原花青素對營養肥胖模型大鼠氧化應激的影響

肖俊松，王 瑩，宋雪琳，吳 華，單靜敏，曹雁平,*

（1.北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風味化學北京重點實驗室，北京 100048；2. 江漢大學生命科學院，湖北 武漢 430058）

原花青素對營養肥胖模型大鼠氧化應激的影響

肖俊松1，王 瑩1，宋雪琳1，吳 華2，單靜敏1，曹雁平1,*

（1.北京工商大學 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風味化學北京重點實驗室，北京 100048；2. 江漢大學生命科學院，湖北 武漢 430058）

以高脂飼料喂養Wistar大鼠建立營養 肥胖模型，然后灌胃不同劑量葡萄籽原花青素4周，研究其對大鼠肥胖程度、氧化應激和炎癥的影響。結果表明：與模型組相比，葡萄籽原花青素可顯著降低肥胖大鼠體質量、腎周脂肪水平、肝臟濕質量、血清甘油三酯及血清總膽固醇水平，但對血清高密度脂蛋白和血清低密度脂蛋白水平無影響；葡萄籽原花青素可顯著降低大鼠血清中丙二醛水平，升高超氧化物歧化酶和過氧 化氫酶水平，但對谷胱甘肽過氧化物酶水平無影響；葡萄籽原花青素可降低白細胞介素-1的水平，且與原花青素劑量相關；對內毒素以及腫瘤壞死因子-α的水平無顯著影響，但可顯著恢復由高脂膳食導致的異常高的腸道壁通透性。

葡萄籽原花青素；肥胖；氧化應激；炎癥因子

原花青素是一類多酚類物質，是以黃烷-3-醇，如（＋）-兒茶素和（－）-表兒茶素為單體，通過C4—C6或者C4—C8鍵連接而成的聚合物[1]。原花青素是植物重要的次生代謝物，廣泛的存在于人類的膳食中，在果蔬中含量尤其豐富[2]。

原花青素有良好的抗氧化、清除自由基、減肥、消炎等生理活性[3-5]。流行病學調查也顯示，膳食中原花青素等多酚類物質的攝入，能顯著降低肥胖、糖尿病等代謝疾病發病幾率[6]，其機制已有較多研究。

近年來研究發現，在高脂膳食誘導大鼠肥胖過程中，腸道菌群和內毒素扮演了關鍵角色[7]。高脂膳食導致腸道菌群結構改變和腸道通透性異常，進一步導致機體內毒素水平的增加，內毒素水平升高，則會誘導慢性炎癥，改變機體健康表型，如肥胖、胰島素抵抗和糖尿病等[8-9]。原花青素可能通過對腸道菌群及內毒素水平產生影響，緩解炎癥及與之相關的機體氧化應激狀態，起到降低肥胖程度的作用。

因此，本實驗以高脂膳食誘導建立Wistar大鼠營養肥胖模型，探討原花青素對高脂膳食誘導營養肥胖模型大鼠肥胖程度、體內氧化應激狀態、炎癥水平、腸道壁通透性以及內毒素水平的影響，為后續研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

葡萄籽原花青素（≥95%） 天津尖峰天然產物公司。

SPF級Wistar雄性大鼠90只（90±10）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

丙二醛（ malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；大鼠內毒素試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）試劑盒、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）試劑盒及D-乳酸試劑盒 美國Rapid-Bio公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan MK3全自動多功能酶標儀 美國Thermo公司；全自動生化分析儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；UV-2000型紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗

營養肥胖模型的復制：出生3周后斷乳SPF級Wistar雄性大鼠90只，飼養于SPF級動物房，溫度25℃，濕度約30%，光照10～12 h/d。適應性喂養3 d后開始造模，造模方法為：隨機抽取8只大鼠，給予正常大鼠飼料，其余大鼠給予高脂飼料。6周后，稱量體質量，以體質量超過正常組大鼠平均體質量20%為造模成功。

