等離子體誘變凝結芽孢桿菌提高木糖利用能力高產L-乳酸

蔡 聰，姜 婷，鄭兆娟，歐陽嘉,*

（1.南京林業大學森林資源與環境學院，江蘇 南京 210037；2.南京林業大學 江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室， 江蘇 南京 210037）

等離子體誘變凝結芽孢桿菌提高木糖利用能力高產L-乳酸

蔡 聰1,2，姜 婷2，鄭兆娟2，歐陽嘉1,2,*

（1.南京林業大學森林資源與環境學院，江蘇 南京 210037；2.南京林業大學 江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室， 江蘇 南京 210037）

為進一步提高凝結芽孢桿菌發酵木糖生產L-乳酸的產量和轉化率，以實驗室保存的一株能利用木糖產L-乳酸的野生型凝結芽孢桿菌菌株NL01為出發菌株，通過等離子體誘變育種技術和平板菌落初篩、搖瓶復篩，最終得到一株木糖耐受力強、L-乳酸產量高、遺傳特性穩 定的正向突變菌株NL-CC-17。該突變菌株是目前已報道的木糖耐受力最高的菌株。當以100 g/L的木糖為底物，50℃發酵72 h后，L-乳酸產量達到82.30 g/L，糖酸轉化率為92.37%，L-乳酸產量較出發菌株提高21.51%，糖酸轉化率提高了16.00%。通過初步優化發酵條件，確定該菌株最佳發酵溫度為50℃，實驗范圍內最佳發酵pH值為5.5。

常溫常壓等離子體；凝結芽孢桿菌；誘變；L-乳酸；木糖

乳酸是一種廣泛應用于食品、醫藥、化工等行業的多用途有機酸[1-3]。目前，乳酸的傳統生產工藝主要采用以淀粉質原料為底物發酵生產，這不僅消耗了糧食資源，而且提高了乳酸生產成本[4]。目前，利用豐富且廉價的木質纖維素資源生產乳酸已成為國內外研究的重點[5-6]。木質纖維素經過高溫酸解以及酶解處理，可以轉變成以木糖和葡萄糖為 主的混合糖液。對于以葡萄糖為底物發酵生產L-乳酸的過程已有大量報道[7-9]，而有關發酵木糖生產L-乳酸的報道相對較少。Taniguchi等[10]利用Enterococcus casseliflavus以木糖為底物發酵生產乳酸，產量為38 g/L，糖酸轉化率76%；Ilmén等[11]在重組樹干畢赤酵母菌中表達乳酸菌的L-乳酸脫氫酶，構建的基因工程菌可利用100 g/L木糖生產58 g/L乳酸，糖乳酸轉化率為53%；楊英歌等[12]通過氮離子注入方法選育出一株米根霉利用木糖發酵生產L-乳酸產量為74.37 g/L，糖酸轉化率約74.37%，糖酸轉化率相對較低?？傮w來說，木糖發酵生產乳酸研究發展至今仍然存在糖耐受濃度低、乳酸產量低、糖酸轉化率低等問題，不利于生物質資源的全利用[13]。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變是清華大學自主研發的一種新型誘變育種技術。與常規誘變技術相比，ARTP具有射流溫度低、產生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡單、與生物大分子和細胞作用明顯等優點。前期實驗結果表明，ARTP誘變技術對遺傳物質的損傷機制多樣，能夠快速地突變細菌、真菌、酵母等微生物，獲得多種突變型[14-16]。

本實驗室前期已篩選出一株能利用木糖產L-乳酸的野生型凝結芽孢桿菌菌株NL01，其最大的特點是所產L-乳酸的光學純度很高。為了進一步提高該菌株的木糖耐受能力以及L-乳酸產量和糖酸轉化率，本研究通過等離子體誘變和高糖高酸平板篩選突變菌株，并對正向突變菌株的發酵特性進行研究，以期為今后利用生物質資源生產L-乳酸的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）NL01，誘變原始菌株，由南京林業大學生物化工研究所保存提供。

