Co2+對聚酰胺胺樹狀大分子和牛血清蛋白相互作用的影響

杜彬榮 章寶娟▲ 胡 斌

1.浙江省紹興市紹興第二醫院，浙江紹興 312000；2.浙江省紹興市藥檢所中藥室，浙江紹興 312071

聚酰胺胺（PAMAM）樹狀大分子是由Tomalia 等[1]首次合成的一類新型的聚合物，具有較大的內部空腔和大量的端基官能團，可與多種有機小分子或聚合物結合，并且具有細胞毒性低等許多獨特的生物性狀。正是由于這些優勢使其非常適宜作為藥物和基因的轉運載體[2-4]。眾所周知，多數藥物進入人體后，必須通過血漿的儲存和運輸才能到達靶部位，進而發生藥理作用。 血清白蛋白是血液中一類重要的蛋白質，對許多內源性和外源性的藥物都具有較高的親和力[5]。 血清白蛋白還可與許多金屬離子結合，另有報道顯示，具有不同末端基團的PAMAM 也可與多種金屬離子（Cu、Zn、Co、Ni、Pb、Cd）發生配位作用[6-7]。 因 此，研究PAMAM，金屬離子與白蛋白的相互作用，對闡明該藥物載體在體內的轉運、分布和代謝等具有重要意義。

本實驗利用紫外-可見光譜法研究Co2+與PAMAM樹狀大分子的配位作用；利用熒光光譜法研究PAMAM樹狀大分子在生理條件下與牛血清白蛋白、Co2+三者的作用，并探討相互作用機制，以及對蛋白構象的影響。

1 儀器與試藥

1.1 試劑

3.5 代（G3.5，具有末端酯基）和4.0 代（G4.0，具有末端氨基）以乙二胺為核的PAMAM 樹枝狀大分子，實驗室自制；牛血清白蛋白BSA（組分Ⅴ，生化試劑，南京大冶生物科技有限公司）；CoCl2（分析純，上海振興試劑廠）；三羥甲基氨基甲烷；實驗用水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

RF5301 型熒光分光光度計（日本島津公司）；UV2100 型紫外分光光度計（日本島津公司）；pHS-25型酸度計（上海偉業儀器廠）；BS 124S 型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

2 方法與結果

2.1 紫外光譜法研究G4.0 PAMAM 和G3.5 PAMAM與Co2+配位作用

配制一定濃度的G3.5 PAMAM 和G4.0 PAMAM樹狀大分子與Co2+的混合體系，在波長為200～800 nm的范圍內掃描紫外光譜，狹縫寬度為2.0 nm[8]。

2.2 各類PAMAM 樹狀大分子對牛血清白蛋白熒光的猝滅作用

將BSA 溶解于pH 為7.4 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液（緩沖液含NaCl 的濃度為100 mmol/L）中，配制成終濃度為5 μmol/L 的溶液。 室溫下測定上述濃度溶液的熒光光譜。 激發波長選擇295 nm，發射波長為300～460 nm[9]。 然后向BSA 溶液中分別加入不同濃度的各類樹狀大分子溶液，在同樣條件下測定其熒光光譜，記錄熒光強度。

2.3 Co2+對牛血清白蛋白熒光的猝滅作用

按照“2.1”項下方法，向BSA 溶液中分別加入不同濃度的Co2+，測定其熒光光譜，記錄熒光強度。

2.4 Co2+對PAMAM 樹狀大分子和BSA 相互作用的影響

將BSA 溶解于pH 為7.4 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液（NaCl 濃度100 mmol/L）中，配制成濃度為5 μmol/L的溶液。 然后向其中分別加入一定量的CoCl2溶液，制成BSA- Co2+二元猝滅體系[10-11]，按照“2.2”項下方法測定其熒光光譜。隨后向該混合溶液中加入不同濃度的G4.0 PAMAM 或G3.5PAMAM 樹狀大分子溶液，在同樣的條件下測定熒光光譜。

2.5 紫外光譜法研究G4.0 PAMAM 和G3.5 PAMAM與Co2+配位作用結果

圖1 是PAMAM 樹狀大分子水溶液在pH 值為7.40，25℃下的紫外可見光吸收光譜圖。從圖中可以看出，該溶液在紫外區有較大吸收，而在可見光區幾乎無吸收。

圖2 是不同代數PAMAM 與Co2+溶液在pH 值為7.40，25℃下相互作用后的紫外可見吸收光譜圖，分為紫外區的吸收光譜和可見光區的吸收光譜兩個部分。從圖2 中可以發現，加入G4.0 PAMAM 樹狀大分子時，最大吸收波長為356 nm；加入G3.5 PAMAM 樹狀大分子時，溶液在可見光區域幾乎沒有吸收。 在實驗過程中還觀察到，當向Co2+溶液中加入G4.0 PAMAM 后，溶液瞬間由原來的粉紅色變為亮黃色，而加入G3.5 PAMAM 溶液沒有變化。

圖1 不同代數PAMAM 水溶液的紫外可見光吸收光譜

圖2 不同代數的PAMAM/Co2+配合物和CoCl2 溶液的紫外可見吸收光譜

2.6 各類PAMAM 樹狀大分子對牛血清白蛋白熒光的猝滅作用結果

圖3 是295 nm 激發波長下不同濃度G4.0 PAMAM對BSA 熒光光譜的影響，加入樹狀大分子后熒光強度降低。 對于所有類型的樹狀大分子，它們濃度的增加均可引起色氨酸殘基熒光的線性下降，并且通過穩定性考察發現這種猝滅作用瞬間即可達到穩定狀態。上述現象說明PAMAM 樹狀大分子同BSA 之間存在相互作用。

圖4 是根據公式F0/F=1+Ks[Q]（其中F0為猝滅體不存在的熒光強度，F 為加入猝滅體后的熒光強度，Ks為雙分子猝滅常數，[Q]為猝滅體濃度）得到的各類樹狀大分子對BSA 熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線圖。

樹狀大分子對色氨酸熒光猝滅的Stern-Volmer常數見表1。Ksv 值越大，則說明PAMAM 樹狀大分子與BSA 間的相互作用越強。 根據表1 中Ksv 數據推測PAMAM 樹狀大分子與BSA 的相互作用強弱順序：G4.0>G3.5。 并且各種猝滅劑對生物大分子最大動態猝滅過程的猝滅常數都不大于0.2 L/mmol[12～13]，而表1 中的各Ksv 值均大于此值，可由此推斷該猝滅過程是由于各類樹枝狀大分子與BSA 之間形成了配合物所引起的靜態猝滅，而非樹狀大分子擴散時所引起的動態猝滅。

圖3 PAMAM-BSA 的熒光猝滅光譜

圖4 G3.5 PAMAM-BSA、G4.0 PAMAM-BSA 體系的Stern-Volmer 曲線

表1 各體系的熒光猝滅常數及相關系數

2.7 熒光光譜法研究Co2+對BSA 的猝滅作用

圖5 為Co2+對BSA 的熒光猝滅光譜圖，經Stern-Volmer 方程[y=0.2533x+1.0124，其中x 為Co2+濃度（mmol/L），y 為F0/F，相關系數r=0.9973]處理后得圖6，由圖6 可見，加入高濃度Co2+后，F0/F 值只發生略微增加，說明Co2+對BSA 的猝滅作用很小，其Ksv 值僅為0.2533 L/mmol。

圖5 Co2+-BSA 的熒光猝滅光譜

圖6 Co2+-BSA 體系Stern-Volmer 曲線

2.8 熒光光譜法研究PAMAM 樹狀大分子對Co2+和BSA 相互作用的影響

圖7 為PAMAM 樹狀大分子對BSA-Co2+二元體系的熒光猝滅光譜圖。隨著PAMAM 樹狀大分子濃度的增加，熒光猝滅增強。 由其Stern-Volmer 曲線（圖8，yG4.0PAMAM=1.7170x+1.0053，yG3.5PAMAM=1.3410x+1.0093，其中x 為相應PAMAM 濃度（mmol/L），y 為F0/F，相關系數r=0.9984，0.9971）和表2 可知，Co2+的存在使G4.0 PAMAM 樹狀大分子對BSA 的猝滅降低，Ksv 值由2.7358 L/mmol 降至1.7170 L/mmol，這可能是由于Co2+先與PAMAM 之間發生了較強的配位作用，導致G4.0 PAMAM 與BSA 結合的區域構型、電荷等發生變化，使G4.0 PAMAM 樹狀大分子對BSA 的猝滅減弱，也可能是由于Co2+優先占據了BSA 的某些位點且很穩定，從而減弱了PAMAM 與BSA 的結合。 而G3.5 PAMAM 與Co2+基本不發生配位作用，因此Co2+的加入基本上對猝滅作用沒有影響。

圖7 G4.0 PAMAM-（BSA- Co2+）的熒光猝滅光譜

圖8 PAMAM-（Co2+-BSA）體系的Stern-Volmer 曲線

表2 各體系的熒光猝滅常數及相關系數

3 討論

采用紫外光譜法研究兩類PAMAM 樹狀大分子與Co2+的相互作用，結果表明應，Co2+可與G4.0 PAMAM配位，而與G3.5 PAMAM 幾乎無作用。由于加入G4.0 PAMAM 時，Co2+同其端基-伯胺基配位，使得Co2+的d軌道分裂能ΔE 值增大，兩者混合溶液在可見光區域最大吸收波長向短波方向移動。 對于G3.5 PAMAM而言，由于其端基-酯基的配位能力弱，很難與Co2+配位，另外由于PAMAM 樹狀大分子的球體外形，當溫度低于25℃時，Co2+克服不了G3.5 PAMAM 的空間位阻，不能進入到其分子內層與叔胺基進行配位[14]，所以導致了G3.5 PAMAM 與Co2+的混合溶液在可見光區域幾乎沒有吸收。 用熒光光譜法研究生理條件下（pH=7.4）PAMAM、BSA、Co2+三者之間的相互作用，研究結果表明，在Co2+-BSA 體系中，Co2+對BSA 的猝滅作用很小，Co2+導致了G4.0 PAMAM 與BSA 的猝滅常數明顯減小，Ksv 值由2.7358 L/mmol 降至1.7170 L/mmol，而對G3.5 PAMAM 與BSA 的相互作用影響不大，Ksv值由1.3447 L/mmol 至1.3410 L/mmol。 這可能是由于Co2+先與PAMAM 之間發生了較強的配位作用，導致G4.0 PAMAM 與BSA 結合的區域構型、電荷等發生變化，使G4.0 PAMAM 樹狀大分子對BSA 的猝滅減弱，也可能是由于Co2+優先占據了BSA 的某些位點且很穩定，從而減弱了PAMAM 與BSA 的結合。而G3.5PAMAM與Co2+基本不發生配位作用，因此Co2+的加入基本上對猝滅作用沒有影響。

由此可見，Co2+的存在可在一定程度上影響具有末端氨基的PAMAM 樹狀大分子與BSA 間的相互作用，對研究該類藥物載體與BSA 的結合有指導作用。

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