復合誘變法選育谷氨酰胺轉胺酶高產菌株

張 瑩，郭琛琛，黑東燕，張 偉，魯 偉，金明飛,*

（1.華東師范大學生命科學學院，上海 200241；2.泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411）

復合誘變法選育谷氨酰胺轉胺酶高產菌株

張 瑩1，郭琛琛1，黑東燕1，張 偉1，魯 偉2，金明飛1,*

（1.華東師范大學生命科學學院，上海 200241；2.泰興市東圣食品科技有限公司，江蘇 泰興 225411）

為篩選谷氨酰胺轉胺酶高產菌株，利用紫外-硫酸二乙酯復合誘變、一次篩選的方法誘變生產菌株茂源鏈霉菌（Streptoymyces mobaraensis），結合高通量篩選技術篩選高產菌株。結果表明：復合誘變的方式較單獨誘變的方式效率高。經過誘變的高產菌株由于酶的成熟加快或者蛋白表達量增加而提高了酶活力，最高可達7.02 U/mL，比野生菌株提高了54%。進一步研究高產菌株發現，高產菌株谷氨酰胺轉胺酶的成熟加快，可提前24 h結束發酵；發酵液中酶原含量高，會降低發酵液中酶活性。

谷氨酰胺轉胺酶；茂源鏈霉菌；硫酸二乙酯；紫外；復合誘變

微生物谷氨酰胺轉胺酶（EC. 2.3.2.13，microbial transglutaminase，MTG）作為一種蛋白的“超級黏合劑”[1]，在食品行業中有著廣泛的應用[2-3]，2012年國內的銷售總額近1億元，已經成為最大的單一食品用酶制劑。盡管如此，生產菌株茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）的MTG產量較低，產酶水平只有日本味之素公司的1/3～1/5左右，跟國際水平相比具有較大的提升空間[4-5]。作為食品用酶，對MTG的生產有著嚴格的規定，必須符合相關法律和GB2760—2011《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》等要求，要提高其產量目前最好的方法是傳統的誘變育種技術[6]。紫外（ultraviolet，UV）誘變雖然誘變譜比較廣泛，但較難獲得某些氨基酸的突變，而且突變效率較低[7-8]；而硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）的誘變譜可與紫外誘變形成互補[9]。目前UV-DES復合誘變主要有兩種方法：直接用UV、DES對菌懸液誘變后再涂布篩選[10]，對茂源鏈霉菌來說其缺點是致死率過高，難以得到理想的高產菌株；用UV（或DES）誘變后篩選高產菌株，再用DES（或UV）對高產菌株進行誘變、篩選[11]，這個方法一般耗時較長。本實驗探討了鏈霉菌孢子經UV（或DES）誘變后直接擴增培養，然后收集擴增后的孢子再進行DES（或UV）誘變、篩選，以提高誘變效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis，ATCC27441），本實驗室保存。

1.1.2 培養基

高氏一號培養基（g/L）：NaCl 0.5、MgSO4?7H2O 0.5，KNO31、K2HPO4?3H2O 0.5、FeSO4?7H2O 0.01、可溶性淀粉20、瓊脂20，pH 7.2～7.4。

種子培養基（g/L）：MgSO4?7H2O 2 、K2HPO4?3H2O 2、酵母膏5、甘油20、魚粉蛋白胨25，pH 7.4。

發酵培養基（g/L）：MgSO4?7H2O 2、K2HPO4?3H2O 2、酵母膏6、甘油20、魚粉蛋白胨25，pH 7.4。

1.1.3 試劑

還原型谷胱甘肽 中國醫藥上?；瘜W試劑公司；N-芐氧羰基-L-谷氨酰甘氨酸（Na-CBZ-Gln-Gly） 上海多肽公司合成；其他試劑均為分析純試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 技術路線

茂源鏈霉菌孢子培養→收集孢子→第1輪UV（或DES）誘變→擴增培養、收集孢子→第2輪DES（或UV）誘變→涂布、獲取單菌落→高通量篩選→搖瓶復篩→突變菌株表達比較