造模成功后開始進行藥物處理，正常組大鼠8只，普通大鼠飼料，灌胃蒸餾水。造模成功的大鼠給予高脂飼料，并隨機分為模型組，原花青素高、中、低劑量組，每組8只，各組間體質量無顯著差異，分別灌胃蒸餾水，葡萄籽原花青素400、250、100 mg/（kg·d）。灌胃4周后，隔夜禁食，測定體質量，戊巴比妥麻醉大鼠，股動脈取血，用于生化指標測定；測定肝臟、腎和腎周脂肪濕質量。

1.3.2 生理生化指標測定

大鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）采用全自動生化分析儀測定；SOD、MDA、CAT以及GSH-Px采用試劑盒顯色，用分光光度法測定；血清內毒素、TNF-α、IL-1、IL-6及D-乳酸采用酶聯免疫試劑盒檢測。

1.4 數據處理與分析

采用DPS v7.05軟件，利用鄧肯（Duncan）新復極差法進行顯著性分析，來比較任意不同2個處理組的效應之間差異及差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 原花青素對肥胖大鼠肥胖相關指標的影響

表1 原花青素對大鼠體質量、體脂、臟器質量的影響（x =8）Table 1 Effect of grape seed procyanidins on body weight, perinephrit fat, kidney and liver weight of rats (x ±s,n = 8)

從表1可見，模型組體質量、脂肪濕質量、肝臟濕質量均顯著高于正常組，表明模型在整個實驗過程中均有效。與模型組相比，原花青素3個劑量均可極顯著降低肥胖大鼠體質量，顯著降低體脂含量，極顯著降低肝臟濕質量。各組腎質量均無顯著差異，提示高脂膳食及灌胃原花青素可能對腎質量無顯著影響。

表2 原花青素對大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的影響（x = 8）Table 2 Effect of grap seed procyanidins on total cholesterol, triglycerides, high-density and low-density lipoproteins in rat serum

表2 原花青素對大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的影響（x = 8）Table 2 Effect of grap seed procyanidins on total cholesterol, triglycerides, high-density and low-density lipoproteins in rat serum

組別 TG含量/（mmol/L）TC含量/（mmol/L）HDL-C含量/（mmol/L）LDL-C含量/（mmol/L）正常組 0.97±0.21a 1.77±0.17ab 0.63±0.08A 0.16±0.05b模型組 0.92±0.23a 1.94±0.36a 0.43±0.11B 0.24±0.05a低劑量組 0.64±0.18b 1.66±0.22b 0.41±0.04B 0.23±0.05a中劑量組 0.71±0.20ab 1.69±0.11b 0.41±0.04B 0.26±0.08a高劑量組 0.72±0.34ab 1.67±0.20b 0.40±0.06B 0.24±0.08a

從表2可見，與正常組相比，模型組的TG、TC水平無顯著差異，LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低。與模型組相比，葡萄籽原花青素可顯著降低TC水平，低劑量組可顯著降低血清TG水平，但對LDL-C和HDL-C均無顯著影響。

2.2 原花青素對肥胖大鼠氧化應激狀態的影響

高脂膳食誘導腸道菌群紊亂，導致內毒素水平升高，誘發機體炎癥，與此同時伴隨著機體處于氧化應激狀態[10-11]。從表3可見，與模型組相比，中劑量組原花青素可顯著升高CAT的水平，高劑量原花青素可顯著升高SOD的水平，同時，均可顯著降低MDA的水平，但3個劑量原花青素對GSH-Px水平無顯著影響。這說明，原花青素可以通過促進CAT、SOD水平的升高，降低MDA的水平，來緩解氧化應激壓力，促進機體健康。

表3 原花青素對肥胖大鼠氧化應激狀態的影響（x ±s，n == 88）TTaabbllee 33 EEffffeecctt ooff ggrrape seed procyanidins on oxidative stress in obese

表3 原花青素對肥胖大鼠氧化應激狀態的影響（x ±s，n == 88）TTaabbllee 33 EEffffeecctt ooff ggrrape seed procyanidins on oxidative stress in obese

組別 CAT活力/（U/mL） GSH-Px活力/（U/mL） MDA含量/（nmol/mL）SOD活力/（U/mL）正常組 6.37±2.40ab 748.24±55.21a 5.99±0.75AB,a 345.55±86.36c模型組 6.11±2.11b 730.89±103.99a 6.24±1.07A,a 356.11±57.98bc低劑量組 7.39±1.57ab 752.67±84.30a 4.03±0.66BC,b 390.39±116.18abc中劑量組 8.71±2.60a 770.42±128.97a 3.88±1.20C,b 464.13±111.02ab高劑量組 6.87±1.52ab 671.59±95.80a 4.07±2.38BC,b 477.47±113.37a

2.3 原花青素對肥胖大鼠炎癥的影響

表4 原花青素對肥胖大鼠炎癥因子、內毒素和腸道通透性的影響（x±s，n == 88）Table 4 Effect of grape seed procyanidins on inflammation factors, endotoxin and intestinal permeability in rats

表4 原花青素對肥胖大鼠炎癥因子、內毒素和腸道通透性的影響（x±s，n == 88）Table 4 Effect of grape seed procyanidins on inflammation factors, endotoxin and intestinal permeability in rats

組別 IL-1含量/（ng/L） IL-6含量/（ng/L） TNF-α含量/（ng/L）腸毒素活力/（U/L）D-乳酸/（mmol/L）正常組 47.96±4.30A,a 25.48±2.27B,bc 43.92±2.99a 3.55±0.62a 1.47±0.06a模型組 43.30±4.35AB,ab 26.24±1.78B,bc 47.79±6.74a 3.79±0.75a 2.15±0.34b低劑量組 42.58±5.17AB,ab 25.13±2.54B,c 42.62±4.86a 3.68±0.35a 1.49±0.05a中劑量組 35.83±3.57B,c 29.78±4.17AB,ab 42.84±4.60a 3.52±0.27a 1.46±0.03a高劑量組 41.58±7.86AB,b 32.86±5.26A,a 46.51±8.73a 3.96±0.26a 1.47±0.03a

從表4可見，灌胃葡萄籽原花青素的劑量組大鼠血清中IL-1的含量略低，但只有中劑量組作用達到顯著水平。中低劑量組原花青素可降低血清中TNF-α水平，但無顯著性。內毒素水平沒有發現顯著性差異，但原花青素低、中劑量組平均值低于模型組。D-乳酸是腸道微生物發酵產生的一種糖，大鼠體內無法合成。大鼠血清中的D-乳酸均為通過腸道壁進入，故D-乳酸的水平能反應腸道壁通透性[12-14]。模型組D-乳酸水平明顯高于正常組，說明高脂飼料導致了腸道壁通透性異常，而通過攝入原花青素，能顯著恢復腸道壁的通透性，達到 正常水平。

3 討 論

肝-腸是機體防御內毒素的關鍵屏障，健康大鼠腸道少量的內毒素會經靜脈進入肝臟，被肝臟內的枯否細胞清除[15-16]。高脂飲食誘導的大鼠肥胖模型，體脂和血脂均升高，還會100%患上非酒精性脂肪性肝病，清除內毒素功能受損。因此高脂飲食誘導的肥胖大鼠，腸道菌群結構失調，內毒素水平較高，細胞毒作用增加，內毒素通過特異受體或非特異膜結合方式作用于枯否細胞膜激發炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL–6、INF-γ等。已有研究表明，超重和肥胖者血清中IL-6水平會有一定的增高[17]，長期處于慢性炎癥會導致機體處于氧化應激狀態，產生大量自由基，導致機體功能逐漸受到損害，發生慢性代謝疾病[18-19]。

本研究發現原花青素具有極顯著的降低體質量、體脂及肝臟濕質量異常增加的作用，對血脂相關指標的分析表明，其可顯著降低TG、TC，但對HDL-C、LDL-C水平并無顯著影響，這與閆少芳等[17]研究一致。

本研究發現，原花青素可以顯著恢復因高脂膳食而被破壞的異常高的腸道壁通透性。異常高的通透性會導致腸道內大量有毒物質經過靜脈進入肝臟，加重肝臟解毒負擔。本次實驗中，內毒素水平各組之間有差異，但并不顯著，推測可能與內毒素檢測方法有關，需改進測定方法。

同樣，本研究發現原花青素對IL-1、IL-6及TNF-α的影響亦不顯著，但是對抗氧化相關的酶（除了GSH-Px）、MDA水平的影響較為顯著，說明原花青素作用位點不在上游的炎癥因子產生的相關通路上，而在炎癥因子誘導機體氧化應激的相關通路上，也可能和評價的指標有關[20]。原花青素對GSH-Px基本無影響，這與Puiggros等[21]的研究一致。Puiggros等[21]利用肝癌細胞系HepG2探討了葡萄籽原花青素對抗氧化酶系統的影響，發現葡萄籽原花青素很可能并不調節GSH-Px或谷胱甘肽還原酶的水平，而是直接調節谷胱甘肽的合成。原花青素對MDA的清除尤為顯著，這種清除是一種生化過程，還是純粹的化學清除，有待于進一步研究。

本研究未發現原花青素與其生理效應間存在依賴關系。在原花青素對血清TC、TG、HDL-C、LDL-C影響方面，低劑量組表現最佳；對氧化應激指標的影響方面，各劑量組表現不一；對D-乳酸影響方面，3個劑量組表現無顯著區別。生物體內，藥物與其生理效應只是在一定濃度范圍內存在近似線性的劑量依賴關系。本實驗設計的不同灌胃組別間原花青素給藥濃度范圍較寬，故不一定能反映劑量效應關系；縮小這個濃度范圍，或可進一步研究原花青素的劑量效應關系。

[1] 周素娟. 葡萄籽提取物原花青素的研究概況及其在我國保健食品中的應用[J]. 中國食品衛生雜志, 2007, 19(3): 284-286.

[2] YAMAKOSHI J, SAITO M, KATAOKA S, et al. Safety evaluation of proanthocyanidin rich extract from grape seeds[J]. Food Chem Toxicol, 2002, 40(5): 599-607.

[3] PINENT M, BLADE C, SALVADO M J, et al. Procyanidin effects on adipocyte-related pathologies[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2006, 46: 543-550.

[4] DECORDE K, TEISSEDRE P L, SUTRA T, et al. Chardonnay grape seed procyanidin extract supplementation prevents highfat diet-induced obesity in hamsters by improving adipokine imbalance and oxidative stress markers[J]. Mol Nutr Food Res, 2009, 53: 659-666.

[5] 何青芳, 俞敏, 陳雅萍, 等. 超重肥胖與血壓、血糖和血脂關系分析[J]. 中國農村衛生事業管理, 2010, 30(9): 773-775.

[6] KIMBERLY A G, JOSHUA D L. Laboratory, epidemiological, and human intervention studies show that tea (Camellia sinensis) may be useful in the prevention of obesity[J]. J Nutr, 2010, 140: 3446-3453.

[7] HEILBRONN L K, CAMPBELL L V. Adipose tissue macrophages, low grade inflammation and insulin resistance in human obesity[J]. Curr Pharm Des, 2008, 14(12): 1225-1230.

[8] CANI P D, BIBILONI R, KNAUF C, et al. Changes in gut microbiota control metabolic endotoxemia-induced inflammation in high-fat dietinduced obesity and dabetes in mice[J]. Diabetes, 2008, 57: 1470-1481.

[9] 朱亭, 謝宇, 劉娟, 等. BVT273對肥胖小鼠胰島素抵抗及炎癥指標的影響[J]. 南京醫科大學學報, 2008, 28(8): 968-972.

[10] ZEMEl M B. Role of calcium and dairy products in energy partitioning and weight management[J]. Am J Clin Nutr, 2004, 79(5): 907-912.

[11] HEANEY R P, DAVIES K M, BARGER LUX M J. Calcium and weight : clinical studies[J]. J Am Coll Nutr, 2002, 21(2): 152-155.

[12] JOHNSTON S D, SMYE M, WATSON R P. Intestinal permeability testsin coeliac disease[J]. Clin Lab, 2001, 47(3/4): 143-150.

[13] 孫曉慶, 付小兵, 張蓉, 等. 創傷后腸道通透性改變血漿標志物D-乳酸的實驗研究仁[J]. 中國危重病急救醫學, 2000, 12(8): 476-478.

[14] MURRAY M J, BARBOSE J J, COBB C F. Serum D (-)-lactate levels as a predictor of acute intestinal schemia in a rat model[J]. Journal of Surgical Research, 1993, 54(5): 507-509.

[15] 楊林輝, 蔡俊, 陳東風. 非酒精性脂肪型肝炎患者腸道菌群的變化及意義[J]. 臨床肝膽病雜志, 2012, 28(2): 124-126.

[16] 伍烽, 金先慶. 腸-肝屏障在腸道細菌和內毒素移位中的作用[J]. 中華小兒外科雜志, 1997, 18(3): 188-190.

[17] 閆少芳, 李勇, 吳娟, 等. 葡萄籽提取物原花青素調節血脂作用及機理研究[J]. 中國食品衛生雜志, 2003, 15(4): 302-304.

[18] THORAND B, LOWEL H, SCHNEIDER A, et al. C-reactive protein as a predictor for incident diabetes mellitus among middle-aged men: results from the MONICA Augsburg cohort study, 1984—1998[J]. Arch Intern Med, 2003, 163(1): 93-99.

[19] CHANBERS J C, EDA S, BASSETT P, et al. C-reactive protein, insulin resistance, central obesi ty, and coronary heart disease risk in Indian Asians from the United Kingdom compared with European whites[J]. Circulation, 2001, 104(2): 145-150.

[20] 張迪, 籍保平, 周峰, 等. 食品體外抗氧化能力評價方法探討[J]. 北京工商大學學報: 自然科學版, 2012, 30(1): 20-25.

[21] PUIGGROS F, FLOPIZ N, ARDEROL A, et al. Grape seed procyanidins prevent oxidative injury by modulating the expression of antioxidant enzyme systems[J]. J Agric Food Chem, 2005, 53(1): 60-80.

Effect of Grape Seed Procyanidins on Oxidative Stress in Diet-Induced Obese Rats

XIAO Jun-song1, WANG Ying1, SONG Xue-lin1, WU Hua2, SHAN Jing-min1, CAO Yan-ping1,*
(1. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. College of Life Sciences, Jianghan University, Wuhan 430058, China)

Nutritional obesity model was induced by feeding Wistar rats with a high-fat diet. The model rats were treated with different dose of grape seed procyanidins by gavage for 4 weeks. The effect of grape seed procyanidins on obesity, oxidative stress and inflammation was investigated in these model rats. The results showed that grape seed procyanidins significantly decreased body weight, perinephrit fat weight and liver weight. Grape seed procyanidins could also decrease the levels of triglyceride and total cholesterol in serum, but no effect on high-density lipoprotein or low-density lipoprotein was observed. It also exhibited a decrease of malonaldehyde level in rat serum and an increase in the levels of superoxidase and catalase, but no effect on glutathione peroxidase was observed. The effect of grape seed procyanidins on the levels of TNF-α, IL-1, IL-6 and endotoxin was not significant. Grape seed procyanidins could significantly restore the abnormally high intestinal permeability caused by high-fat diet.

grape seed procyanidins; obesity; oxidative stress; inflammation factors

TS201.4

A

1002-6630（2014）03-0183-04

10.7506/spkx1002-6630-201403037

2013-08-11

國家自然科學基金項目（31201323）；北京市自然科學基金項目（6123033）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD23B02）

肖俊松（1980—），男，副教授，博士，研究方向為功能食品和腸道菌群。E-mail：xiaojs@th.btbu.edu.cn

*通信作者：曹雁平（1961—），男，教授，博士，研究方向為超聲化學與天然產物化學。E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn