微生物合成共軛亞油酸機理和方法的研究進展

李 垚，徐爾尼，楊 欣，胡冰彬

（南昌大學生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

微生物合成共軛亞油酸機理和方法的研究進展

李 垚，徐爾尼*，楊 欣，胡冰彬

（南昌大學生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

共軛亞油酸是人類近年來發現的最重要的功能性脂肪酸之一，作為一種新發現的營養素，已被廣泛的應用到藥品和食品中，應用范圍正不斷擴大。本文系統地總結目前微生物合成共軛亞油酸的研究現狀，闡述生物合成共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）的重要性，列舉一些合成CLA的重要菌種，總結不同微生物合成CLA的機制，對比4種微生物合成方法的特點，展望微生物合成CLA的未來研究方向。

微生物；共軛亞油酸；機理；方法

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是指一系列含有共軛雙鍵、具有不同位置和空間構型的十八碳二烯酸同分異構體的混合物，其中最具有生理活性的異構體是c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。CLA是人類近年來發現的最重要的功能性脂肪酸之一，從抗癌到預防心血管疾病、糖尿病，甚至體質量的控制等[1]，現已成為生活在21世紀現代人不可或缺的健康食品。由于CLA是被應用到藥品和食品中，因此一種安全且活性異構體含量高的合成方法是迫切需要的，而利用微生物合成CLA可以很好的解決這個難題。研究發現，乳酸菌利用亞油酸合成CLA，只有幾個單一的反應，合成的CLA主要是c9,t11和t9,t11-十八碳二烯酸，而且乳酸菌細胞膜上存在的亞油酸異構酶，可以細胞形式反應，也可以游離酶的形式進行反應生產CLA。

1 有合成CLA能力的微生物菌種

目前人們已經檢測發現了14個屬250多株菌具有合成CLA的能力，這些菌屬于腸球菌屬、片球菌屬、丙酸菌屬、乳桿菌屬等[2]，合成CLA轉化率高的微生物分別是瘤胃細菌，丙酸菌和乳酸菌等[3]。乳制品是CLA最主要的天然來源，c9,t11-CLA是其主要異構體[4]，這與瘤胃細菌合成有關，例如反芻動物瘤胃中厭氧溶纖維丁酸弧菌屬合成的c9,t11-CLA可能是亞油酸生物氫化合成硬脂酸過程中的一個中間產物[5]。Jiang等[6]研究發現費氏丙酸桿菌可以轉化亞油酸合成CLA。Rainio等[7]研究表明費氏丙酸桿菌在對數期合成CLA的量很多，其中c9,t11占85%～95%。表1總結了目前發現的可以轉化亞油酸合成CLA的微生物菌種，它們大都是厭氧或者兼性厭氧菌，在含有亞油酸的培養基中生長合成CLA，一些菌的靜息細胞也可以催化亞油酸合成CLA，其中植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌是最有潛力的兩個菌種。靜息細胞轉化法是指將微生物培養至一定階段后分離出菌絲體，將其重新懸浮于不完全培養基（缺少某種營養物質，如氮源等）中，使其處于不再生長但仍保持原有各種酶活的狀態，再加入底物，在適當的溫度、pH值和振蕩條件下進行轉化的方法，它是一種將生長影響減至最小的生物轉化方法。

表1 不同微生物菌種合成CLA特點的比較Table 1 Comparison of CLA produced by different microorganisms

2 微生物合成CLA機理

CLA是亞油酸生物氫化過程中的中間產物，此過程主要由厭氧菌來完成，由于游離多不飽和脂肪酸能抑制厭氧菌的生長，因此，推測這個飽和反應可能是這類細菌自發的一個解毒作用[3]。由表1可知，幾乎所有菌種都能生產c9,t11和t9,t11兩種異構體，但是，控制異構體的比例仍舊顯得很重要，研究發現改變反應條件可以控制異構體的比例。例如，添加絲氨酸、葡萄糖、硝酸銀、氯化鈉，可以減少t9,t11產生，導致選擇性的合成c9,t11[18]。如果這個反應體系中亞油酸濃度很低，持續反應一段時間后，97%以上都是t9,t11[14]。在此我們綜述了不同微生物合成CLA的作用機理。

2.1 丁酸弧菌在哺乳動物體內合成CLA機理

乳制品之所以含有較多的c9,t11-CLA，是因為牛、羊等哺乳動物體內一些瘤胃細菌的作用。Kepler等[19]在1967年發現瘤胃中溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）細胞膜上有亞油酸異構酶，即使在有氧條件下也能繼續合成c9,t11-CLA，酶催化速率較快，可適應較寬的pH值范圍。c9,t11-CLA是該菌在亞油酸生物氫化為硬脂酸過程中的一個中間產物，這個過程至少有兩個反應，如圖1所示。首先亞油酸異構化為c9,t11-CLA，接著共軛雙鍵加氫成為t11-十八碳一烯酸（trans-vaccenic acid），逐漸形成了單烯酸和生物氫化產生的共軛亞油酸混合物，最后單烯酸在哺乳動物細胞內’9去飽和酶的作用下轉化形成c9,t11-CLA，如圖2所示。研究發現，一些霉菌細胞內也存在’9去飽和酶，可以把t11-十八碳一烯酸轉化為CLA[20]。雖然多種瘤胃菌均能催化LA轉化成CLA，并且是以c9,t11-CLA為主的CLA的混合物，但瘤胃菌的培養需要嚴格的厭氧條件，不易培養，因此限制了在生產上的應用。

圖1 丁酸弧菌氫化亞油酸為硬脂酸的途徑[[33]]Fig.1 Proposed pathway of linoleic acid hydrogenation to stearic acid by Butyrivibrio fi brisolvens[3]

圖2 Δ 9去飽和酶作用于十八碳一烯酸合成CLLAA[[33]]Fig.2 CLA production from trans-vaccenic acid through Δ9 desaturation[3]

2.2 嗜酸乳桿菌以亞油酸為底物合成CLA機理

圖3 嗜酸乳桿菌異構化亞油酸為CLA的途徑[[33]]Fig.3 Proposed pathway of linoleic acid isomerization to CLA by Lactobacillus acidophilus[3]

Ogawa等[13]研究了嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）AKU1137以亞油酸為底物合成CLA的反應機制。這個反應與羥基脂肪酸的形成有關，隨著這個反應的持續進行，羥基脂肪酸的積累量會迅速下降，并伴隨著CLA產量的增加。這個結果顯示了羥基脂肪酸是嗜酸乳桿菌轉化亞油酸生產CLA過程中的一個中間產物，見圖3。

2.3 植物乳桿菌以蓖麻油為底物合成CLA機理

蓖麻油富含蓖麻油酸，總脂肪酸中的88%是蓖麻油酸，乳酸菌只可以利用游離蓖麻油酸合成CLA。在蓖麻油中，大部分蓖麻油酸以三酰甘油形式存在，因此，在反應體系中，脂肪酶的存在可以催化蓖麻油水解為游離的蓖麻油酸，從而被乳酸菌利用，見圖4。研究發現非離子表面乳化劑，特別是多羥基乳化劑（如Lubrol PX）可以很好的分散蓖麻油，有利于CLA的生成。Ando等[16]研究了利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）JCM 1551作為轉化細胞酶生產CLA。在微氧、37℃的條件下，以1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH6.5）為轉化介質，以蓖麻油酸乳化劑（蓖麻油酸與Lubrol PX質量比5∶1為底物，底物質量濃度為5mg/mL，其菌液質量濃度是12g/100mL，反應99h。CLA合成量達2mg/mL，占提取到總脂肪酸含量的46%，并由c9,t11 （26%）和t9,t11（74%）兩部分組成，其中37%的CLA積累在細胞表面內外，主要以游離形式存在。沒有反應的蓖麻油在上清液中被發現，也主要以游離形式存在。

圖4 植物乳桿菌轉化蓖麻油和蓖麻油酸為CLA的途徑[3]Fig.4 Proposed pathway of ricinoleic acid and castor oil transformation to CLA by Lactobacillus plantarum[3]

2.4 植物乳桿菌轉化合成共軛多不飽和脂肪酸機理

各種各樣帶有共軛雙鍵的脂肪酸在生物體內陸續被發現，近幾年，人們發現不僅CLA，還有共軛三烯酸都有獨特的生理活性，α-亞麻酸經過堿異構可以形成共軛三烯酸，它對人類癌細胞的生長有抑制作用[21]。Kishino等[22]研究了利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）AKU 1009a細胞轉化不同種類多不飽和脂肪酸形成共軛脂肪酸，見表2。其中α-亞麻酸（c9,c12,c15-18∶3），γ-亞麻酸（c6,c9,c12-18∶3），松籽油酸（c5,c9,c12-18∶3）和十八碳四烯酸（c6,c9,c12,c15-18∶4）都可以被轉化為共軛脂肪酸。

表2 植物乳桿菌AKU 1009a轉化多不飽和脂肪酸[2]Table 2 Transformation of polyunsaturated fatty acids by L. plantarum AKU 1009a[2]

由表2可知，可以利用植物乳酸菌進行轉化形成共軛雙鍵的脂肪酸都是帶有c9,c12雙鍵的十八碳二烯酸，可利用α-亞麻酸生產共軛α-亞麻酸（conjugated alphalinolenic acid，CALA）的3種主要脂肪酸結構分別是：c9,t11,c15-18∶3，t9,t11,c15-18∶3和t10,c15-18∶2；可利用γ-亞麻酸生產共軛γ-亞麻酸（conjugated gammalinolenic acid，CGLA）的4種主要脂肪酸結構分別是：c6,c9,t11-18∶3，c6,t9,t11-18∶3，c6,t10-18∶2和t10-18∶1。利用α-亞麻酸進行轉化的過程發現在初級階段，c9,t11,c15-18∶3和t9,t11,c15-18∶3共軛三烯酸（conjugate three acid，CTA）被積累，隨著反應的進行，積累的共軛三烯酸逐漸減少，t10,c15-十八碳二烯酸的含量則不斷增加。類似的結果也可以在利用γ-亞麻酸轉化形成CGLA的過程中被發現，見圖5。

圖5 植物乳桿菌轉化α--和γ-亞麻酸的途徑[[22]]Fig.5 Proposed pathway of α- and γ-linolenic acid transformation by Lactobacillus plantarum[2]

3 微生物合成CLA的方法

目前，人們主要是研究利用乳酸菌生產共軛亞油酸，大體上有活細胞發酵法、酶法合成、靜息細胞轉化法與固定化細胞合成法4種方法，它們有著各自的特點，其中靜息細胞轉化合成是目前研究最多的方法。

3.1 活細胞發酵法

2002年，Kim等[23]研究了發酵乳中有14種乳酸菌具有利用向日葵油合成CLA的能力，其中乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）I-01表現出最高的合成能力，當向日葵油的質量濃度為0.1 g/L時產生的CLA量最大，而向日葵油的質量濃度大于0.2 g/L時，CLA的生成量逐漸減少。Oh等[24]研究了短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）和假鏈狀雙歧桿菌（Bifi dobacterium pseudocatenulatum）發酵生產CLA，研究表明，培養30 h細胞量達到最高，產生的異構體主要是c9,t11-CLA，并分布在上清液中，產量分別是160 mg/L和135 mg/L。劉曉華等[25]利用瑞士乳桿菌（L. helveticus）L7發酵生產CLA，MRS培養基中接入5%的菌種，加入亞油酸至質量濃度為0.1 g/100 mL，30℃發酵培養36 h，發酵液萃取后，經紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜-質譜聯用分析測試，確定了該菌生物轉化形成的兩種主要異構體是t9,t11-CLA和c9,t11-CLA。

3.2 酶法合成CLA

亞油酸異構酶很難分離、純化，熱穩定性差，提取過程中，酶很容易失活。Lin等[26]用MRS肉湯培養嗜酸乳桿菌，離心收集細胞后，依次用溶菌酶和超聲波破壁，離心收集粗酶，再經鹽析、透析，然后用孔徑0.22 μm的膜過濾，離心濃縮，最后用分子質量大于100 kD的膜收集目的酶，達到了較好的純化效果。Peng[27]、Rosson[28]等通過鹽析，陰離子交換層析（DEAE-SPW色譜柱）、聚焦色譜、凝膠過濾層析（1.6 cm×55 cm，Superdex-200色譜柱）等純化方法，分別獲得了C.sporogemes、L.reuteri、P.acnes共3株菌的亞油酸異構酶，其酶比活力是粗酶活性的350～480倍。SDS-PAGE電泳分析表明，C.sporogemes亞油酸異構酶的分子質量大約為45 kD，L.reuteri的大約是68 kD、P.acnes的大約是55 kD。Lin[11]研究對比了德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）洗滌細胞和粗酶轉化亞油酸形成CLA的效果。結果顯示，洗滌細胞轉化合成CLA的產量是209 μg/mL，而提取粗酶催化合成的產量是8.5 μg/mL，并且單個異構體的含量和總CLA的含量大大低于洗滌細胞的轉化，這可能與游離的亞油酸異構酶穩定性較差，經提取處理后酶活力降低有關。

3.3 靜息細胞轉化法

由于采用提取后的亞油酸異構酶轉化LA合成CLA存在酶不穩定、酶活下降等缺陷，所以利用乳酸菌靜息細胞轉化生產CLA成為近幾年研究的熱點。許多研究表明[11]，利用乳酸菌洗滌細胞在微氧條件下轉化合成CLA具有更好的發展前景，原因有6點：1）洗滌細胞處于休眠狀態，可以作為亞油酸異構酶的天然透析袋，免去了酶提取純化的繁瑣過程；2）反應只需在適宜的介質體系條件下進行；3）生成的反應產物是具有生理活性的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA；4）轉化產物單一，CLA能以高濃度積累；5）洗滌細胞可以達到很高的密度，比發酵法的細胞密度高出十多倍；6）產物CLA以游離形式積累在細胞外，易于提取。Raino[29]2001年利用丙酸菌（Propionibacterium freudenreichi）在加乳清的培養基培養后，經洗滌收集細胞，再放入含有4.0 mg/mL亞油酸的磷酸鹽緩沖液中進行靜息細胞轉化反應，發現轉化率達到了46%，這是當時報道的利用洗滌細胞反應轉化合成CLA的最高產率。許慶炎等[30]篩選了一株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）ZS2058，以磷酸鉀緩沖液為轉化介質，在亞油酸質量濃度為0.8 mg/mL、細胞濃度為4×1010CFU/mL、37℃、pH 6.5的條件下，轉化24 h。c9,t11-CLA產量是374 μg/mL，CLA總量為491 μg/mL，轉化率可達到60.54%。Zhao等[31]利用凍融法對植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）A6-1F進行透性化處理，然后采用該凍融細胞轉化合成CLA。在以磷酸鹽緩沖溶液為轉化介質，pH 7.0、細胞質量濃度為15 g/100 mL、亞油酸質量濃度為1.5 mg/mL、37℃，轉化反應2h條件下，CLA最高產量可以達到275.7 μg/mL，比不進行透性化處理的產量提高了將近20%，主要異構體是c9,t11-CLA。

3.4 固定化細胞合成法

Lee等[32]將羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）ATCC 55739固定在硅膠上，在亞油酸質量濃度為500mg/L、pH10.5、55℃的條件下，轉化反應1 h，可生成175 mg/L的CLA，轉化率為35%。而游離洗滌細胞在最適反應條件下反應1 h，僅產生32 mg/mL，轉化率為6.4%，固定化細胞CLA轉化率是游離細胞的5.5倍。Lin等[33]分別利用殼聚糖和聚丙烯酰胺兩種材料，對德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）CCRC14009和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）CCRC14079進行混菌固定化。在pH 7的條件下，聚丙烯酰胺固定化細胞的CLA產量是121 μg，殼聚糖的是51.2 μg，而游離細胞的產量只有29.4 μg。王歡等[34]研究了以海藻酸鈉為載體，采用包埋法制備固定化干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），在最適條件下轉化培養18 h，CLA積累量為62.57 μg/mL。而游離乳酸菌在相同條件下轉化培養18 h，CLA積累量僅為50 μg/mL。在固定化乳酸菌與游離乳酸菌均達到最大產量CLA時，固定化的乳酸菌比游離菌所用的轉化時間短，且CLA積累量多。這說明固定化更有利于實現高產量的連續生產和菌體的重復利用，從而降低生產成本，提高經濟效益。

3.5 4種轉化合成CLA方法的比較

表3 4種轉化合成CLA方法的比較Table 3 Comparison of four methods for CLA biosynthesis

由表3可知，活細胞發酵法操作簡單，但是易染菌，細胞量低，轉化率低；酶法合成雖然反應快，產物易分離，但是操作復雜，酶易失活，成本較高；靜息細胞轉化法不易染菌，干擾物質少，產物易分離，同時免去了酶的提取；固定化細胞合成法可以批次連續反應，成本低，產量高，隨著批次的延續酶活逐漸下降。綜上所述，靜息細胞轉化法和固定化細胞技術結合是目前我們應該考慮的一個方向。

4 結 語

隨著人們生活水平的不斷提高，人們的保健意識會持續增強，因此，具有獨特生理活性共軛亞油酸將會一直受到人們的青睞，其市場需求量也會不斷提高。微生物合成共軛亞油酸雖然有很多優勢，但是現在還遠遠不能滿足人們的需求，所以，提高微生物合成共軛亞油酸的產量是一項任重而道遠的歷程。

我們應該從選育菌株，優化轉化工藝，改進固定化技術，尋找亞油酸替代品等方面入手。即利用紫外誘變、基因工程等手段篩選產量更高的優良菌株；對細胞進行透性化處理，使底物與亞油酸異構酶易結合進行反應；給反應體系中添加抗氧化劑等方式減少CLA氧化；結合固定化技術使亞油酸細胞酶可以得到重復、多批次利用，從而達到高效率、低成本生產的目的。另一方面，我們應該尋找更廉價、易得的亞油酸替代品，比如紅花籽油、蓖麻油、葵花籽油、海蓬籽油、苜蓿籽油等一些富含亞油酸的油脂經過水解和脂肪酶的處理都可以作為合成CLA的底物。

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Progress in Mechanism and Methods for Microbial Synthesis of Conjugated Linoleic Acid

LI Yao, XU Er-ni*, YANG Xin, HU Bing-bin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Conjugated linoleic acid (CLA) is one of the most important functional lipids found in recent years. As a newlyfound nutrient, CLA has been widely applied to medicine and food and its applications are currently extended in other fields as well. This review systematically summarizes the recent studies on microbial production of CLA, expoundes the significance of CLA biosynthesis, enumerates the important strains to synthetize CLA, summarizesthe different mechanisms for the synthesis of CLA by different microorganisms, compares the features of four methods for its microbial synthesis, and finally presumes the potential trends to synthesize CLA by microorganisms in the future.

microorganism; conjugated linoleic acid; mechanism; method

Q939.9

A

1002-6630(2014)01-0271-06

10.7506/spkx1002-6630-201401054

2012-11-18

江西省科技廳科技支撐計劃項目（20111BBF60024）

李垚（1987—），男，碩士研究生，研究方向為應用微生物學。E-mail：liyao19870108@163.com

*通信作者：徐爾尼（1956—），女，教授，學士，研究方向為應用微生物學。E-mail：xuerni@126.com