1.2.2 誘變

以前期篩選到的穩定高產突變株作為出發菌株，在多次傳代純化的基礎上選擇其中1株開展本實驗[12-13]。根據實驗已經優化的條件進行紫外誘變[12-13]；DES誘變條件參考文獻[14]進行，具體條件為：將孢子濃度為108個/mL的菌液700 μL用PBS稀釋10 倍，實驗組加入0.5% DES，用鋁泊紙包裹避光，置于37 ℃搖床中反應55 min，取出立即2 500 r/min離心10 min，離心后棄上清，用無菌水重懸，稀釋涂板。

第1輪用UV誘變，不經篩選擴增，所有突變菌株第2輪用DES誘變的實驗組記為UV/DES組；同樣地，第1輪用DES誘變，第2輪用UV誘變的實驗組記為DES/UV組。兩輪均未誘變的記為CK組，而第1輪用UV或DES誘變，第2輪未經處理的記為UV組或DES組。

1.2.3 篩選

根據本實驗室優化的篩選方法進行[12-13]。即根據菌落形態，用96孔板高通量篩選的方法進行初步篩選，然后對候選的菌株利用搖瓶培養進行復篩。

正負突變率的計算：菌株發酵酶活力高于野生菌株酶活力的110%記為正突變，低于野生菌株發酵酶活力的90%記為負突變；其余則為等義突變?？偼蛔兟蕿檎撏蛔兟手?。

（正/負）突變率/%=（正/負）突變菌株數/總菌株數×100

1.2.4 酶活力測定

按照比色法測定發酵液中MTG酶活力[6]。

1.2.5 蛋白表達量檢測

[15]的方法用SDS-PAGE檢測發酵液中MTG的表達情況，上樣量為總蛋白含量120μg。蛋白含量測定用美國Bio-Rad公司的ChemiDoc? XRS成像儀自帶掃描軟件分析，通過灰度掃描和蛋白總量計算每個條帶的蛋白含量。

1.3 數據分析

圖像處理和數據分析用GraphPad Prism5軟件處理。

2 結果與分析

2.1 復合誘變的篩選

圖1 復合誘變的突變率Fig.1 Mutation rates induced by the combined mutagenesis

如圖1所示，復合誘變與單純的UV誘變或DES誘變相比，正突變率沒有顯著差異，但不論是DES/UV或者UV/DES的組合方式，負突變率及總的突變率均較單純的誘變方式有顯著提高。

圖2 復合誘變初篩菌株的酶活力Fig.2 Enzymatic activities of screened mutants

如圖2篩選結果所示，復合誘變的平均酶活力比對應的單一誘變或者野生菌株均有所下降，UV/DES組合誘變組與單純用UV誘變或DES誘變組平均酶活力顯著降低，這些結果與突變率一致（圖1）。由于突變一般都是負突變較多，因此這也說明復合誘變的突變頻率高于單一誘變，效果可能優于單一誘變。此外復合誘變組中有某些特別高產的菌株出現。此外這些結果提示DES的誘變效率可能高于UV。

2.2 突變菌株的復篩

將經過初步篩選后產量高于野生菌株酶活力110%的菌株作為候選菌株進行搖瓶復篩。如圖3所示，除了1株只經DES誘變的菌株外，在發酵至72h時，各復合誘變菌株的酶活力均較野生菌株高。但是在發酵至48h時，UV、DES單獨誘變及UV/DES復合誘變的菌株各有1株較野生菌株酶活力高，而DES/UV復合誘變菌株有3株的酶活力高于野生菌株。

圖3 各突變菌株復篩酶活力Fig.3 Time course of TG activity in cultures with different secondround screened mutants

綜合2.1節的結果， DES/UV的復合誘變方式優于DES或UV單獨誘變的效果。而由于這種誘變方式只需要篩選一次，因此較傳統的誘變-篩選-再誘變的方式效率高；結合高通量的篩選方法[12]，使得本誘變育種技術勞動強度大大下降，篩選量和成功率大大提高。

選取高產菌株，進一步的搖瓶發酵的發酵液中酶活力顯示，酶活力最高的突變菌株DES/UV2（7.02 U/mL）比野生菌株（4.56 U/mL）產量提高了50%以上（數據未顯示），而突變菌株在培養48h時最高酶活力已經可以達到5.83 U/mL，比野生菌株最高酶活力時高了近30%。從生產角度來說，該菌株不僅提高了產量，還大大縮短了產酶時間，可以大大節約成本。

2.3 高產菌株MTG表達

在獲得高產菌株的基礎上，對部分復篩效果較好的菌株利用SDS-PAGE技術進行分析，嘗試對其高產機制進行初步研究。如圖4所示，這些高產菌株的產酶活性提高并不是單純的表達量增加所引起，最重要的還與成熟機制有關。

圖4 不同發酵時間突變菌株MTG蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression with high-yield mutants at different time points of culture

24 h時突變株7（泳道7）發酵液中的總MTG表達量較野生菌株（泳道8）高，但酶活力為2.71 U/mL，比野生菌株的2.79 U/mL略低。發酵至48 h后這種成熟的差異更加明顯，如突變菌株3的總MTG量比突變菌株4低，但其酶活力（5.8 U/mL）卻比后者（3.18U/mL）高了近1倍。而48 h時酶活力較高的其他幾個菌株：突變菌株1（5.83 U/mL）、突變菌株5（4.48 U/mL）及突變菌株7（5.16 U/mL）均是MTG成熟較早、MTG比例較高的菌株。

這些結果說明，突變菌株產量（發酵液酶活力）的提高可能與酶原（Pro-MTG）、成熟MTG量的相互比例有關。高產菌株的高產機制可能與MTG的成熟相關。

2.4 MTG高產差異比較

MTG在胞內被合成（pre-pro-TG）后，切除信號肽以酶原（pro-TG，本研究標識為Pro-MTG）的形式被分泌到胞外，在經過一系列蛋白酶的切割后，最終形成成熟的MTG[16]。由此可見，發酵液中MTG的酶活力不僅與MTG胞內合成——即總MTG質量（包括酶原、酶）有關，還受到成熟進程的影響。

在對高產機制有了初步認識的基礎上，為了進一步研究酶原與酶之間的相關關系，本研究對部分經復合誘變獲得的高產菌株進行了進一步的分析。幾株高產菌株的發酵液上清經電泳后利用ChemiDoc? XRS+成像儀掃描分析酶原（Pro-MTG）和成熟酶（MTG）的蛋白質量和相對含量，結果如表1所示。

表1 高產菌株發酵液上清中酶原、酶的蛋白質量和百分比Table1 Protein amounts and proportions of pro-MTG and MTG in cultures of high yield mutants

由表1可知，高產菌株之間的產酶時間存在較大差異，MU2雖然72h時酶活力最高，但是48h時產酶活性甚至低于野生菌株。MU4菌株雖然與野生菌株相比最高酶活力差異較小，但48h時的酶活力比野生菌株高了近50%。

進一步分析可以發現，發酵液中MTG的酶活力不僅跟MTG表達量有關，還受Pro-MTG蛋白量的抑制，最明顯的是48h時，MU2中MTG的含量與MU1相似，但其酶活力卻只有MU1的60%左右；而MU4發酵液中MTG的含量雖然只有野生菌株的90%左右，酶活力卻比野生菌株高41.5%。

線性回歸分析（99%可信度）發現，酶活力與Pro-MTG蛋白量、MTG蛋白量、Pro-MTG比例和MTG比例的相關系數分別為－0.7607（P=0.0010）、0.9286（P ≤0.0001）、－0.5929（P=0.0198）和0.7393（P= 0.0016），均有較高的相關性，且酶活力與MTG含量正相關、與Pro-MTG含量負相關，這也進一步證明發酵液中MTG活性確實會受到酶原的抑制。

這些結果說明部分突變菌株產量提高是由于成熟方式發生了改變，加快MTG的成熟可以提高發酵液中MTG的酶活力。

3 3 討 論

連續對孢子進行UV、DES誘變的策略由于每種單個突變本身頻率低，使得有利突變組合概率極低；先DES（或UV）誘變后篩選高產菌株，再對高產菌株進行UV（或DES）的方法，易把那種某個單獨突變不能明顯提高產量而與其他突變組合能顯著提高產量的突變遺漏。而本實驗用UV（或DES）對鏈霉菌孢子懸液進行誘變，將誘變后的懸液涂布擴增孢子后不經篩選直接用DES（或UV）進行誘變，將二次誘變后的懸液稀釋涂布、挑單菌落篩選這樣的育種工藝雖然較直接將孢子懸液連續用DES及UV誘變后涂布篩選的方法繁瑣，但是卻可以對某種誘變方式誘變后獲得的有利突變（不一定明顯提高產量）通過菌株擴大培養而得到保留，從而為二次誘變時提供更多的突變組合，提高了獲得必須擁有UV及DES誘變才能提高產量的菌株。

一般紫外誘變的特點是突變譜比較廣，但是效率比較低，不易獲得理想的突變株[14,17-18]；而化學誘變劑的突變譜相對較窄，一般情況下不能獲得AT→CG突變[9,19]。通過本研究的復合誘變方式可以有效地將兩種突變的優勢結合。同時研究也證實，化學誘變的效果較紫外誘變好[20]，而復合誘變的效果比單種誘變效果理想。

通過復合誘變的方式，可順利篩選到了若干高產菌株，通過搖瓶發酵復篩驗證發現，突變菌株最高酶活力比野生菌株提高了50%以上；突變菌株不僅產量有所提高，其產酶時間也明顯提前。該菌株在縮短1/3生產時間的情況下仍可以比野生菌株在正常發酵時間下的酶活力提高近20%的產量。

在獲得高產菌株的基礎上，本實驗探討了突變菌株的高產機制。通過SDS-PAGE和灰度掃描的方法，首次證明發酵液中MTG的酶活力不僅僅與MTG自身的含量有關，還有酶原的含量成反比。發酵液中酶原含量的升高會直接導致總酶活力的下降，這可能酶原是成熟MTG的競爭性抑制劑的原因[21]。這些結果提示要獲得MTG高產菌株，一個重要的手段是提高酶原的轉化率和成熟速度[22]。在生產上，除了盡可能促使酶原轉變為成熟的MTG[23]，還要盡可能在純化工藝中去除酶原，以解除其對MTG的抑制作用。在今后的研究中，可進一步探索酶原對MTG抑制的原理，研究這種抑制的具體機理，以更好地促進MTG成熟、提高MTG的生產效率、降低MTG的生產成本。

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Screening and Characterization of High-Yield Microbial Transglutaminase-Producing Mutants Induced by a Novel Method

ZHANG Ying1, GUO Chen-chen1, HEI Dong-yan1, ZHANG Wei1, LU Wei2, JIN Ming-fei1,*
(1.School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China；2. Taixing Dongsheng Food Science and Technology Co. Ltd., Taixing 225411, China)

Microbial transglutaminase (MTG)-producing strain Streptoymyces mobaraensis (S. mobaraensis) was subjected to mutagenesis using UV irradiation and diethyl sulfate (DES) treatment and the resulting colonies were screened by a high throughput method. Results showed that the combined mutagenesis had better performance than single mutagenesis. The high-yield MTG-producing mutants had either a higher MTG protein expression or a shortened maturation time of MTG. Among these, one mutant had the highest yield of 7.02 U/mL enzymatic activity, which was 54% higher than that of the wild-type strain. Further study found that this strain expressed MTG products 24 hours earlier than the wild-type one did. However, the yield of MTG could be highly inhibited by the zymogen pro-MTG.

microbial transglutaminase (MTG); Streptomyces mobaraensis; diethyl sulfate (DES); ultraviolet (UV); combined mutation

Q939.97

A

1002-6630（2014）11-0139-04

10.7506/spkx1002-6630-201411028

2013-07-12

中央高?；究蒲袠I務費專項資金項目（78210203）；華東師范大學青年教師隊伍建設科研啟動費（79633430）

張瑩（1992—），女，本科，研究方向為食品微生物。E-mail：510139229@qq.com

*通信作者：金明飛（1979—），男，助理研究員，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：mfjin@bio.ecnu.edu.cn