1.2 培養基

種子培養基：木糖20 g/L、酵母膏2 g/L、玉米漿干粉2.5 g/L、氯化銨1 g/L、無水硫酸鎂0.2 g/L、碳酸鈣20 g/L，pH 7.2。發酵培養基：木糖100 g/L、酵母膏2.5 g/L、玉米漿干粉5 g/L、氯化銨1 g/L、無水硫酸鎂0.5 g/L、碳酸鈣70 g/L，pH 7.2。高糖高酸篩選培養基：木糖100 g/L、乳酸10 g/L、酵母膏2.5 g/L、玉米漿干粉5 g/L、氯化銨1 g/L、無水硫酸鎂0.5 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.2。

1.3 儀器與設備

FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Aminex HPX-87有機酸離子交換柱 美國Bio-Rad公司。

1.4 離子注入誘變

菌體培養至對數后期，加無菌水稀釋至細胞密度OD600nm值略大于1，將稀釋好的菌懸液進行誘變，誘變采用的是清華大學研制的ARTP-Ⅱ型育種機。誘變條件為功率100 W、輻照距離2.5 mm、氦氣通量10 L/min、輻照時間分別為30、60、90、120、180 s。誘變完成后，用無菌生理鹽水適當稀釋后涂布LB平板，再將平板倒置于50℃恒溫箱中培養2 d左右，挑取單菌落進行后期發酵測定實驗。

1.5 菌株的篩選

將出發菌株菌懸液接至LB液體培養基，搖床活化22～24 h后，涂于含不同質量濃度乳酸鈣和木糖的培養平板，50℃培養24 h，觀察菌體生長情況，得到出發菌株的乳酸和木糖臨界抑制質量濃度，由此確定篩選平板。誘變后，從高糖高酸平板上篩選突變菌株。

1.6 分析方法

1.6.1 pH值的測定采用實驗室pH計測定溶液pH值。

1.6.2 生物量的測定采用比濁法，紫外分光光度計測菌液OD600nm值。

1.6.3 木糖及L-乳酸的測定采用Agilent 1200型高效液相色譜儀，Aminex HPX-87有機酸離子交換柱，以5 mmol/L硫酸為流動相，流速為0.6 mL/min，柱溫55℃，示差折光檢測，進樣量10 μL。

L-乳酸相對產量：是相對最高產量得到的百分數，以最高真實產量為100%。

1.6.4 糖酸轉化率的計算

1.6.5 存活率的計算

2 結果與分析

2.1 出發菌株的生長曲線

圖1 凝結芽孢桿菌N L 01的生長曲線Fig.1 Growth curve of B. coagulans NL01

凝結芽孢桿菌NL01在LB液體培養基中，恒溫50℃、180 r/min條件下搖床培養的生長曲線如圖1所示，菌株大約在生長8 h后進入對數生長期，25 h后結束對數生長期轉入穩定期。在實際育種工作中，常選用對數生長期中后期的細菌營養體進行誘變處理，此時的細菌不但菌體濃度合適、生理狀態同步，而且對理化因素敏感，有利于誘變處理[17]。故本實驗中使用生長了22～24 h的細胞作為誘變用出發菌種。

2.2 出發菌株乳酸和木糖臨界抑制質量濃度

出發菌株凝結芽孢桿菌NL01經種子培養基活化后，稀釋一定倍數涂布于含不同質量濃度木糖和乳酸鈣的培養基平板上，50℃恒溫培養1～2 d后，結果如表1所示。

表1 出發菌株乳酸與木糖臨界抑制質量濃度Table 1 Critical inhibitory concentration of lactic acid and xylose for strain NL01

由表1可知，出發菌株在含30 g/L乳酸鈣和100 g/L木糖的平板上表現出嚴重抑制現象。后續實驗中高糖高酸篩選平板配方中木糖和乳酸鈣的質量濃度分別選擇100 g/L和30 g/L。

2.3 出發菌株的誘變和篩選

2.3.1 出發菌株的誘變條件確定

圖2 凝結芽孢桿菌NL01離子誘變存活曲線Fig.2 Ion mutagenesis survival curve of B. coagulans NL01

根據誘變理論研究，80%～90%的致死率有利于正突變菌株的產生[18-20]，并且此時等離子的注入在離子進入細胞內時，激活了細胞的修復機制和修復所需要的酶[21-23]，故本實驗選擇存活率為17%左右、輻照60 s的菌液平板挑取單菌落進行發酵測定。

2.3.2 誘變突變株的發酵性能及高產菌的篩選

從離子注入誘變后的篩選平板挑取100株長勢良好的菌株活化12 h，以木糖為唯一碳源發酵72 h，初始糖質量濃度為100 g/L，發酵72 h，最后通過對比L-乳酸產量及其糖酸轉化率，選定了NL-CC-17、NL-CC-25、NL-CC-37、NL-CC-54、NL-CC-89這5株菌又進一步進行發酵能力測試，結果如表2所示，在L-乳酸產量和糖酸轉化率對比的基礎上，又利用高效液相色譜對其乳酸光學純度進行了綜合對比，最后選定菌株NL-CC-17進行下一步的實驗。

表2 誘變后菌株的木糖發酵能力Table 2 Xylose fermentation capacity for mutant strains

2.3.3 對篩選出的菌種進行遺傳穩定性實驗

為了鑒定篩選到的高產菌能否穩定地遺傳，對菌株NL-CC-17做了遺傳穩定性考察。每代實驗過程為：高產菌株→種子培養→搖瓶發酵→種子培養→搖瓶發酵，第2次發酵的接種液為上1次發酵72 h的發酵液。發酵72 h后測L-乳酸產量。共傳5代，每代均做3個平行，結果見表3。

表3 菌株NL-CC-17的發酵穩定性實驗Table 3 Fermentation stability of strain NL-CC-17

由表3可知，第一代產酸能力較弱，這是因為第一代菌株的接種液是來自超低溫冰箱里保存的種液，活力較差。但是其他幾代的乳酸產量基本維持在82 g/L左右。ARTP的誘變機理是采用含有多種化學活性粒子的氦氣使DNA等造成遺傳物質損傷，微生物啟動SOS修復機制進行容錯性修復，因此，ARTP多樣性的損傷將可能在修復過程中包容于DNA鏈中并使其穩定的遺傳下去[21-23]?；诖?，通過等離子體誘變技術獲得的凝結芽孢桿菌突變株遺傳穩定性較好。與對照相比，突變株最高產量為83.20 g/L，L-乳酸產量較出發菌株提高了21.51%，糖酸轉化率提高了16.00%。

2.4 凝結芽孢桿菌木糖發酵性能的研究

2.4.1 木糖質量濃度對菌株NL-CC-17發酵性能的影響

圖3 不同木糖質量濃度發酵生產L--乳酸（A）及其殘糖（B）隨時間的變化Fig.3 Effects of different initial xylose concentrations on L-lactic acid (A) and redidual sugar (B) production

測試誘變篩選后的菌種利用木糖發酵的能力，設置木糖質量濃度分別為60、80、100、120、140、160 g/L，每隔24 h取樣，發酵5 d，測定木糖及其L-乳酸的產量并繪制發酵曲線。由圖3A、B可知，在木糖質量濃度為100 g/L時，發酵120 h木糖基本被利用完全，L-乳酸產量為81.28 g/L，隨著木糖質量濃度的升高，L-乳酸產量降低，發酵受到抑制，分析原因可能為高質量濃度的木糖對菌株細胞的滲透壓有影響，從而影響整個代謝過程。

以往文獻[24]報道，凝結芽孢桿菌發酵木糖的底物最高耐受質量濃度約為70～80 g/L，與本實驗野生型菌株實驗結果類似。經過等離子體誘變后，菌株的木糖耐受質量濃度明顯提高，可以在100 g/L的底物質量濃度下快速代謝木糖，突變效果良好。突變菌株凝結芽孢桿菌NL-CC-17是目前報道的木糖利用能力最好的菌株。

2.4.2 發酵條件對菌株NL-CC-17的影響

溫度和pH值是影響發酵產量的重要條件，凝結芽孢桿菌屬于耐熱菌，生長溫度可達55℃以上，而且其發酵pH值較低。本實驗研究了溫度在35～60℃、pH值在5.5～7.5范圍內的發酵條件對乳酸產量的影響，結果如圖4和圖5。

圖4 不同溫度對L-乳酸發酵的影響Fig.4 Effect of temperature on L--lactic acid production

圖5 不同起始pHH值對L-乳酸發酵的影響Fig.5 Effect of initial pH on L--lactic acid production

由圖4可知，L-乳酸的產量和糖利用率隨發酵溫度的變化非 常明顯，當發酵溫度為50℃時，L-乳酸產量和糖利用率均達到最高點，當發酵溫度升高到55℃時L-乳酸的產量有明顯的降低，只有17.75 g/L。因此，此菌的最適發酵溫度為50℃。由圖5可知，隨著起始pH值的升高，L-乳酸的產量逐步降低，糖酸轉化率亦下降，在pH 5.5時L-乳酸產量最高，為73.43 g/L，因此pH 5.5為實驗范圍內最佳發酵pH值。

3 結 論

本實驗針對目前L-乳酸生產菌株在木糖利用上的缺陷，以野生型凝結芽孢桿菌NL01作為出發菌株，采用等離子體誘變育種技術選育出了一株木糖發酵特性優良的L-乳酸高產菌株NL-CC-17，該菌株是目前報道的木糖利用能力最好的菌株。

3.1 凝結芽孢桿菌NL01的木糖臨界抑制質量濃度為100 g/L，乳酸鈣臨界抑制質量濃度為30 g/L。由此確定高糖高酸篩選平板配方中木糖和乳酸鈣的質量濃度分別為100 g/L和30 g/L。

3.2 通過等離子體誘變育種技術對凝結芽孢桿菌NL01進行誘變處理，研究了不同注射時間下菌株的存活率，控制離子注入機功率在100 W左右，輻照距離2.5 mm，氦氣通量10 L/min，實驗結果顯示最佳輻照時間為60 s。經木糖發酵測定，L-乳酸產量較出發菌株提高了21.51%，糖酸轉化率提高了16.00%。

3.3 通過對木糖發酵實驗的初步優化，確定了木糖的最適初始質量濃度為100 g/L，最適發酵溫度為50℃，實驗范圍內最適發酵pH值為5.5。

[1] GAO C, MA C, XU P. Biotechnological routes based on lactic acid production from biomass[J]. Biotechnology Advances, 2011, 29(6): 930-939.

[2] JOHN R P, NAMPOOTHIRI K M, PANDEY A. Fermentative production of lactic acid from biomass: an overview on process developments and future perspectives[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74(3): 524-534.

[3] DATTA R, HENRY M. Lactic acid: recent advances in products, processes and technologies: a review[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2006, 81(7): 1119-1129.

[4] 趙國振, 熊向峰, 陳朝銀. 直接乳酸發酵工藝的研究進展[J]. 食品工業科技, 2009, 30(12): 410-413.

[5] PATEL M A, OU M S, HARBRUCKER R, et al. Isolation and characterization of acid-tolerant, thermophilic bacteria for effective fermentation of biomass-derived sugars to lactic acid[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(5): 3228-3235.

[6] PATEL M, OU M, INGRAM L O, et al. Fermentation of sugar cane bagasse hemicellulose hydrolysate to L(+)-lactic acid by a thermotolerant acidophilic Bacillus sp.[J]. Biotechnol Letters, 2004, 26(11): 865-868.

[7] QIN Jiayang, ZHAO Bo, WANG Xiuwen, et al. Non-sterilized fermentative production of polymer-grade L-lactic acid by a newly isolated thermophilic strain Bacillus sp. 2–6[J]. PLoS ONE, 2009, 4(2): e4359.

[8] WANG Limin, ZHAO Bo, LIU Bo, et al. Efficient production ofL-lactic acid from cassava powder by Lactobacillus rhamnosus[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(20): 7895-7901.

[9] OUYANG Jia, MA Rui, ZHENG Zhaojuan, et al. Open fermentative production of L-lactic acid by Bacillus sp. strain NL01 using lignocellulosic hydrolyzates as low-cost raw material[J]. Bioresource Technology, 2013, 135: 475-480.

[10] TANIGUCHI M, TOKUNAGA T, HORIUCHI K, et al. Production of L-lactic acid from a mixture of xylose and glucose by co-cultivation of lactic acid bacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2004, 66(2): 160-165.

[11] ILMéN M, KOIVURANTA K, RUOHONEN L, et al. Efficient production of L-lactic acid from xylose by Pichia stipitis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(1): 117-123.

[12] 楊英歌, 李文, 柳丹, 等. 氮離子注入選育高效發酵木糖生產L(+)-乳酸的米根霉[J]. 輻射研究與輻射工藝學報, 2007, 25(2): 81-84.

[13] 付曉芬, 江均平, 張杰, 等. 微生物利用木糖發酵L-乳酸代謝途徑的研究[J]. 食品工業科技, 2009, 30(8): 359-362.

[14] 金麗華, 方明月, 張翀, 等. 常壓室溫等離子體快速誘變產油酵母的條件及其突變株的特性[J]. 生物工程學報, 2011, 27(3): 461-467.

[15] WANG L Y, HUANG Z L, LI G, et al. Novel mutation breeding method for Streptomyces avermitilis using an atmospheric pressure glow discharge plasma[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108(3): 851-858.

[16] 金麗華, 方明月, 張翀, 等. 常壓室溫等離子體快速誘變產油酵母的條件及其突變株的特性[J]. 生物工程學報, 2011, 27(3): 461-467.

[17] 趙鑫, 趙良啟, 劉春卉, 等. 離子注入L-乳酸產生菌誘變選育研究[J].生物技術, 2004, 14(6): 24-25.

[18] 張曉勇, 陳秀霞. 低能離子誘變育種作用機理及生物學效應研究進展[J]. 廣東農業科學, 2008(6): 20-22.

[19] SONG Yun, ZHANG Huaiyu, CHANG Zhijian. Progress of mutation breeding with ion beam implantation[J]. Molecular Plant Breeding, 2004, 2(2): 301-305.

[20] FENG Huiyun, YU Zengliang, CHU P K. Ion implantation of organisms[J]. Materials Science and Engineering, 2006, 54(3/4): 49-120.

[21] 宮春波, 劉鷺, 謝麗源, 等. 離子注入微生物誘變育種研究進展[J].生物技術, 2003, 13(2): 47-49.

[22] YU Long, ZHOU Jian, YU Zengliang. Screening of L-lactic acid producing bacteria by low energy ions implantation and preliminary research of fermentation conditions[J]. 激光生物學報, 2005, 14(3): 184-188.

[23] ZHOU Xiaonan, YE Hui, ZHU Suwen, et al. Screening high-yield bacteria Rhizopus chinensis carrying L-lactic acid by low energy ions implantation[J]. 激光生物學報, 2008, 17(3): 408-411.

[24] WANG Limin, ZHAO Bo, LIU Bo, et al. Efficient production of L-lactic acid from corncob molasses, a waste by-product in xylitol production, by a newly isolated xylose utilizing Bacillus sp. strain[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(20): 7908-7915.

Improved Xylose Utilization of Bacillus coagulans by Atmospheric and Room Temperature Plasma Mutation for Production of Lactic Acid

CAI Cong1,2, JIANG Ting2, ZHENG Zhao-juan2, OUYANG Jia1,2,*
(1. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Jiangsu Key Laboratory of Biomass-based Green Fuels and Chemicals, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

To further enhance the production and yield of converting xylose to L-lactic acid, an atmospheric- and room temperature-plasma (ARTP) mutation system was employed to induce the mutation of Bacillus coag ulans NL01, a wild-type strain for production of L-lactic acid from xylose. A positive mutant, named as NL-CC-17, was obtained through enrichment and screening. Compared with that of previously reported strains, NL-CC-17 had an improved tolerance to xylose. This strain was capable of converting 100 g/L xylose into 82.30 g/L L-lactic acid after being cultured at 50 ℃ for 72 h with a yield of 92.37%. The concentration of L-lactic acid was increased by 21.51% and the yield by 16.00%. After preliminary optimization of fermentation conditions, the optimal fermentation temperature was determined as 50 ℃ and the optimal pH as 5.5.

atmospheric and room temperature plasma (ARTP); Bacillus coagulans; mutation; L-lactic acid; xylose

Q815

A

1002-6630(2014)01-0125-05

10.7506/spkx1002-6630-201401024

2012-11-09

國家自然科學基金項目（31200443）；江蘇省杰出青年基金項目（BK2012038）；國家“863”計劃項目（2012AA022301）

蔡聰（1987—），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程。E-mail：caicong1987@163.com

*通信作者：歐陽嘉（1972—），女，教授，博士，研究方向為酶與發酵工程。E-mail：hgouyj@njfu.edu.cn