白藜蘆醇對C3H10T1/2間質干細胞成骨分化及CXCL12、EGFR和CCL2基因表達的影響

左長清 鐘月春 汪宗桂 戴 忠 吳 鐵

1.廣東醫學院藥理學教研室，廣東東莞 523808；2.廣東醫學院生物化學教研室，廣東東莞 523808

骨質疏松癥是世界范圍內的常見病、多發病。 促進間質干細胞成骨定向分化與成熟是治療骨質疏松癥的新的有效手段。白藜蘆醇是一種含有芪類結構非黃酮類多酚化合物，具有促進間質干細胞向成骨細胞方向分化，并抑制間質干細胞向脂肪細胞分化潛能[1]，但白藜蘆醇促成骨分化機制尚未完全闡明。

間質干細胞成骨分化是一個非常復雜的生物過程[2]，涉及到多基因、多信號通路組成的復雜基因調控網絡。 筆者前期通過網絡生物學方法研究發現CXCL12、EGFR 和CCL2 基因在重組人骨形成蛋白2（rhBMP-2）成骨分化網絡中處于中心節點[3]。 本文應用C3H10T1/2 間質干細胞培養體系， 觀察白藜蘆醇對rhBMP-2 促成骨分化作用及對CXCL12、EGFR 和CCL2 基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠間質干細胞C3H10T1/2 購自中國科學院上海細胞庫。白藜蘆醇（Sigma），rhBMP-2（Human Zyme），napthol AS-MX phosphate 和Fast Blue BB salt（Sigma），TRIzol（Invitrogen），RT-PCR Kit（TaKaRa），CCK-8（Dojindo）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CCK-8 法檢測藥物對細胞增殖功能的影響C3H10T1/2 細胞生長至80%融合，用含0.25%胰酶的消化液消化，制成細胞懸液，以3000 個細胞/孔接種于96 孔板內，37℃5%CO2培養箱中培養。 24 h 細胞貼壁后，更換含不同濃度白藜蘆醇（分別為0、5、10、20、40、80、100 μmol/L） 的DMEM 培養液100 μL，細胞繼續培養48 h 后， 每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養箱中孵育2 h，以多功能酶標儀讀取波長450 nm處的OD 值。 按下述公式計算細胞的生長抑制率：細胞生長抑制率（%）＝（1－用藥組平均吸光度/對照組平均吸光度）×100% 。

1.2.2 堿性磷酸酶染色鑒定成骨分化 C3H10T1/2 接種于24 孔板中，細胞生長至約90%融合，實驗分為三組：空白對照組、300 ng/mL rhBMP-2 組、20 μmol/L白藜蘆醇+300 ng/mL rhBMP-2 組，每3 天更換1 次培養基。當成骨誘導分化6 d 后，單層細胞用PBS 清洗2次，然后用體積分數為0.70 乙醇室溫固定15 min，采用含0.1 mg/mL napthol AS-MX phosphate 和0.6 mg/mL Fast Blue BB salt 染色液避光染色30 min， 用蒸餾水漂洗細胞3 次，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.3 實時熒光定量PCR 法檢測CXCL12、EGFR 和CCLl2 mRNA 的表達 C3H10T1/2 細胞接種至12 孔細胞培養板，20 μmol/L 白藜蘆醇處理48 h 后，Trizol 法提取細胞總RNA，經PrimeScriptTMRT reagent Kit 逆轉錄反應制備cDNA，real time PCR 檢測CXCL12、EGFR和CCL2 mRNA 的表達，采用GAPDH 基因作為內參照，引物序列見表1。 采用2-ΔΔCt表示基因相對表達水平。

表1 定量RT-PCR 引物序列

1.3 統計學方法

應用SPSS 13.0 統計學軟件進行數據分析， 計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對細胞生長的影響

白藜蘆醇在低劑量組（5、10、20 μmol/L）對C3H10T1/2間質干細胞生長沒有明顯影響， 既不能促進細胞生長，同時對細胞生長也沒有明顯的抑制作用，隨著劑量增大至40 μmol/L 時，白藜蘆醇對細胞產生明顯的生長抑制作用，當劑量達到80～100 μmol/L 時，生長抑制率達到84%。表明高劑量的白藜蘆醇具有明顯的細胞毒性。 因此，后續實驗采用20 μmol/L 白藜蘆醇。見表2。

表2 不同濃度白藜蘆醇對C3H10T1/2 間質干細胞增殖的影響（±s，n = 4）

表2 不同濃度白藜蘆醇對C3H10T1/2 間質干細胞增殖的影響（±s，n = 4）

注：與0 μmol/L 比較，**P < 0.05；“-”表示基本無抑制，未計算該數據

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2.2 白藜蘆醇對rhBMP-2 促成骨分化影響

C3H10T1/2 間質干細胞經成骨誘導分化6 d 堿性磷酸酶染色顯示： 空白對照組細胞未見藍紫色；300 ng/mL rhBMP-2 組細胞呈藍紫色， 提示rhBMP-2能誘導間質干細胞早期成骨定向分化； 而300 ng/mL rhBMP-2+20 μmol/L 白藜蘆醇組ALP 陽性細胞數明顯增多，且ALP 顏色增深。 表明非毒性劑量下，20 μmol/L 白藜蘆醇能增強rhBMP-2 促成骨分化作用。 見圖1。

圖1 C3H10T1/2 間質干細胞成骨誘導6 d 堿性磷酸酶染色

2.3 白藜蘆醇對CXCL12、EGFR 和CCL2 mRNA 表達的影響

前期筆者通過網絡生物學對rhBMP-2 誘導C3H10T1/2 成骨分化基因表達譜進行分析， 結果發現，CXCL12、EGFR 和CCL2 基因在rhBMP-2 成骨分化網絡中處于中心節點。為了鑒定白藜蘆醇促成骨分化作用是否通過影響rhBMP-2 成骨分化網絡， 本研究用20 μmol/L 白藜蘆醇處理C3H10T1/2 細胞48 h后，觀察上述基因表達水平。 結果表明：白藜蘆醇處理組CXCL12、EGFR 和CCL2 表達水平分別為 （1.02±0.09）、（1.03±0.05）、（1.10±0.11），與對照組相比，差異無統計學意義（P > 0.05）。 見圖2。

圖2 白藜蘆醇對C3H10T1/2 細胞CXCL12、EGFR 和CCL2 mRNA表達的影響

3 討論

rhBMP-2 是一種被FDA 批準的重要促成骨藥物，目前已在臨床尤其是整形外科領域廣泛使用[4]。眾多研究表明，rhBMP-2 具有非常明顯的促進間質干細胞、 前體成骨細胞骨向分化作用[5-7]。 本研究采用300 ng/mL rhBMP-2 作用C3H10T1/2 間質干細胞6 d，ALP 染色表明，rhBMP-2 能誘導C3H10T1/2 間質干細胞早期成骨分化，與前述研究結果一致。

系統生物網絡揭示： 復雜疾病不能通過干預單一靶點而奏效， 必須通過干擾疾病生物網絡多個關鍵節點。 研究藥物干擾疾病網絡，形成了藥理學一個新興的分支——網絡藥理學或網絡生物學[8-9]。 前期筆者通過網絡生物學方法對rhBMP-2 誘導C3H10T1/2 成骨分化基因表達譜進行分析， 結果發現，CXCL12、EGFR 和CCL2 基因在rhBMP-2 成骨分化網絡中處于中心節點。 目前已經證明EGFR 信號參與骨原始細胞群維持、成骨分化平衡調控[10]，同時與前體成骨細胞活性和增殖[11]相關。而CXCL12 信號參與骨形成和骨吸收調控[12]。 最近表明BMP-9 誘導間質干細胞成骨分化早期和中期，CXCL12 信號軸發揮重要作用[13]。

綜觀目前國內外研究進展， 關于白藜蘆醇促成骨作用機制主要涉及到ERK1/2 信號通路[14]、WNT 信號通路[15]，同時通過激活Sirt1/Runx2[16]或者抑制PPAR2活性，從而抑制干細胞成脂分化，促進成骨分化[1]。 但是，間質干細胞成骨分化涉及到多基因、多信號通路組成的復雜基因調控網絡， 白藜蘆醇在整個成骨分化復雜生物網絡中起到怎樣的調控作用， 目前知之甚少。本研究采用20 μmol/L 白藜蘆醇聯合rhBMP-2作用C3H10T1/2 細胞， 結果表明白藜蘆醇具有促進rhBMP-2 的成骨誘導作用。 進一步分析白藜蘆醇對rhBMP-2 成骨分化網絡中心節點CXCL12、EGFR 和CCL2 的影響，結果表明白藜蘆醇對上述基因表達沒有明顯的作用。 這說明白藜蘆醇促成骨分化作用可能不是通過調控CXCL12、EGFR 和CCL2 網絡接點來實現。分析原因可能是：①在BMP-2 成骨分化網絡中，存在其他重要節點，白藜蘆醇可能通過影響其他網絡節點發揮作用； ②筆者僅僅分析了rhBMP-2 促成骨蛋白互作網絡， 對于rhBMP-2 更加復雜的轉錄調控網絡，由于需要更多時間點基因芯片數據，沒有進行分析；③成骨分化是一個動態的時續過程，網絡節點也會根據分化程度發生部分時續改變。

綜上， 本研究證明低劑量白藜蘆醇能增強rhBMP-2 成骨分化作用，在臨床上，可以聯合應用增強療效， 同時對白藜蘆醇作用進行了初步網絡分析。隨著研究深入，芯片數據量的增加，技術成熟，可以進一步對轉錄調控網絡、時續動態網絡進行分析，從而進一步解析白藜蘆醇促成骨分化機制。[1] Backesja CM，Li Y，Lindgren U，et al. Activation of Sirt1 Decreases Adipocyte Formation during Osteoblast Differentiation of Mesenchymal Stem Cells [J]. Cells Tissues Organs，2009，189（1-4）：93-97.

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