苦蕎異槲皮苷對人胃癌細胞SGC-7901增殖及凋亡的影響

李玉英，趙淑娟，白崇智，張立偉，王轉花,*

（1. 山西大學 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；2.山西省中醫藥研究院中心實驗室，山西 太原 030012）

苦蕎異槲皮苷對人胃癌細胞SGC-7901增殖及凋亡的影響

李玉英1，趙淑娟1，白崇智2，張立偉1，王轉花1,*

（1. 山西大學 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；2.山西省中醫藥研究院中心實驗室，山西 太原 030012）

從苦蕎中提取制備異槲皮苷，研究其對人胃癌細胞SGC-7901增殖、凋亡、遷移和細胞周期的影響。將異槲皮苷作用于人胃癌SGC-7901細胞和人腎上皮細胞系293T，通過噻唑藍法檢測異槲皮苷對其增殖的影響；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI) 熒光染色法觀察細胞核的形態學變化；劃痕擦傷遷移實驗檢測異槲皮苷對SGC-7901細胞遷移能力的影響；流式細胞術檢測異槲皮苷對SGC-7901細胞凋亡及細胞周期的影響。結果表明：苦蕎異槲皮苷可以抑制SGC-7901細胞的增殖，并呈時間和劑量依賴性，當用100 ?mol/L異槲皮苷作用細胞48 h后，對SGC-7901細胞的增殖抑制率達到35.92%， 而對人腎上皮細胞系293T的增殖抑制率僅為 3.15%；DAPI熒光染色法觀察異槲皮苷處理細胞后，染色體凝聚，有凋亡小體產生；劃痕擦傷實驗顯示，異槲皮苷能抑制SGC-7901細胞的遷移；流式細胞術檢測結果表明，異槲皮苷可使G1和S期細胞減少，G2/M期細胞增多，且細胞凋亡率明顯增加。綜上所述，苦蕎麥異槲皮苷能夠誘導SGC-7901細胞發生凋亡，阻斷細胞周期并抑制細胞增殖和遷移。

異槲皮苷；人胃癌細胞SGC-7901；細胞周期；凋亡；細胞遷移

苦蕎是我國傳統的藥食兩用作物，尤其是黑苦蕎，營養價值極高，所含營養成分比較復雜，主要有生物類黃酮、活性蛋白質、脂肪酸、氨基酸、微量元素等[1]，其中黃酮類物質的含量較高，并具有極其廣泛的生理和藥理活性，如抗氧化、清除自由基、抗突變、降血糖、抗炎癥、調節免疫等功能[2-4]。人體不能自身合成黃酮類化合物，主要從植物中攝取。苦蕎黃酮主要成分為蘆丁，其次還有槲皮素和異槲皮苷等，由于其所在部位不同及提取方法各異，其含量也有所差異，其中異槲皮苷（isoquercetin）是存在于苦蕎中的一種次生代謝產物，主要存在于苦蕎種子、花及麩皮中。到目前為止，已有一些文獻論述了異槲皮苷抗氧自由基作用[5]，但是關于它抗腫瘤作用的報道較為少見。胃癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，在世界范圍內其發病率和死亡率均較高，而失控性生長和增殖及細胞凋亡受阻是惡性腫瘤細胞的重要特征[6-7]，因此，抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡將有利于胃癌的預防和治療，其應用前景廣闊。本研究將苦蕎異槲皮苷作用于人胃癌 SGC-7901細胞，并以人腎上皮細胞系293T作為對照組，研究其對腫瘤細胞生長及遷移的抑制作用，以及其對細胞周期及凋亡的影響等，以期為其抗胃癌的分子機制及應用開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

