青菜腌制過程中腐敗表層細菌的多樣性分析與群落演替

李 可，張 慶,*，陳 功，林 凱，袁春紅，賈碧洪，鐘小廷，向文良

（1.西華大學生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，西華大學古法發酵（釀造）生物技術研究所，四川 成都610039；2.四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 611130）

青菜腌制過程中腐敗表層細菌的多樣性分析與群落演替

李 可1，張 慶1,*，陳 功2，林 凱1，袁春紅1，賈碧洪1，鐘小廷1，向文良1

（1.西華大學生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，西華大學古法發酵（釀造）生物技術研究所，四川 成都610039；2.四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 611130）

通過構建16S rRNA基因文庫揭示青菜腌制過程中腐敗表層細菌群落構成，利用Shannon-Weaver（H）、Chao、ACE、Simpson、覆蓋度和相關性指數分析群落的多樣性及演替關系。系統發育分析顯示，從樣品中獲得的16S rRNA基因序列分別被歸為Vibrio、Halomonas、Pseudoalteromonas、Shewanella、Marinomonas、Geobacillus、Pseudomonas、Psychrobacter、Cobetia、Oceanobacillus、Pantoea和Lactobacillus屬。其中能夠產生亞硝酸鹽的致病性Vibrio屬細菌為腐敗表層鹵水中的優勢菌，分別占腌制7、22、60 d細菌總數的45.8%、74.2%、44.9%，Pseudoalteromonas、Shewanella、Pseudomonas等屬腐敗性細菌主要分布在第7天的樣品中，受高鹽環境的影響，Cobetia、Halomonas等嗜鹽菌和Lactobacillus屬細菌的數量隨時間的延長逐漸增多。7、22、60 d樣品菌群相關性系數由0.5131降至0.4064，隨之又升高至0.8168。結果表明：腐敗表層鹵水中細菌在青菜腌制過程中介導腐敗并產生有害成分，其群落結構隨腌制過程演替。

青菜腌制；鹽鹵；細菌多樣性；16S rRNA；群落演替

蔬菜的腌制是中華民族對世界食品發展的特殊貢獻之一，并在人類文明發展歷程中成為全球最普遍和大眾化的蔬菜貯藏和加工方式。蔬菜腌制主要以各種蔬菜為原料，同時添加食鹽、蔥、姜、蒜、香辛料等多種成分，借助于蔬菜表面附著的微生物在鹽鹵中發酵而成[1]。在發酵過程中，不同微生物以蔬菜為營養基質，借助其生長與代謝特性的差異，通過競爭、協同等作用調節蔬菜腌制過程中微生物的種類和數量消長，從而形成腌制蔬菜特殊的風味[2-3]。但是，在腌制過程中往往由于酵池封閉不嚴、操作不當和生產環境因素等的影響，會造成表層腌制蔬菜中大量的腐敗 微生物滋生。這些腐敗微生物的存在打破了蔬菜腌制系統中原有的微生物生態平衡，不僅改變了腌制蔬菜的特有風味，而且存在極大的食品安全風險。

腐敗微生物引起的腌制蔬菜腐敗是蔬菜腌制過程中最主要的腐敗原因。目前，對于蔬菜制品腐敗微生物的研究，多見于對1種腐敗微生物腐敗特性或食品中腐敗微生物控制方法上的研究[4-5]，而鮮有文獻對腐敗食品中微生物種類及菌群結構進行研究。四川泡菜是中國泡菜的典型代表，在四川泡菜生產的腌制環節中每年由于腐敗微生物引起的蔬菜腐敗約占泡菜加工量的5%～7%，直接經濟損失8～10億元人民幣[6]。然而，目前還未見有關四川泡菜腌制過程中腐敗微生物的相關報道。

基于此，本研究主要以四川泡菜生產環節中的腌制青菜為對象，直接從腌制青菜腐敗表層的鹽鹵中提取總DNA，利用16S rRNA基因文庫分析技術解析青菜腌制過程中表層腐敗細菌的多樣性，同時利用Baroni-Urbani相關性系數探尋這些細菌伴隨腌制過程而發生的群落演替關系，為下一步探尋合理、有效控制四川泡菜生產環節中青菜腌制腐敗的措施提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品為四川某泡菜公司青菜腌制池上層腌制7 d（P1）、22d（P2）和60 d（P3）的含7 g/100 mL NaCl的鹽鹵。

A.E.Z.N.A.TMSoil DNA Kit Plasmid Mini Kit Ⅰ 美國Omega公司；pGEM-T Easy Vector System Ⅰ 美國Promega公司；Taq DNA聚合酶 日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 鹽鹵樣品總DNA提取及16S rRNA基因PCR擴增

樣品采集后立即按照A.E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit進行總DNA的提取，提取的總DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR擴增細菌的16S rRNA 基因。PCR體系：30 μL ddH2O，5 μL 10×PCR Reaction Buffer（無Mg2+），6 μL MgCl2（25 mmol/L），4 μL dNTP（2.5 mmol/L），引物Eu27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1 490 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）各1 μL，1 μL Taq聚合酶（2.5 U/μL），2 μL總DNA模板。PCR程序參考Xiang Wenliang等[7]的方法，簡述如下：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環；72℃保持10 min。

1.2.2 16S rRNA 基因克隆文庫構建

按照pGEM-T Easy Vector System I說明將PCR產物連接至pGEM-T載體，并轉化至感受態細胞E.coli DH5α中，涂布于含Amp（100 μg/mL）、IPTG（24 μg/mL）和X-gal（40 μg/mL）的LB培養基平板上，篩選陽性克隆子。

1.2.3 16S rRNA測序及系統發育樹構建

挑取陽性克隆子，按照Plasmid Mini Kit I說明提取重組質粒，經EcoR I酶切檢測后含有完整16S rRNA的重組質粒采用Applied Biosystems DNA Sequencer（model 377）自動測序。測序結果與數據庫NCBI BLAST比對后，再通過Clustal X1.8軟件將代表序列與數據庫中所得序列進行完全比對，利用MEGA5.0軟件Neighbor-Joining法進行1 000次步長計算構建系統發育樹。代表序列提交至GenBank數據庫，獲得序列號：KC502871～KC502885。

1.2.4 數據分析及基因文庫評估

獲得的序列用CLASSIFIER（RDPII，http://rdp.cme. msu.edu./classifier/classifier.jsp）進行分類，利用BioEdit軟件對所有序列進行兩兩比對，同源性大于97%的歸為同一個操作分類單元（OTU）。根據所得OTU個數以及每個OTU樣本豐富度，利用Rarefaction 1.3軟件進行分析并繪制稀釋度曲線。采用Estimates Win 8.0計算Shannon-Weaver、Sobs、SChao1、SACE等多樣性指數以及Simpson優勢度指數分析比較細菌物種的多樣性，利用下式計算文庫覆蓋度指數；利用DPS v7.05軟件計算不同腌制時期腐敗細菌的群落結構的Baroni-Urbani相關性系數，探尋微生物菌群伴隨腌制過程而表現的演替關系。

2 結果與分析

2.1 青菜腌制腐敗表層鹽鹵中微生物的多樣性

圖1 基于OTU豐富度及OTU分類個數的16S rRNNAA基因文庫稀釋度曲線分析Fig.1 The rarefaction analysis of 16S rRNA clone libraries based on abundance and classification number of OTU

稀釋度曲線是一種有效的形態學和分類多樣性分析方法[8]，在本研究中，稀釋度曲線分析發現，3個樣品中OTU數目隨著16S rRNA克隆子數的增加而增加，并趨于平緩，如圖1所示。這表明本研究中構建的3個16S rRNA文庫已趨于飽和，所獲得的克隆子代表的微生物種類和數量能夠比較全面和真實地表征樣品細菌群落，體現群落的結構類型、組織水平和發展階段。此外，細菌的多樣性分析結果進一步證明以上結論，其中，青菜腌制7、22、60 d的腐敗表層v中細菌的豐富度指數SACE和SChao1分別為10.5和10、6和6、10.5和10，覆蓋度分別為97.6%、100%和97.6%（表1）。3個樣品中的多樣性指數分別為1.98、1.25和2.02，Simpson優勢度指數分別為6.26、2.48和7.02。以上結果表明，該方法所檢測的微生物結構菌群能夠表征青菜腌制池中97.6%到100%的腐敗微生物種類及數量。

表1 青菜不同發酵時期鹽鹵樣品中OTU豐富度和多樣性評估Table 1 The abundance and diversity estimation of OTU derived from brine samples during different fermentation periods

2.2 青菜腌制腐敗表層微生物的分布

圖2 不同發酵時期鹽鹵樣品中各種細菌分布Fig.2 Bacterial distribution in three samples during different periods of pickled leaf mustard

將所測得的序列提交至RDP進行分類。該214個克隆子分別歸于Vibrio、Halomonas、Pseudoalteromonas、Shewanella、Marinomonas、Geobacillus、Pseudomonas、Psychrobacter、Cobetia、Oceanobacillus、Pantoea和Lactobacillus。其中Vibrio（38/83）和Psychrobacter（13/83）為P1期的優勢菌群，Vibrio（46/62）為P2期的優勢菌群，Vibrio（31/69）、Cobetia（11/69）和Lactobacillus（10/69）為P3時期的優勢群，具體細菌分布情況如圖2所示。根據以上3個樣品所得序列構建克隆文庫，分別從發酵7、22、60 d樣品中得到83、62、69個克隆子，再分別將各文庫中序列的同源性＞97%的聚成一個OTU，3個文庫分別獲得10、6和10個OTU，大部分OTU均含有多個克隆子，僅少數OTU僅含有一個克隆子。

2.3 青菜腌制腐敗表層微生物的系統發育

圖3 基于16S rRNA構建的青菜不同發酵時期鹽鹵中細菌系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria in brine samples during different fermentation periods based on 16S rRNA sequence

Devereux等[9]認為當16S rRNA的序列同源性≥97%時可以認為是一個屬，同源性≥98%時則可以認為是同一個種。為了進一步探明青菜腌制腐敗表層鹵水中微生物的系統發育地位及進化信息，選取每個OTU的代表序列與GenBank中菌株的16S rRNA序列進行全序列比對，找到相近序列后，利用Neighbor-Joining方法計算各16S rRNA序列之間的親緣關系，構建系統發育樹，結果如圖3所示。除代表序列P1-19外，各OTU代表序列都與NCBI數據庫中典型菌株16S rRNA序列同源性在98%以上，分別與Vibrionales目的Vibrio azureus、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio litoralis；Bacillales目的Oceanobacillus sojae和Geobacillus gargensis；Lactobacillales目的Lactobacillus sakei；Enterobacteriales目的Pantoea ananatis；Alteromonadales目的Pseudoalteromonas mariniglutinosa和Shewanella morhuae；Pseudomonadales目的Pseudomonas fluorescens和Psychrobacter glacincola；Oceanospirillales目的Marinomonas arenicola、Cobetia marina和Halomonas halodenitrifi cans聚為一枝。P1-19與NCBI數據庫中典型菌株Vibrio penaeicida序列同源性為97%，在系統發育樹上聚為一簇，說明它們在進化上同源性較高，但有可能是潛在的新種，具體分類有待進一步研究。

2.4 青菜腌制腐敗表層中微生物群落的演替

微生物群落的演替是存在于各種環境的一種常見現象，由于微生物具有較短的代時且其對環境變化較為敏感，在蔬菜腌制過程中，微生物群落結構的變化能夠及時反應環境的變化，并且決定環境及產品的特性。因此，可以通過了解微生物種群之間的演替關系評估和判斷腌制過程。由表2可知，在青菜腌制過程中，隨著腌制時間的延長，3個時期微生物相關性系數由0.513 1降低至0.406 4，隨之又升高至0.816 8。結果表明，微生物群落結構隨著青菜腌制過程的變化而發生變化，微生物的種類和數量與青菜的腐敗過程存在著一定的相關性。

表2 青菜不同發酵時期鹽鹵樣品中細菌群落Baroni-Urbani & Buser相似性系數Table 2 Similarity coefficient of Baroni-Urbani and Buser based on the bacterial community of three brine samples

3 討 論

蔬菜腌制是全球最普遍和大眾化的食品加工和貯藏方式之一，腌制的蔬菜以其爽滑脆嫩的品質廣受消費者的歡迎。然而，隨著人們對食品安全越來越重視，食品腐敗尤其是由微生物引起的食品腐敗成為食品行業的一個亟待解決的重要問題[4]。目前，國內有關食品腐敗機制的研究多停留在對腐敗現象表面認識的研究，而忽略了對蔬菜腌制過程中腐敗微生物的菌群結構及演替這一關鍵因素的研究，因此，基于腐敗表象認識基礎上進行的防腐技術研究也表現出一定的局限性。本實驗利用16S rRNA技術分析腐敗過程中微生物多樣性及其演替關系，結果顯示，在腌制青菜腐敗表層微生物主要為致病性微生物，常見于海水和海產品，且微生物菌群結構與青菜腌制過程相關。本研究為從根本上認識和解決青菜腌制過程中的微生物腐敗現象提供科學借鑒。

翁佩芳[10]、李文斌[11]等對泡菜中微生物的研究表明，泡菜中功能微生物菌群是由乳桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬和希臘魏斯氏菌屬構成，并且起主導作用的為植物乳桿菌。而在本實驗青菜腌制過程中，腐敗表層鹵水中存在較多的為致病性的Vibrio屬。在前期，腐敗表層鹵水中微生物主要為Vibrio、Shewanella、Pseudomonas、Pantoea、Phyllobacterium、Oceanobacillus和Geobacillus屬細菌，這些細菌多數來源于青菜的表面和環境。V. penaeicida為該時期的優勢菌，該菌是一種能夠引起河蝦弧菌病93綜合征的主要菌種之一[12-13]。同時被檢測到的Pseudoalteromonas、 Shewanella、Pseudomonas屬細菌能夠產生多種胞外酶，與具有淀粉水解能力的Vibrio屬細菌一起在降解蔬菜中的纖維素、果膠、淀粉、蛋白質、幾丁質方面發揮作用[5,14-16]，其中Pseudomonas和Shewanella也是腐敗海產品樣品中的主要菌[17]。這些菌在蔬菜腌制過程中能夠引起蔬菜質構發生變化，同時為腐敗中后期其他菌群的生長和繁殖提供條件，因此它們是引起蔬菜腐敗變質的主要菌。

本實驗青菜腌制至22 d，由于受到腌制環境因素的限制，嗜鹽菌和乳酸桿菌的數量有所上升，Pseudoalteromonas、Shewanella、Pseudomonas、Pantoea、Oceanobacillus 和 Geobacillus等屬細菌數量下降甚至低于檢測限，而V. penaeicida依然是優勢菌，同時也檢測出前期未檢測到的V. parahaemolyticus。V. parahaemolyticus不僅能引起河蝦的弧菌病，還是一海水和海產品中常見的導致O3∶K6血清型流行病的致病菌，具有較強的致病能力及食源性傳染，尤其是在亞洲、北美等地，因此受到各國的重視[18-19]。此外，V. parahaemolyticus、V. penaeicida與腌制60 d檢測到得的V. litaralis均具有將鹵水中的NO3－還原為NO2－的能力，增加了泡菜中亞硝酸鹽的含量，因此Vibrio屬細菌的大量存在可能是導致腌制蔬菜中亞硝酸鹽含量超標的主要原因之一。隨著腌制時間的延長，至腌制60 d，V. parahaemolyticus逐漸成為優勢菌；同時乳酸菌L. sakei和嗜鹽菌C. marina、H. halodenitrificans的數量明顯增加。L. sakei是肉及海產品中常見的一種菌，由于其產酸、細菌素等特性在抑制腐敗、致病性微生物和增香等方面發揮作用，可以用作肉制品發酵用曲和用于食品保藏延長貨架期[20-21]，該菌可能在減少腌制過程中Vibrio屬和其他腐敗性微生物數量起到關鍵作用。嗜鹽菌C. marina和H. halodenitrificans數量增加與其腌制池中的高鹽環境的適應性有關，但是其在蔬菜腐敗及蔬菜腌制過程中的作用有待進一步研究。

本實驗通過對青菜中腐敗微生物群落結構的分析探明影響腌制青菜安全性的生物學因素，結果表明：青菜腌制過程中腐敗表層微生物主要為具有致病性和亞硝酸鹽產生能力的Vibrio屬及Pseudomonas、Shewanella、Pseudoalteromonas等屬腐敗性微生物，并且微生物群落結構與腌制過程表現出相關性。該研究結果為控制青菜腌制過程中腐敗微生物的生長、提高食品質量安全具有重要的意義。

[1] 吳祖芳, 趙永威, 翁佩. 蔬菜腌制及其乳酸菌技術的研究進展[J]. 食品與生物技術學報, 2012, 31(7): 678-686.

[2] 王金菊, 崔寶寧, 張治洲. 泡菜風味形成的原理[J]. 食品研究與開發, 2008, 29(12): 163-166.

[3] 陳飛平. 微生物發酵對蔬菜腌制品品質的影響[J]. 中國食物與營養, 2009 (9): 28-30.

[4] 鐘少樞, 吳克剛, 柴向華, 等. 七種單離食用香料對食品腐敗菌抑菌活性的研究[J]. 食品工業科技, 2009, 30(4): 68-71.

[5] 席宇, 朱大恒, 劉紅濤, 等. 假交替單胞菌及其胞外生物活性物質研究進展[J]. 微生物學通報, 2005, 32(3): 108-112.

[6] 陳功. 中國泡菜加工技術[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2011: 111-115.

[7] XIANG Wenliang, LIANG Huazhong, LIU Sen, et al. Isolation and performance evaluation of halotolerant phosphate solubilizing bacteria from the rhizospheric soils of historic Dagong Brine Well in China[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 27(11): 2629-2637.

[8] FOOTE M. Rarefaction analysis of morphological and taxonomic diversity[J]. Paleobiology, 1992, 18(1): 1-16.

[9] DEVEREUX R, HE S H, DOYLE C L, et al. Diversity and origin of Desulfovibrio species: phylogenetic definition of a family[J]. Journal of Bacteriology, 1990, 172(7): 3609-3619.

[10] 翁佩芳, 陳希, 沈錫全, 等. 榨菜低鹽腌制細菌群落多樣性的分析[J].中國農業科學, 2012, 45(2): 338-345.

[11] 李文斌, 宋敏麗, 唐中偉, 等. 自然發酵泡菜微生物群落變化的研究[J].中國食物與營養, 2008(11): 22-24.

[12] GOARANT C, MERIEN F. Quantification of Vibrio penaeicida, the etiological agent of Syndrome 93 in New Caledonian shrimp, by real-time PCR using SYBR Green Ⅰ chemistry[J]. Journal of Microbiological Methods, 2006, 67(1): 27-35.

[13] SAULNIER D, AVARRE J C, MOULLAC G L, et al. Rapid and sensitive PCR detection of Vibrio penaeicida, the putative etiological agent of Syndrome 93 in New Caledonia[J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2000, 49(2): 109-115.

[14] 孫菽蔚, 岳海東, 肖天. 一株海洋幾丁質酶產生菌的篩選及其產酶條件的初步研究[J]. 海洋科學, 2007, 31(5): 10-16.

[15] 張書文, 劉鷺, 李紅娟, 等. 熒光假單胞菌胞外蛋白酶的純化及特性研究[J]. 食品科學, 2012, 33(9): 206-210.

[16] 侯進慧, 陳宏偉, 曹澤虹, 等. 鯽魚腸道細菌菌群初步分析[J]. 食品科學, 2010, 31(11): 178-181.

[17] PARLAPANI F F, MEZITI A, KORMAS K A, et al. Indigenous and spoilage microbiota of farmed sea bream stored in ice identified by phenotypic and 16S rRNA gene analysis[J]. Food Microbiology, 2013, 33(1): 85-89.

[18] SU Yicheng, LIU Chengchu. Vibrio parahaemolyticus: a concern of seafood safety[J]. Food Microbiology, 2007, 24(6): 549-558.

[19] KUDO Y H, SAITO S, OHTSUKA K, et al. Characteristics of a sharp decrease in Vibrio parahaemolyticus infections and seafood contamination in Japan[J]. International Journal of Food Microbiology, 2012, 157(1): 95-101.

[20] JONES R J, ZAGOREC M, BRIGHTWELL G, et al. Inhibition by Lactobacillus sakei of other species in the flora of vacuum packaged raw meats during prolonge storage[J]. Food Microbiology, 2009, 26(8): 876-881.

[21] MCLEOD A, NYQUIST O L, SNIPEN L, et al. Diversity of Lactobacillus sakei strains investigated by phenotypic and genotypic methods[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2008, 31(5): 393-403.

Diversity and Community Succession of Surface Spoilage Bacteria in Leaf Mustard during Pickling Process

LI Ke1, ZHANG Qing1,*, CHEN Gong2, LIN Kai1, YUAN Chun-hong1, JIA Bi-hong1, ZHONG Xiao-ting1, XIANG Wen-liang1
(1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, Institute of Ancient Brewing Technology, College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Sichuan Academy of Food and Fermentation Industries, Chengdu 611130, China)

16S rRNA analysis was employed to investigate the microbial populations in putrefactive surface layer during leaf mustard pickling process. The microbial diversity and dynamics were assessed by Shannon-Weaver, Chao, ACE, Simpson, rarefaction analysis and similarity coefficient. All 16S rRNA gene sequences retrieved from brine samples with pickling for 7, 22 d and 60 d were assigned to Vibrio, Halomonas, Pseudoalteromonas, Shewanella, Marinomonas, Geobacillus, Pseudomonas, Psychrobacter, Cobetia, Oceanobacillus, Pantoea and Lactobacillus. Amo ng thes e genera, the dominant bacterium during the pickling process was pathogenic Vibrio and its number in these three samples was 45.8%, 74.2% and 44.9%, respectively. The spoilage bacteria such as Pseudoalteromonas, Shewanella and Pseudomonas were mainly observed on day 7, and the number of Lactobacillus, Cobetia and Halomonas was gradually increased with the pickling process. The community similarity coefficient was decreased to 0.4064 from 0.5131 and then increased to 0.8168. The results indicated that the bacterial succession was associated with the pickling process and such succession is responsible for the spoilage of leaf mustard and the production of some noxious ingredients. These results provide a useful guidance for quality and safety control of pickled leaf mustard.

leaf mustard pickling; brine; bacterial diversity; 16S rRNA; succession

TS201.3

A

1002-6630(2014)01-0180-05

10.7506/spkx1002-6630-201401035

2013-01-26

四川省泡菜產業鏈項目（2012NZ0002-8）；西華大學重點科研基金項目（Z1220531）；成都市自主創新一般項目（Z0102234）

李可（1987—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物與微生態。E-mail：like2341@126.com

*通信作者：張慶（1979—），男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：biozhangq@163.com