食品中常見微生物對氧化三甲胺代謝差異的研究

吳 翔，韓偉偉，王世平

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

食品中常見微生物對氧化三甲胺代謝差異的研究

吳 翔，韓偉偉，王世平*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

分析6種食品中常見微生物（金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、腸炎沙門氏菌）對含有氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）培養(yǎng)基理化性質(zhì)的影響，并根據(jù)微生物對TMAO的代謝利用情況，對這6種微生物進(jìn)行分類；利用非抑制型離子色譜分析TMAO的分解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)微生物可將TMAO分解為三甲胺（trimethylamine，TMA）；最后通過繪制培養(yǎng)基不同理化指標(biāo)（pH值、電導(dǎo)率、濁度、TMA質(zhì)量濃度）隨培養(yǎng)時間的變化曲線，證明TMA的生成會對培養(yǎng)基電導(dǎo)率和pH值產(chǎn)生影響，且不同類型的微生物對這種影響的作用差異顯著。

氧化三甲胺；離子色譜；電化學(xué)分析；微生物；快檢技術(shù)

微生物污染是所有食品從業(yè)人員都需要重視的問題。平板計(jì)數(shù)、革蘭氏染色等傳統(tǒng)微生物檢測方法通常過程繁瑣、檢測時間長、需要大型實(shí)驗(yàn)室的專業(yè)人員操作[1]。阻抗分析法作為一種新興的微生物快檢方法，具有快速、經(jīng)濟(jì)、操作簡單、使用廣泛等諸多優(yōu)點(diǎn)[2]，能一定程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足，具有良好的商業(yè)應(yīng)用前景[3-4]。阻抗分析法依靠檢測培養(yǎng)基因微生物生長而逐漸改變的電化學(xué)參量，實(shí)現(xiàn)對微生物的快速測定[5]。微生物因生活環(huán)境不同，對同一種物質(zhì)的代謝能力會存在差異[6]，因此如果添加一種電惰性有機(jī)物，經(jīng)特定種類微生物利用后，轉(zhuǎn)化為電解質(zhì)，提高培養(yǎng)基的導(dǎo)電性[7]，就能實(shí)現(xiàn)對特定類群微生物的檢測。

氧化三甲胺（t r i m e t h y l a m i n e N-o x i d e， T M A O），化學(xué)結(jié)構(gòu)式為（C H3）3N O，是一種非電解質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[8]，其分解產(chǎn)物三甲胺（t r i m e t h y l a m i n e，T M A）和二甲胺（dimethylamine，DMA）則是弱電解質(zhì)[9]，當(dāng)TMAO被微生物降解代謝后，培養(yǎng)基的電導(dǎo)性將大幅提高，通過對培養(yǎng)基的電學(xué)特性進(jìn)行檢測，即可間接實(shí)現(xiàn)對微生物的檢測。目前已有針對TMAO代謝相關(guān)菌的相關(guān)研究[6,10-11]，但將TMAO用于微生物快速檢測的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對比研究6種常見食品腐敗微生物對TMAO的代謝能力及培養(yǎng)基電導(dǎo)、pH值和濁度等指標(biāo)的影響，揭示不同微生物代謝TMAO對培養(yǎng)基理化性質(zhì)的影響，期望能為TMAO用于微生物阻抗分析法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis），中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院常規(guī)微生物檢測實(shí)驗(yàn)室提供。

TMAO?2H2O（分析純） 天科生物科技有限公司；TMAO?2H2O標(biāo)品、TMA-HCl標(biāo)品、DMA-HCl標(biāo)品美國Sigma公司；苦味酸、甲苯、氫氧化鉀、甲醛、三氯醋酸、葡萄糖、無水硫酸鈉 北京化工廠；胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

PCA液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、葡萄糖1 g/L，pH 7.0，121℃滅菌15 min。PCA固體培養(yǎng)基：在PCA液體培養(yǎng)基中添加瓊脂15 g/L，滅菌。檢測培養(yǎng)基：向已滅菌的PCA液體培養(yǎng)基中添加過濾除菌的TMAO溶液，使其最終質(zhì)量濃度達(dá)到2 g/L。

1.3 儀器與設(shè)備

FE20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ICS-2000離子色譜儀 美國戴安公司；Synergy HT酶標(biāo)儀 美國柏騰儀器有限公司；MP522型精密pH/電導(dǎo)率測量儀（2401-M電導(dǎo)電極） 上海三信儀表廠；UV-5200紫外分光光度計(jì) 北京愷欣世紀(jì)科技發(fā)展有限公司；TGL18M臺式高速冷凍離心機(jī) 鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

取斜面上保存的菌種，于PCA固體培養(yǎng)基平板上劃線活化分離2次，從平板上挑取單菌落，接種在裝有10 mL PCA液體培養(yǎng)基的試管中，37℃培養(yǎng)24 h，制成菌懸液。

1.4.2 分解TMAO菌種的篩選

分別吸取已活化的6種菌懸液各200 μL，按無菌操作分別接種到40 mL檢測培養(yǎng)基和PCA培養(yǎng)基中，每個處理3個重復(fù)，分別另取3瓶40 mL無菌培養(yǎng)基為空白。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h后取樣，進(jìn)行培養(yǎng)基pH值、電導(dǎo)率檢測。通過比較微生物生長引起的2種培養(yǎng)基理化性質(zhì)變化情況和變化幅度差異，篩選獲得陽性菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

式中：A為微生物培養(yǎng)后培養(yǎng)基電導(dǎo)率或pH值平均值；B為空白培養(yǎng)基電導(dǎo)率或pH值平均值。

1.4.3 樣品前處理

取PCA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌懸液6 mL測量電導(dǎo)率和pH值后，在4℃、9 000 r/min離心10 min。移取4 mL上清液于另一離心管中，加入等體積7.5%三氯乙酸溶液后，再次在4℃、9 000 r/min離心10 min，取上清經(jīng)0.45 μm纖維素膜過濾，取25 μL進(jìn)樣于ICS-2000離子色譜儀。

1.4.4 非抑制型離子色譜定性分析水解產(chǎn)物[12]

分離柱：DionexIonpac CS17（4 mm×250 mm），柱溫：3 0℃；保護(hù)柱：D i o n e x I o n p a c G S 1 7（4 mm×50 mm）；電導(dǎo)檢測器，電導(dǎo)池溫：35℃；流動相及流速：3 mmol/L的甲磺酸溶液，0.8 mL/min；程序時間及數(shù)據(jù)采集速率：20 min，5.0 Hz；柱壓設(shè)置：最低200 psi，最高3 000 psi；分析時間為20 min。

1.4.5 分解TMAO菌種生長曲線的檢測

按照1.4.1節(jié)活化具有分解TMAO能力的菌種，分別吸取已活化的菌懸液各1 mL，接種到500 mL檢測培養(yǎng)基中，取無菌檢測培養(yǎng)基為空白，靜置于37℃，從接菌后0.5 h開始，每隔1 h在無菌條件下移取菌懸液6 mL，進(jìn)行電導(dǎo)率、pH值、濁度（OD600nm）的檢測，并按1.4.3節(jié)中所述方法離心取上清，保存于4℃冰箱中，檢測培養(yǎng)基中TMA的質(zhì)量濃度。

1.4.6 TMA的定量測定

參照苦味酸比色法并略作修改[13]，移取一定量上清液于10 mL比色管中，空白為無菌檢測培養(yǎng)基，去離子水定容至2 mL，依次加入0.5 mL 10%甲醛溶液、2.5 mL無水甲苯、1.5mL 25g/100mL KOH溶液，蓋上塞子，漩渦混合器混合3次。靜置分層后，將甲苯層移至干燥小試管，每管加入約0.2g無水硫酸鈉。準(zhǔn)確移取100μL苦味酸工作液于96孔酶標(biāo)板，依次加入上述用無水硫酸鈉脫水后的甲苯層100μL，每個質(zhì)量濃度3個重復(fù)，15min后在酶標(biāo)儀上用410nm波長處檢測吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TMA質(zhì)量濃度。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

除定性的離子色譜實(shí)驗(yàn)外，每個處理均做3次重復(fù)，每次實(shí)驗(yàn)平行測定3次，結(jié)果以表示。利用SPSS V12軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用多重比較和配對t檢驗(yàn)的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物生長24 h對培養(yǎng)基導(dǎo)電性和pH值的影響

由表1可知，檢測培養(yǎng)基在經(jīng)過微生物24 h的生長后，與空白培養(yǎng)基相比電導(dǎo)率和pH值，均發(fā)生顯著變化（P＜0.05），培養(yǎng)基的電導(dǎo)率在6種菌生長后均增加，而pH值則表現(xiàn)出多樣性變化，除大腸桿菌和單增李斯特菌外，其余4種菌均使檢測培養(yǎng)基pH值降低。PCA培養(yǎng)基的電導(dǎo)率和pH值則較空白組差異不大，但均表現(xiàn)出電導(dǎo)率升高和pH值的降低。以上結(jié)果說明，微生物可以將培養(yǎng)基中的非電解質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有導(dǎo)電能力的物質(zhì)，改變培養(yǎng)基溶液的導(dǎo)電性，且這種變化與培養(yǎng)基溶液pH值的變化之間沒有相關(guān)性。

表1 兩種培養(yǎng)基在微生物生長24h后的電導(dǎo)率和pH值變化Table 1 Conductivity and pH after microorganisms were grown for 24 h in the assay medium and PCA medium

圖1 6種微生物生長24h后培養(yǎng)基的電導(dǎo)率和pH值變化Fig.1 Changes in conductivity and pH after microorganisms were grown for 24 h

如圖1a所示，微生物在含有TMAO的檢測培養(yǎng)基中生長引起電導(dǎo)率的變化幅度均高于PCA培養(yǎng)基。其中，大腸桿菌和單增李斯特菌引起的增加幅度達(dá)120%，腸炎沙門氏菌的電導(dǎo)率也有較大增長，增加率為60%，除產(chǎn)氣腸桿菌外，其余幾種菌在兩種培養(yǎng)基中引起的電導(dǎo)率變化均存在顯著性差異。除產(chǎn)氣腸桿菌和糞腸球菌外，其他微生物在兩種培養(yǎng)基中生長引起的pH值變化均存在顯著性差異，如圖1b所示，大腸桿菌和單增李斯特菌使檢測培養(yǎng)基pH值升高，而腸炎沙門氏菌在檢測培養(yǎng)基中引起的pH值降低幅度高于PCA培養(yǎng)基。

根據(jù)以上結(jié)果，可將上述6種微生物分為3類：1）大腸桿菌和單增李斯特菌，這兩種菌可能具有迅速分解TMAO產(chǎn)生導(dǎo)電性強(qiáng)小分子的能力，造成檢測培養(yǎng)基電導(dǎo)率和pH值的顯著升高；2）腸炎沙門氏菌，推測TMAO或其分解產(chǎn)物能促進(jìn)其生長，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值下降幅度增加；3）金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和產(chǎn)氣腸桿菌，該類菌生長引起的檢測培養(yǎng)基的電導(dǎo)率變化幅度小于50%，且其生長和代謝不受TMAO的影響。選擇大腸桿菌、單增李斯特菌和腸炎沙門氏菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 非抑制型離子色譜對TMAO分解產(chǎn)物的定性結(jié)果

圖2 TMAO分解產(chǎn)物離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of degraded products from TMAO

圖2為2.1節(jié)中可能利用TMAO的3種微生物（大腸桿菌、單增李斯特菌和腸炎沙門氏菌）在檢測培養(yǎng)基培養(yǎng)后的離子色譜檢測結(jié)果，根據(jù)文獻(xiàn)[14]，TMAO的可能分解產(chǎn)物包括TMA、DMA、甲醛、甲烷等小分子，其中是弱電解質(zhì)的物質(zhì)只有TMA（pKb=4.2）和DMA（pKb=3.23）[9]。參照圖2a中TMAO的兩種分解產(chǎn)物TMA（11.843 min）和DMA（9.857 min）的保留時間，結(jié)果表明這3種微生物分解TMAO后的產(chǎn)物均為TMA，沒有DMA，與國外文獻(xiàn)[15-17]報(bào)道相符。其中沙門氏桿菌的分解能力最弱（圖2d），與2.1節(jié)中培養(yǎng)基電導(dǎo)率結(jié)果相符。

2.3 電導(dǎo)率、pH值、濁度、TMA質(zhì)量濃度隨微生物生長在檢測培養(yǎng)基中的變化

圖3 3種微生物生長引起的培養(yǎng)基物化指標(biāo)變化Fig.3 Changes in physiochemical properties of the medium during cultivation of three bacterial species

如圖3所示，大腸桿菌和單增李斯特菌的各指標(biāo)隨培養(yǎng)時間的變化曲線較為相似，大致都可分為4個階段。階段1（0～1.5 h），此階段為微生物的適應(yīng)期，各指標(biāo)均無明顯變化，TMA產(chǎn)量在該階段表現(xiàn)出滯后性，約延續(xù)到3.5 h，說明這兩種微生物代謝TMAO的酶是誘導(dǎo)酶。階段2（1.5～5.5 h），表示微生物數(shù)量的濁度曲線在該階段具有最大斜率，同時培養(yǎng)基的pH值曲線出現(xiàn)下降趨勢，該階段結(jié)束時這兩種菌的濁度達(dá)到最大值，pH值達(dá)到最低點(diǎn)，最低點(diǎn)處pH值為6.0，在此期間，微生物大量繁殖代謝培養(yǎng)基中的可溶性碳水化合物，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值下降。與之相應(yīng)，培養(yǎng)基中TMA質(zhì)量濃度在3～5.5 h起快速增高，由于TMA和培養(yǎng)基中酸性物質(zhì)的增加，導(dǎo)致該階段培養(yǎng)基的電導(dǎo)率亦在整個培養(yǎng)階段具有最大斜率。第3階段（5.5～11.5 h），培養(yǎng)5.5 h以后，這兩種微生物進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)基濁度不再增加，菌體的產(chǎn)酸能力下降，并且隨著培養(yǎng)基中TMA質(zhì)量濃度的繼續(xù)緩慢增加，培養(yǎng)基的pH值逐漸升高，此階段中培養(yǎng)基的導(dǎo)電能力的增加僅依靠TMA的生成，因而較第2階段電導(dǎo)率曲線的斜率減小。第4階段（11.5～24.5 h），此時微生物已進(jìn)入衰亡期，培養(yǎng)基的濁度逐漸減小，而培養(yǎng)基pH值、電導(dǎo)率和TMA質(zhì)量濃度均無顯著變化。由于腸炎沙門氏菌對TMAO的代謝能力不強(qiáng)，但具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，因此也能檢測到培養(yǎng)基電導(dǎo)率的較大變化，其培養(yǎng)基濁度、pH值和電導(dǎo)率的變化曲線可簡單分為3個階段（0～3.5 h，3.5～10.5 h，10.5～24.5 h），在整個培養(yǎng)過程中，腸炎沙門氏菌培養(yǎng)基中的TMA質(zhì)量濃度，持續(xù)地緩慢變化，因此，推測腸炎沙門氏菌的TMAO代謝酶為一種組成酶類，Arguello等[18]的研究結(jié)果表明，腸炎沙門氏菌在厭氧條件下才將TMAO作為呼吸鏈上的電子受體加以利用，這可能是本實(shí)驗(yàn)中腸炎沙門氏菌未能大量產(chǎn)生TMA的原因。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6種常見食品腐敗微生物對TMAO的代謝具有選擇性，TMAO的添加對微生物生長后培養(yǎng)基的電導(dǎo)率與pH值影響很大，根據(jù)電導(dǎo)率和pH值的變化，可將這6種菌分成3類：1）能分解TMAO的大腸桿菌和單增李斯特菌；2）TMAO促進(jìn)產(chǎn)酸的腸炎沙門氏菌；3）添加TMAO后不受影響的金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和產(chǎn)氣腸桿菌。這3類菌對添加TMAO培養(yǎng)基的電導(dǎo)率和pH值影響的差異顯著。通過離子色譜對TMAO降解產(chǎn)物分析后發(fā)現(xiàn)，引起培養(yǎng)基電導(dǎo)率和pH值變化的是TMA。而通過對第1、2類菌分別以電導(dǎo)率、pH值、濁度和TMA質(zhì)量濃度為指標(biāo)繪制的生長曲線，驗(yàn)證TMA的生成對培養(yǎng)基電導(dǎo)率和pH值產(chǎn)生影響，并且這種影響對與不同類型的菌種差異顯著。本研究證明TMAO是一種可用于阻抗法微生物檢測的指示物質(zhì)，為微生物阻抗法快速檢測提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 盧智遠(yuǎn), 牛中奇, 劉啟, 等. 一種微生物檢測的生物電化學(xué)方法研究[J].傳感技術(shù)學(xué)報(bào), 2005, 18(3): 481-483; 487.

[2] 胡珂文, 王劍平, 蓋鈴, 等. 電化學(xué)方法在微生物快速檢測中的應(yīng)用[J].食品科學(xué), 2007, 28(12): 526-530.

[3] RAMALHO R, CUNHA J, TEIXEIRA P, et al. Improved methods for the enumeration of heterotrophic bacteria in bottled mineral waters[J]. Journal of Microbiological Methods, 2001, 44(2): 97-103.

[4] FELICE C J, MADRID R E, OLIVERA J M, et al. Impedance microbiology: quantification of bacterial content in milk by means of capacitance growth curves[J]. Journal of Microbiological Methods, 1999, 35(1): 37-42.

[5] 張愛萍, 唐佳妮, 劉東紅. 阻抗法檢測食品中微生物的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技, 2011, 32(2): 436-439.

[6] BARRETT E L, KWAN H S. Bacterial reduction of trimethylamineoxide[J]. Microbiology, 1985, 39: 131-149.

[7] 陳天壽. 微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1995: 11-27.

[8] GIBB S W, HATTON A D. The occurrence and distribution of trimethylamine-N-oxide in Antarctic coastal waters[J]. Marine Chemistry, 2004, 91: 65-75.

[9] 揭念云. 基礎(chǔ)化學(xué)Ⅰ[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2000: 517-518.

[10] ANSALDI M, BORDI C, LEPELLETIER M, et al. Torcapocytochrome negatively autoregulates thetrimethylamine N-oxide (TMAO) reductase operon in Escherichia coli[J]. Molecular Microbiology, 1999, 33: 284-295.

[11] 郭修娟. 氧化三甲胺代謝相關(guān)菌的研究[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2011.

[12] LI Feng, LIU Hongying, XUE Changhu, et al. Simultaneous determination of dimethylamine, trimethylamine and trimethylaminen-oxide in aquatic products extracts by ion chromatography with nonsuppressed conductivity detection[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(31): 5924-5926.

[13] DYER W J, MOUNSEY Y A. Amines in fish muscleⅡ. Development of trimethylamine and other amines[J]. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 1945, 30: 91-98.

[14] WZOREK B, MOCHALSKI P, SLIWKA I. Application of GC-MS with a SPME and thermal desorption technique for determination of dimethylamine and trimethylamine in gaseous samples for medical diagnostic purposes[J]. Journal of Breath Research, 2010, 4: 1-6.

[15] TIMM M, JORGENSEN B M. Simultaneous determination of ammonia, dimethylamine, trimethylamine and trimethylamine-noxide in fish extracts by capillary electrophoresis with indirect UV-detection[J]. Food Chemistry, 2002, 76: 509-518.

[16] SIMEONIDOU S, GOVARIS A, VARELTZIS K. Effect of frozen storage on the quality of whole sh and llets of horse mackerel (Trachurus trachurus) and Mediterranean hake (Merluccius mediterraneus)[J]. Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung A, 1997, 204: 405-410.

[17] 宋丹陽, 周德慶, 杜永芳, 等. 氧化三甲胺酶研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(1): 350-353.

[18] ARGUELLO Y M , PAIVA J B, PENHA R A , et al. Participation of genes involved in the process of anaerobic respiration of infection in chickens by Salmonella Typhimurium[J]. Brazilian Journal of Veterinary Pathology, 2010, 3(1): 2-8.

Difference in Trimethylamine Oxide Metabolism by Common Microorganisms in Food Products

WU Xiang, HAN Wei-wei, WANG Shi-ping*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Based on the metabolic utilization of trimethylamine oxide (TMAO), six common food spoilage microorganisms (S. aureus, E. aerogenes, E. faecalis, E. coli, L. monocytogenes and S. enteritidis) were classified by analyzing their effects on physicochemical properties of PCA medium containing TMAO. Subsequently, TMAO metabolites were analyzed by using non-suppressed ion chromatography and identified mainly as trimethylamine. Finally, different physical and chemical indicators (pH, conductivity, turbidity and TMA content) of the culture medium were plotted against culture time. The generation of TMA can affect the conductivity and pH of the medium, and this effect has a significant difference depending on the bacterial species.

trimethylamine oxide (TMAO); ion chromatography; electrochemical analysis; microorganism; rapid detection technology

TS207.4

A

1002-6630(2014)01-0189-05

10.7506/spkx1002-6630-201401037

2013-01-16

北京朝陽區(qū)食品安全監(jiān)管體系構(gòu)建及關(guān)鍵技術(shù)研究與應(yīng)用項(xiàng)目（Z121100000312080）

吳翔（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：791961508@qq.com

*通信作者：王世平（1959—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：wang744447@126.com