苦蕎麥種子為貴州威黑蕎，由山西省農科院農作物品種資源研究所提供；人胃癌細胞株 SGC-7901和人腎上皮細胞系293T購自中國科學院上海生命科學院細胞庫。

DMEM培養液 美國HyClone公司；無支原體胎牛血清 杭州四季青公司；胰酶、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 北京索萊寶科技有限公司；四甲基偶氮唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、DAPI、核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）和碘化丙啶（propidium iodide，PI） 美國Sigma公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（annexinV-FITC）細胞凋亡檢測試劑盒 美國Bio-Vision公司；其他試劑均為國產分析純。

流式細胞儀 美國Elite ESP公司；酶聯免疫檢測儀美國Bio-Rad公司；激光共聚焦顯微鏡 日本Olympus公司；電子天平 上海天平儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎異槲皮苷樣品制備

苦蕎異槲皮苷樣品制備按照文獻[8-10]進行，以70%的乙醇為溶劑，固液比為1∶20（m/V），采用索氏提取法進行加熱回流提取，粗提液進一步經酶解后經高效液相色譜分析證明，其中的主要成分異槲皮苷純度達96.7%以上，相對分子質量為464.38。

1.2.2 細胞培養

人胃癌細胞株SGC-7901和人腎上皮細胞系293T在含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 ?g/mL鏈霉素的DMEM培養液中生長，并置于37℃、5% CO2相對飽和濕度的孵育箱中培養，細胞呈貼壁生長，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.3 噻唑藍法檢測細胞的存活率

選取對數生長期SGC-7901細胞和人腎上皮細胞系293T，以1×104cells/孔接種于96孔培養板中，每孔加100 ?L培養基，37℃、5% CO2過夜培養至細胞完全貼壁，加入不同濃度（25～200 ?mol/L）異槲皮苷[8]分別培養24、48、72 h后，每孔加20 ?L MTT繼續培養4 h后，棄上清每孔加入150 ?L DMSO，室溫低速振蕩10 min，待結晶物溶解后，于酶標免疫測定儀測定波長490 nm處的吸光度（A）值。實驗用0.1% DMSO作為對照。每組設5個復孔，實驗重復3次。實驗組均與對照組相比，并用t檢驗進行統計學分析。

腫瘤細胞的生長抑制率/% = （1－A實驗組/A空白對照組）×100

1.2.4 DAPI染色檢測細胞核的形態學變化

將對數期SGC-7901細胞接種于6孔板中，培養過夜待細胞貼壁且生長良好，加入終濃度為100 ?mol/L的異槲皮苷， 對照組用等體積的0.1% DMSO代替，37 ℃培養24 h后收集細胞，用預冷的磷酸緩沖溶液洗滌后重懸于固定液中30 min，之后將懸液低速離心，收集沉淀，用同樣緩沖溶液洗滌2次后將細胞懸液滴到載玻片上，用2 ?g/mL的DAPI避光染色15 min，熒光顯微鏡下觀察細胞核的形態學變化。

1.2.5 劃痕法檢測SGC-7901細胞的遷移能力

細胞劃痕法是測定腫瘤細胞遷移的方法之一。在12孔板背后畫直線做標記，取對數生長期的SGC-7901細胞（1×106cells/mL）接種于12孔板，待細胞貼壁后，棄去培養基，磷酸緩沖液洗細胞2次，用10 ?L移液器槍頭在培養孔的中央沿縱軸方向劃一直線，磷酸緩沖液漂洗細胞2次，以去除漂浮細胞。加入終濃度為100 ?mol/L的異槲皮苷，對照組設為等體積的0.1% DMSO， 培養0～24 h，于倒置顯微鏡下觀察劃痕處細胞的生長情況。每組檢測5個視野，每組3個復孔，實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

將對數期SGC-7901細胞接種于6孔板中，培養過夜待細胞貼壁后，加入終濃度為100 ?mol/L的異槲皮苷，對照組設為等體積的0.1% DMSO，37 ℃分別培養24 h后，胰酶消化收集細胞，PBS洗2次，400 ?L 1×Binding buffer重新懸浮細胞后，分別加入5 ?L的Annexin V-FITC和5 ?L的PI并使其混勻，室溫、避光的條件下孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 細胞周期的檢測

將對數期SGC-7901細胞接種于6孔板中，培養過夜待細胞貼壁后，加入終濃度為100 ?mol/L的異槲皮苷，對照組設為等體積的0.1% DMSO，37 ℃培養24 h后，用胰酶消化收集細胞，于70%乙醇中4 ℃固定1 h，1 200 r/min離心5 m i n，棄去乙醇，并用P B S洗2次，加P I（10 mg/mL）染液懸浮細胞，然后在避光條件下37 ℃孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期的變化。

1.3 統計學分析

2 結果與分析

2.1 異槲皮苷抑制腫瘤細胞的MTT法檢測

圖1 不同濃度的異槲皮苷作用不同的時間對SGC-7901細胞增殖的影響Fig.1 Effect of isoquercetin concentration on cell proliferation of SGC-7901 cells during different treatment times

由圖1的MTT法檢測結果可知，苦蕎異槲皮苷濃度為25～200 ?mol/L時，能夠抑制人胃癌細胞的增殖，隨著濃度的增加和時間的延長，異槲皮苷對SGC-7901細胞的抑制作用也逐漸增強，即呈現時間和劑量依賴性。

圖2 異槲皮苷對SGC-7901和293T細胞增殖的影響Fig.2 Inhibitory effect of isoquercetin on the growth of SGC-7901 and 293T cells

由圖2可知，苦蕎異槲皮苷各濃度對人腎上皮細胞系293T的增殖影響很小。100 ?mol/L異槲皮苷作用細胞48 h后，對SGC-7901細胞的增殖抑制率達到35.92%，而對人腎上皮細胞系293T的增殖抑制率僅為3.15%。實驗組與對照組相比較，均呈現顯著性差異。

2.2 SGC-7901細胞核的形態學變化檢測

圖3 熒光顯微鏡觀察細胞核的形態學變化(×100)Fig.3 Morphological changes of nuclei in SGC-7901 cells under fluorescence microscope (×100)

由圖3可知，經異槲皮苷作用后的細胞核形態與對照組相比發生了顯著變化，對照組細胞的細胞核染色均勻，并呈現均勻的低強度熒光；當用100 ?mol/L異槲皮苷作用SGC-7901細胞24 h后，染色體凝集，并有凋亡小體產生。實驗結果表明，經異槲皮苷作用的SGC-7901細胞出現了凋亡信號。

2.3 異槲皮苷對SGC-7901細胞遷移能力的影響

圖4 劃痕擦傷實驗檢測SGC-7901細胞遷移Fig.4 Migration of SGC-7901 cells in scratch-recovering tests

在體外培養的單層細胞上劃痕致傷，然后加入藥物觀察其抑制腫瘤細胞遷移的能力。由圖4、表1可知，分別培養細胞12 h和24 h后，SGC-7901細胞發生遷移，對照組細胞分別遷移了4.9 ?m和10.5 ?m，而加入100 ?mol/L異槲皮苷作用后，細胞分別遷移了2.8 ?m和 6.1 ?m, 細胞的遷移能力較對照組減弱，當用100 ?mol/L異槲皮苷作用細胞12 h和24 h時，其抑制率分別為42.8%和41.9%，由此可見，苦蕎異槲皮苷可以抑制SGC-7901細胞的遷移。

表1 異槲皮苷作用SGC-7901細胞后的遷移距離（x ±s, nn==33）Table 1 Migration distance of SGC-7901 cells in the presence of isoquercettiinn ((x ±s,, n == 33))

2.4 SGC-7901細胞的凋亡檢測

為了檢測異槲皮苷對胃癌細胞凋亡的影響，分別用0.1%的DMSO和100 ?mol/L異槲皮苷作用于SGC-7901細胞24 h，用Annexin V/FITC 和 PI染色，收集細胞用流式細胞儀檢測。由圖5可知，對照組早期凋亡率為0.5%，晚期凋亡率為1.3%，用100 ?mol/L的異槲皮苷處理細胞后的早期凋亡率為6.0%，晚期凋亡率為23.0%，凋亡率均較對照組明顯升高，可見異槲皮苷可以誘導SGC-7901細胞發生凋亡。

圖5 流式細胞術檢測異槲皮苷對SGC-7901細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of isoquercetin from F. tataricum on apoptosis of SGC-7901 cells examined by flow cytometric analysis

2.5 異槲皮苷對SGC-7901細胞周期的影響

流式細胞術檢測異槲皮苷對SGC-7901細胞周期的影響，結果如圖6所示，用100 ?mol/L的異槲皮苷作用SGC-7901細胞24 h后，與對照組相比，細胞在G2/M期的比率增加，而在G1和S期的細胞比率減少，由此推斷，苦蕎異槲皮苷可能通過阻斷細胞周期于G2/M期，從而抑制細胞的增殖。

圖6 流式細胞術檢測異槲皮苷對SGC-7901細胞周期分布的影響Fig.6 Effect of isoquercetin from F. tataricum on cell cycle distribution of SGC-7901 cells examined by flow cytometric analysis

表2 異槲皮苷對SGC-7901細胞周期的影響分析Table 2 Effect of isoquercetin fromF. tataricum on cell cycle distribution of SGC-7901 cells

3 討 論

胃癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率均較高，嚴重威脅著人們的健康，近年來，胃癌的發病率呈現上升的趨勢。由于其早期診斷困難、手術機會低、對放射及化療均不敏感，而植物來源的抗腫瘤藥具有種類多、毒副作用小、不良反應少的特點，因此從植物中尋找高效的抗腫瘤藥物已成為一種新的研究思路。從蕎麥中分離出的天然黃酮類小分子物質異槲皮苷具有成本低、毒副作用小的特點，提示異槲皮苷可以作為抑制胃癌細胞生長的一個輔助性藥物，在胃癌的藥物治療方面具有潛在應用價值。

細胞凋亡是機體細胞在正常生理或病理狀態下發生的一種自發的程序化的死亡過程，它的發生受到機體的嚴密調控，許多抗癌藥物都是通過觸發腫瘤細胞凋亡通路而達到抑制腫瘤生長的目的[11-12]。本研究用一定濃度的異槲皮苷作用于胃癌細胞SGC-7901，結果發現細胞形態學改變，細胞核中染色體凝集，有凋亡小體產生。

腫瘤細胞的侵襲、轉移是腫瘤惡性生物學行為的主要特征，是一個復雜的多步驟的生物學過程[13-15]，惡性腫瘤的侵襲、轉移是引起腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因之一。而遷移是腫瘤細胞轉移過程中必不可缺的環節之一，細胞遷移是多步驟協同作用的結果[16]，它不僅是細胞進行很多重要生理活動的基礎，同時也是腫瘤發生等病理過程中的重要步驟和關鍵環節。本研究發現異槲皮苷處理后，可以有效抑制SGC-7901細胞遷移，其具體機制有待進一步研究。

細胞周期的調節是一個復雜的過程，阻滯細胞增殖周期進程會引起凋亡，而凋亡也常伴有細胞生長阻滯[17-18]。細胞在一定的條件下，可使細胞周期進程阻斷，導致有絲分裂異常或停滯，使癌細胞無法繼續分裂，致使癌細胞的生長受到抑制[19-20]。當用一定濃度的苦蕎異槲皮苷處理SGC-7901細胞后經流式細胞儀檢測，發現其細胞周期分布存在異常，處于G1期和S期的細胞數比例減少，而處于G2/M期的細胞比率增加，提示異槲皮苷可能通過阻滯細胞在G2/M期來抑制細胞增生。

本研究采用噻唑藍和流式細胞儀等，檢測了異槲皮苷對 SGC-7901 細胞的增殖抑制及誘導凋亡作用，噻唑藍法檢測結果表明異槲皮苷可以抑制SGC-7901細胞的增殖，并具有時間和劑量依賴性；異槲皮苷作用 SGC-7901細胞后，可見染色體凝集，并出現凋亡小體等典型的細胞凋亡的形態學變化。流式細胞儀檢測發現，異槲皮苷作用SGC-7901 細胞24 h后， 它可以阻斷細胞周期，誘導細胞發生凋亡。由此推斷，阻斷細胞周期和誘導腫瘤細胞發生凋亡可能是異槲皮苷抗腫瘤作用的重要機制，而本實驗為進一步研究異槲皮苷的抗腫瘤作用及苦蕎保健、藥用價值的開發可提供有參考意義的實驗依據。

[1] TSAI H, DENG H, TSAI S, et al. Bioactivity comparison of extracts from various parts of common and tartary buckwheats: evaluation of the antioxidant- and angiotensin-converting enzyme inhibitory activities[J]. Chemistry Central Journal, 2012, 6(1): 78. doi:10.1186/1752-153X-6-78.

[2] TAUR J S, RODRIGUEZ-PROTEAU R. Effects of dietary avonoids on the transport of cimetidine via P-glycoprotein and cationic transporters in Caco-2 and LLC-PK1 cell models[J]. Xenobiotica, 2008, 38(12): 1536-1550.

[3] 閆斐艷, 崔曉東, 李玉英, 等. 苦蕎麥黃酮對人食管癌細胞EC9706增殖的影響[J]. 中草藥, 2010, 41(7): 1142-1145.

[4] HANNEKEN A, LIN F F, JOHNSON J, et al. Flavonoids protect human retinal pigment epithelial cells from oxidative stress-induced death[J]. Invest Ophthalmol Via Sci, 2006, 47(7): 3164-3177.

[5] LI Yanqin, ZHOU Fengchao, GAO Fan, et al. Comparative evaluation of quercetin, isoquercetin and rutin as inhibitors of a-glucosidase[J]. J Agric Food Chem, 2009, 57: 11463-11468.

[6] BASKIN-BEY E S, GORES G J. Caspase-8, death-receptor signaling, and hepatocarcinogenesis: the fas and the furious[J]. Gastroenterology, 2005, 129(5): 1790-1792.

[7] LEUNG H W, LIN C J, HOUR M J, et al. Kaempferol induces apoptosis in human lung non-small carcinoma cells accompanied by an induction of antioxidant enzymes[J]. Food Chem Toxicol, 2007, 45(10): 2005-2013.

[8] 崔曉東, 王轉花. 苦蕎蘆丁水解酶的最適作用條件及Cu2+對酶活性的抑制[J]. 食品科學, 2012, 33(7): 223-227.

[9] 肖詩明, 張忠, 李勇, 等. 苦蕎麥麩皮中黃酮的提取工藝條件研究[J].食品科學, 2006, 27(1): 156-158.

[10] 王敏, 高錦明, 王軍, 等. 苦蕎莖葉粉中總黃酮酶法提取工藝研究[J].中草藥, 2006, 37(11): 1645-1648.

[11] RAMOS A M, ALLER P. Quercetin decreases intracellular GSH content and potentiates the apoptotic action of the antileukemic drug arsenic trioxide in human leukemia cell lines[J]. Biochem Pharmacol, 2008, 75(10): 1912-1923.

[12] YOKOTA J. Tumor progression and metastasis[J]. Carcinogenesis, 2000, 21(8): 497-503.

[13] CHEN Wenshu, WANG Xia, ZHUANG Jianguo, et al. Induction of death receptor 5 and suppression of survivin contribute to sensitization of TRAIL-induced cytotoxicity by quercetin in non-small cell lung cancer cells[J]. Carcinogenesis, 2007, 28 (10): 2114-2121.

[14] EBERT B, SEIDEL A, LAMPEN A. Phytochemicals induce breast cancer resistance protein in Caco-2 cells and enhance the transport of benzo[a]pyrene-3-sulfate[J]. Toxicol Sci, 2007, 96(2): 227-236.

[15] BURZ C, BERINDAN-NEAGOE I, BALACESCU O, et al. Apoptosis in cancer: key molecular signaling pathways and therapy targets[J]. Acta Oncol, 2009, 48 (6): 811-821.

[16] SKUPIEN K, OSZMIANSKI J, TARASIUK J, et al. in vitro antileukaemic activity of extracts from berry plant leaves against sensitive and multidrug resistant HL60 cells[J]. Cancer Lett, 2006, 236 (2): 282-291.

[17] MORISAKI T, UCHIYAMA A, YUZUKI D, et al. Interleukin 4 regulates G1cell cycle progression in gastric carcinoma cells[J]. Cancer Res, 1994, 54(4): 1113-1118.

[18] LIM D Y, JEONG Y, TYNER A L, et al. Induction of cell cycle arrest and apoptosis in HT-29 human colon cancer cells by the dietary compound luteolin[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007, 292(6): 66-75.

[19] WANG Ping, ZHANG Ke, ZHANG Qing, et al. Effects of queretin on the apoptosis of the human gastric carcinoma cells[J]. Toxicol in Vitro, 2012, 26(2): 221-228.

[20] van ZANDEN J J, WORTELLBOER H M, BIJLSMA S, et al. Quantitative structure activity relationship studies on the avonoid mediated inhibition of multidrug resistance proteins 1 and 2[J]. Biochem Pharmacol, 2005, 69(4): 699-708.

Effect of Isoquercetin from Fagopyrum tataricum on the Proliferation and Apoptosis of Human Gastric Carcinoma Cell Line SGC-7901

LI Yu-ying1, ZHAO Shu-juan1, BAI Chong-zhi2, ZHANG Li-wei1, WANG Zhuan-hua1,*
(1. Key Laboratory for Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Central Laboratory of Shanxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030012, China)

Isoquercetin was extracted from Fagopyrum tataricum and investigated for its effect on cell proliferation, apoptosis and migration of human gastric carcinoma cell line SGC-7901. Cell proliferation was examined by using MTT assay. The morphological changes of SGC-7901 were observed by DAPI nuclear staining. The effect of Fagopyrum tataricum isoquercetin on cell migration was investigated by scratch-recovering tests in cell culture plates, as well as its effect on cell apoptosis by flow cytometry. As a result, MTT assay showed that the isoquercetin could inhibit the viability of SGC-7901 cells in time- and dose-dependent manners. SGC-7901 cell growth was inhibited by 35.92% or more at isoquercetin concentration of 100 μmol/L for 48 h, compared to only 3.15% for 293T cells under the same conditions of concentration and culture duration. DAPI nuclear staining showed chromosomal condensation and the production of apoptotic bodies. Scratch-recovering tests indicated that the isoquercetin could suppress cell migration. Flow cytometry showed that the number of cells at the G1phase and S phase decreased and increased at the G2/M phase and the apoptotic cell population exhibited a signifi cant increase. Taken together, isoquercetin from F. tataricum can induce apoptosis, arrest cell cycle and inhibit cell proliferation and migration of SGC-7901 cells.

isoquercetin; human gastric carcinoma cell line SGC-7901; cell cycle; apoptosis; cell migration

R965

A

1002-6630（2014）03-0193-05

10.7506/spkx1002-6630-201403039

2013-03-20

國家自然科學基金項目（31171659）；山西省自然科學基金項目（2011011035-4）；山西省高校科技開發項目（2012004）

李玉英（1969—），女，副教授，博士，研究方向為生物活性物質與蛋白質工程。E-mail：lyy9030@sxu.edu.cn

*通信作者：王轉花（1956—），女，教授，博士，研究方向為生物活性物質與蛋白質工程。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn