胞核擠至細胞邊緣，部分細胞核裂解并可觀察到肝細胞有氣球樣變形態（←），且細胞間無間隙。圖1b中肝臟細胞形態結構正常，細胞核與胞漿完好，肝細胞索結構清晰完整，血竇清晰。圖1c中米糠甾醇低劑量組大部分細胞形態正常，大多肝細胞胞漿清晰，可觀察到的肝細胞脂肪空泡較少，未觀察到炎癥的聚集浸潤；圖1d中米糠甾醇中劑量組肝細胞脂肪變性程度明顯低于NASH模型組，未觀察到炎癥的聚集浸潤。圖1e中米糠甾醇高劑量組肝細胞脂肪空泡較米糠甾醇低、中劑量組有所增加，但大部分脂肪空泡還未融合，細胞核形態正常可見，與圖1a比較有明顯差異。

2.3 各組大鼠血清相關酶活性測定結果

表1 米糠甾醇對血清酶活性指標的影響Table 1 Effect of RBS on serum enzyme activities

如表1所示，與正常對照組比較，NASH模型組ALT、AST極顯著升高（P＜0.001），AST/ALT比值極顯著下降（P＜0.001）；與NASH模型組比較，米糠甾醇各劑量組ALT和米糠甾醇低、中劑量組AST顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），米糠甾醇各組AST/ALT比值明顯升高（P＜0.01，P＜0.001）。與正常對照組比較，NASH模型組NOS和SOD酶活性顯著升高（P＜0.001，P＜0.05）；與NASH模型組比較，米糠甾醇低劑量組NOS和SOD顯著降低（P＜0.001，P＜0.05）。

2.4 各組大鼠血清血脂含量測定結果

表2 米糠甾醇對大鼠血清血脂水平的影響Table 2 Effect of RBS on serum lipids concentration in rats

如表2所示，與正常對照組比較，NASH模型組HDL-C顯著降低（P＜0.01），與NASH模型組比較，米糠甾醇各組HDL-C均有升高，中劑量組有統計學意義（P＜0.05）；實驗發現，在大鼠非酒精性脂肪性肝病肝炎階段，NASH模型組LDL-C和TC水平與正常 對照組相比無統計學差異，而米糠甾醇中劑量組LDL-C水平和米糠甾醇各劑量組TC水平與NASH模型組比較顯著升高（P＜0.05，P＜0.001）；NASH模型組TG水平低于正常對照組（P＜0.05），米糠甾醇各劑量組與模型組比較稍有升高，但無統計學意義。

2.5 各組大鼠肝臟指數和脾臟指數測定結果

表3 米糠甾醇對大鼠器官指數的影響Table 3 Effect of RBS on organ indexes of rats

如表3所示，NASH模型組肝臟指數和脾臟指數，與正常對照組比較都顯著升高（P＜0.001和P＜0.05），米糠甾醇各劑量組的肝臟指數和脾臟指數與NASH模型組比較均有下降，但無統計學意義。

3 討 論

3.1 米糠甾醇對高脂飼喂大鼠肝臟組織顯微結構的影響

肝臟是脂類代謝的重要器官，它在脂類的吸收、運輸、合成、貯存、分解等過程中均起到重要的作用。長期攝入高脂肪、高熱量飲食會導致肝臟脂肪代謝紊亂，嚴重的脂肪肝可發展為脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬變。連續13周給與大鼠高脂飼料后，肝臟組織顯微組織結果顯示：正常對照組肝臟細胞形態結構正常，細胞核與胞漿完好，肝細胞索結構清晰完整，血竇清晰。NASH模型組肝臟脂肪變性嚴重，肝細胞明顯變大腫脹，細胞內有大量的脂滴形成的空泡，同時有炎癥細胞的聚集浸潤和部分肝細胞壞死。給予米糠甾醇的各干預組肝細胞脂肪病變明顯改善，大部分細胞呈小泡性脂肪變性，無炎癥的聚集浸潤。說明采用米糠甾醇干預后，可明顯減輕由高脂飲食導致的脂肪肝病變，減緩大鼠非酒精性脂肪肝病病程。

3.2 米糠甾醇對高脂飼喂大鼠ALT和AST活性的影響

ALT主要存在于肝細胞漿內，其細胞內濃度高于血清中1000～3000倍。只要有1%的肝細胞壞死，就可以使血清酶增高1倍。因此，ALT被世界衛生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標[14]。造模13周后，NASH模型組ALT活性大大升高，與正常對照組比較，差異極顯著（P＜0.001）。米糠甾醇低、中、高劑量組ALT活性雖然都高于正常對照組，但大大低于NASH組，二者差異極顯著（P＜0.001）。AST主要存在于肝細胞線粒體內，當肝臟發生嚴重壞死或破壞時，才能引起AST在血清中濃度偏高。造模13周后，NASH模型組AST活性升高，與正常對照組比較差異極顯著（P＜0.001），說明長期飼喂高脂飼料，可導致肝細胞嚴重的損傷。米糠甾醇低、中劑量組AST活性低于NASH模型組，二者差異極顯著（P＜0.01，P＜0.001），但米糠甾醇高劑量組AST水平高于NASH模型組（P＜0.05），其原因還需進一步討論。與NASH模型組比較，米糠甾醇各組AST/ALT比值均顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），一般認為正常范圍內，AST/ALT比值越大，肝臟越健康[15]。實驗結果表明：一定劑量范圍內的米糠甾醇能顯著降低高脂大鼠血清中ALT和AST活性，對高脂飼喂下的大鼠肝臟細胞具有明顯的保護作用。

3.3 米糠甾醇對高脂飼喂大鼠肝臟指數和脾臟指數的影響

NASH組大鼠肝臟指數和脾臟指數都比正常對照組顯著升高（P＜0.001和P＜0.05），肝臟質量顯著升高，符合NASH病癥特點，作為主要免疫器官之一的脾臟，其質量增加原因可能是由肝臟損傷累及或肝臟炎癥引起的免疫應答所致，米糠甾醇各劑量組臟器指數比NASH模型組均有下降，但差異無統計學意義。

3.4 米糠甾醇對高脂飼喂大鼠SOD和NOS活性的影響

實驗結果表明：NASH模型組血清SOD值與正常對照組比較顯著升高（P＜0.05），此結果與Zhao Jiasheng等[16]的研究結果一致，NASH大鼠血清SOD值顯著升高可能是由肝細胞壞死破損后大量SOD溢出入血所致；同時某些疾病也會導致血清抗氧化指標升高，如機體炎癥和免疫反應，會產生大量超氧自由基，誘導抗氧化酶的生成[17]，說明在肝炎階段，機體需要更多抗氧化酶來抵御氧化損傷。米糠甾醇低劑量組血清SOD值比NASH模型組顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組也有所下降，提示米糠甾醇還具有消炎和/或清除自由基作用。NO在免疫系統中發揮對抗細菌、病毒、腫瘤細胞等病原體的作用，但過量的NO也會起到毒性作用。內毒素、細胞因子等能夠誘導巨噬細胞等吞噬細胞激活NOS，合成大量NO。NASH模型組血清NOS水平比正常對照組顯著上升（P＜0.001），說明NOS參與了NASH的形成發展。米糠甾醇低劑量組NOS水平（29.21±5.09）U/mL比NASH組顯著降低（P＜0.001），甚至低于正常對照組水平（30.18±9.36）U/mL。而血清NOS的升高與降低在NAFLD病程不同階段對機體具體起到何種作用，還需進一步研究。

3.5 米糠甾醇對高脂飼喂大鼠血脂的影響

HDL-C被稱為“好膽固醇”，有抗動脈粥樣硬化等作用，NASH模型組血清HDL-C比正常對照組顯著降低（P＜0.01），HDL-C的降低是糖尿病、肝炎和肝硬化等疾病的典型病癥；米糠甾醇中劑量組血清HDL-C比NASH組顯著升高（P＜0.05），已接近正常對照組水平，說明該組與NASH模型組比較，清除外周膽固醇的能力增加。NASH模型組血清LDL-C水平和TC水平與正常對照組比較無顯著差異，NASH模型組血清TG水平比正常對照組顯著降低（P＜0.05）。理論上來說，高脂飼料飼喂進行造模時，NASH模型組其血清TG和TC指標應該高于正常對照組，但據資料報道[18]，高脂高膽固醇飲食模型造模過程中，早期各項血脂指標逐步上升，一般在第28天左右出現高峰值，后期可能保持一段時間的穩定，之后會隨著時間的延長而降低。當脂肪性肝病進一步發展到肝硬化時，各項血脂水平下降越明顯，說明肝臟病變越嚴重[19]。本研究結果與張志平等[20]研究結果相似，NASH模型組大鼠血清TG水平與正常對照組比較有所下降。本實驗時間為91d，肝臟顯微結構觀察顯示NASH模型組肝臟脂肪變性嚴重，伴隨有炎癥細胞的聚集浸潤和部分肝細胞壞死，這可能會導 致肝臟其合成TC和TG的能力降低，因此也就導致了NASH模型組TC和TG水平與正常對照組比較無差異甚至反而降低的結果，但具體原因還需要進一步研究。米糠甾醇各劑量組血清TG水平與NASH模型組比較無顯著差異，說明米糠甾醇對TG無明顯干預作用。米糠甾醇各劑量組LDL-C和TC顯著高于NASH模型組（P＜0.05，P＜0.001），此結果進一步提示米糠甾醇對大鼠非酒精性脂肪性肝病可能起到了延緩病程發展的作用。一定劑量范圍內的米糠甾醇能有效預防大鼠非酒精性脂肪性肝炎。

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