1株高效降膽固醇乳酸菌的功能與發(fā)酵特性

靳志敏，通力嘎，段 艷，賈雪暉，劉夏煒，王德寶，靳 燁

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

隨著人們生活水平的提高、肉品加工技術(shù)的不斷改進和冷藏工藝的出現(xiàn)，人們生活節(jié)奏的不斷加快，營養(yǎng)知識的逐漸普及，發(fā)酵香腸越來越受到人們的青睞[1]。羊肉作為一種優(yōu)良的畜肉，在世界各國都有著悠久的食用歷史。同時，肉制品中含有大量的膽固醇，而血清中的膽固醇被認為是誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險因素[2]。

自然界中乳酸菌大量存在于發(fā)酵制品中，國內(nèi)外均有大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在體內(nèi)降低血液中膽固醇含量1%，即可降低心血管病的發(fā)病率2%～3%[3]。大量研究發(fā)現(xiàn)人們經(jīng)常食用發(fā)酵制品具有降低人體血清膽固醇的作用[4]。為此，人們對乳酸菌開展了體內(nèi)外降解膽固醇研究，旨在開發(fā)功能性乳酸菌制品，滿足人們健康的需要。因此研究降膽固醇性能優(yōu)良的菌株，對于開發(fā)功能性發(fā)酵制品、豐富現(xiàn)有發(fā)酵制品的種類、提高發(fā)酵制品的附加價值以及在食品加工中都具有重要的現(xiàn)實意義。

本實驗進一步研究經(jīng)初步篩選得到的膽固醇降解率較好的乳酸菌的降膽固醇特性，為篩選性能優(yōu)良的乳酸菌作發(fā)酵香腸發(fā)酵劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保存的經(jīng)初步篩選得到的1株具有降膽固醇性能的乳酸菌X3-2B；標(biāo)準(zhǔn)菌株：植物乳桿菌（L.plantarum，LP） 廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，a2m1.191。

MRS-THIO培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中添加0.2 g/100 mL牛膽鹽和0.2 g/100 mL巰基乙酸鈉；膽固醇篩選培養(yǎng)基：MRS-THIO培養(yǎng)基中添加2%無菌膽固醇溶液（1.0 g/100 mL）[5]；模擬肉湯-CHOL培養(yǎng)基：模擬肉湯液體培養(yǎng)基中添加0.2 g/100 mL牛膽鹽和0.2 g/100 mL巰基乙酸鈉，121 ℃滅菌15 min后，添加2%無菌膽固醇溶液（1.0 g/100 mL）；MRS＋6 g/100 mL NaCl＋150 mg/kg NaNO2-CHOL培養(yǎng)基：MRS-THIO培養(yǎng)基中添加6 g/100 mL NaCl 和150 mg/kg NaNO2，121 ℃滅菌15 min后添加2%無菌膽固醇溶液（1.0 g/100 mL）。

1.2 試劑與儀器

牛膽鹽 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；巰基乙酸鈉 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；膽固醇 美國Sigma公司；BioSenTec Lot：28-12091膽固醇檢測試劑盒南京建成生物工程研究所。

ZHJH-C1214C超凈工作臺 南京依貝儀器設(shè)備有限公司；YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；胴體肌肉pH值直測儀 武漢恒綠食品技術(shù)有限公司；HD-3A型智能水分活度計測量儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；TCP2型全自動測色色差計 北京奧依克光電儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株降膽固醇性能的測定

將各菌株于液體MRS培養(yǎng)基中活化3代后按2%接種量接于膽固醇篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后于12 000 r/min離心10 min后，取上清液0.5 mL用鄰苯二甲醛比色法測定其膽固醇含量[6-8]。實驗重復(fù)3次取平均值。

1.3.1.1 不同溫度對膽固醇降解能力的影響

將菌株于液體MRS培養(yǎng)基中活化3代后按2%接種量接種于液體膽固醇篩選培養(yǎng)基中，分別于4、10、15、25、30、45 ℃培養(yǎng)24 h，以不接種培養(yǎng)基為對照測定其膽固醇含量，實驗重復(fù)3次取平均值，計算其膽固醇降解率[9]。

1.3.1.2 不同pH值對膽固醇降解能力的影響

將菌株于液體MRS培養(yǎng)基中活化3代后按2%接種量接種于pH 3.5、4.5、5.5、6.0的液體膽固醇篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h以不同pH值的不接種培養(yǎng)基為對照，測定其膽固醇含量，實驗重復(fù)3次取平均值，計算其膽固醇降解率[4]。

1.3.1.3 不同培養(yǎng)基中膽固醇降解能力

將菌株于液體MRS培養(yǎng)基中活化3代的菌株以2%接種量接種于液體膽固醇篩選培養(yǎng)基、模擬肉湯-CHOL培養(yǎng)基、MRS＋6 g/100 mL NaCl＋150 mg/kg NaNO2-CHOL培養(yǎng)基中[4]，培養(yǎng)24 h后測定其膽固醇含量，實驗重復(fù)3次取平均值，計算膽固醇降解率。

1.3.2 菌株在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用

以內(nèi)蒙古蘇尼特羊后腿肉與背部脂肪按肥廋比為20∶80制作3組發(fā)酵香腸：第1組（對照組）：以環(huán)境中自然菌株做發(fā)酵劑；第2組：以X3-2B為發(fā)酵劑；第3組：以標(biāo)準(zhǔn)菌株LP為發(fā)酵劑。分別在發(fā)酵香腸0、3、6、9、14 d時測定各組發(fā)酵香腸乳酸菌數(shù)、細菌總數(shù)、水分活度、pH值、色差值，并用膽固醇檢測試劑盒測定其0、14 d時各組香腸膽固醇含量[10-11]。其中，色差：L*表示亮度，L*=100為白，L*=0為暗；L*值越大，色澤越白。a*＞0表示紅色程度，a*＜0表示綠色程度。b*＞0表示黃色程度，b*＜0表示藍色程度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS17.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的功能特性

2.1.1 不同培養(yǎng)溫度對菌株降膽固醇性能的影響

圖1 不同培養(yǎng)溫度對菌株膽固醇降解率的影響Fig.1 Cholesterol degradation efficiencies at different temperatures

由圖1可知，不同培養(yǎng)溫度對菌株膽固醇降解能力有一定影響，菌株在30 ℃時膽固醇降解能力與4、10、15 ℃條件下膽固醇降解能力差異顯著（P＜0.05），與25 ℃和45 ℃時膽固醇降解能力差異不顯著。在相對較低溫度（4、10、15 ℃）條件下培養(yǎng)的菌株其膽固醇降解能力差異不大，都為30%左右，30 ℃時菌株膽固醇降解能力最大。菌株在30 ℃時，生長能力較好及產(chǎn)酸能力較強，會產(chǎn)生游離膽酸，膽固醇和游離膽酸共沉淀，使膽固醇含量降低，而在溫度較低或較高時，菌株生長能力較弱，培養(yǎng)基中膽固醇略有下降是由菌體細胞的吸收作用引起的[12]。

2.1.2 不同酸度對菌株降膽固醇性能的影響

圖2 不同pH值對菌株膽固醇降解率的影響Fig.2 Cholesterol degradation efficiencies at different pH levels

由圖2可知，菌株X3-2B在培養(yǎng)基pH值為5.0、5.5、6.0時膽固醇降解能力顯著高于培養(yǎng)基pH值為3.5、4.5（P＜0.05）時，且當(dāng)培養(yǎng)基pH 5.5時膽固醇降解能力最大。有研究[13-14]表明，乳酸菌在體外培養(yǎng)條件下，較低的pH值會提高其膽鹽水解能力，從而形成游離膽酸，與膽固醇發(fā)生共沉淀，從而降低膽固醇含量，但pH值太低會抑制菌株生長，從而pH 5.5時菌株膽固醇降解能力較好[15]。

2.1.3 不同培養(yǎng)基對菌株降膽固醇性能的影響

圖3 不同培養(yǎng)基對菌株膽固醇降解率的影響Fig.3 Cholesterol degradation efficiencies in different media

由圖3可知，不同培養(yǎng)基中同一菌株膽固醇降解率差異不顯著（P＞0.05），菌株X3-2B在不同培養(yǎng)基中膽固醇降解大于標(biāo)準(zhǔn)菌株LP在不同培養(yǎng)基中的膽固醇降解率，且各株菌在MRS培養(yǎng)基中膽固醇降解率最大。各培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的不同使得菌株在各培養(yǎng)基中生長能力不同，導(dǎo)致其在各培養(yǎng)基中的膽固醇降解能力不同。

2.2 乳酸菌在發(fā)酵香腸中的發(fā)酵特性

發(fā)酵肉制品是指腌制肉經(jīng)過微生物發(fā)酵作用，產(chǎn)生特殊的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地，并具有較長保存期的肉制品。發(fā)酵劑乳酸菌可降低pH值，減少腐敗，改善制品組織狀態(tài)，且具有降低膽固醇的益生功能。

2.2.1 菌株對發(fā)酵香腸中微生物的影響

由表1可知，各個時間段細菌總數(shù)與乳酸菌數(shù)差別不大，可知發(fā)酵香腸在發(fā)酵、成熟、干燥、貯藏等階段乳酸菌起著關(guān)鍵作用。在發(fā)酵香腸做作的相同階段，X3-2B組與LP組的乳酸菌數(shù)高于對照組，在發(fā)酵6 d時乳酸菌數(shù)分別為8.23、8.62（lg（CFU/g）），這與Ambrosiadis等[16]的研究結(jié)果相一致。通過接種發(fā)酵劑，使乳酸菌在發(fā)酵香腸中迅速生長。發(fā)酵期由于適宜的溫度、pH值和濕度，菌數(shù)總數(shù)與乳酸菌數(shù)迅速增高，隨著時間的延長，到干燥成熟期香腸低pH值、低溫和不斷降低的水分活度抑制了細菌的生長，成熟后期細菌總數(shù)均不斷降低。

表1 菌株對發(fā)酵香腸中微生物的變化Table 1 Variations in bacterial quantities in fermented sausages

2.2.2 菌株對發(fā)酵香腸水分活度、pH值的影響

表2 發(fā)酵香腸水分活度與pH值變化Table 2 Variations in aw and pH in fermented sausages

由表2可知，發(fā)酵香腸水分活度隨發(fā)酵時間的增加而逐漸減少，各實驗組不同天數(shù)之間水分活度差異顯（P＜0.05）。X3-2B組在發(fā)酵香腸各個階段其水分活度顯著低于對照組，水分活度下降速度較快。X3-2B組與LP組在加工各個階段其pH值顯著（P＜0.05）低于對照組，且X3-2B組在發(fā)酵結(jié)束階段（0～3 d）pH值速迅降低到4.7，然后緩慢增加，而LP組3～6 d時pH值速迅降低到5.0后緩慢增加，可知菌株X3-2B在肉品中的產(chǎn)酸性能優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株。發(fā)酵香腸水分活度的下降與pH值呈直線關(guān)系，且隨著發(fā)酵香腸pH值的降低，其水分活度也呈下降趨勢，但pH值對水分活度的影響較小[17]。故菌株X3-2B產(chǎn)酸性能優(yōu)良，發(fā)酵迅速，能快速降低發(fā)酵香腸pH值。

2.2.3 菌株對發(fā)酵香腸色差的影響

由表3可知，不同實驗組在發(fā)酵3 d與6 d時色差值差異不顯著（P＞0.05），與對照組相比，加發(fā)酵劑組的發(fā)酵香腸a*值與b*值小于對照組，顏色更紅更飽滿。在對發(fā)酵香腸色澤的評價中，b*值的不同單純測定發(fā)酵香腸的a*值并不能完全評價人們的觀察結(jié)果，因此采用a*/b*值來比較紅色，更能貼切地反映出人們對紅色的感官評價。a*/b*值越大，表現(xiàn)出的紅色越鮮艷[18]。在發(fā)酵香腸制作的各個階段，各組發(fā)酵香腸明度值L*、紅度值a*與黃度值b*都呈先下降后增加的趨勢。

表3 發(fā)酵香腸色差變化Table 3 Variation in color parameters in fermented sausages

2.2.4 發(fā)酵香腸膽固醇含量

表4 發(fā)酵香腸膽固醇含量Table 4 Cholesterol content in fermented sausages mg/100 g

由表4可知，加發(fā)酵劑組的發(fā)酵香腸中膽固醇含量顯著降低（P＜0.05），而對照組中膽固醇含量無顯著變化，且標(biāo)準(zhǔn)菌株在肉中的膽固醇降解能力稍強于菌株X3-2B。這與Staji?等[19]制作的豬肉發(fā)酵香腸中膽固醇含量變化情況相吻合，其在第14天時各組發(fā)酵香腸膽固醇含量差異不顯著。在貯存28 d與56 d時，X3-2B組發(fā)酵香腸中膽固醇含量顯著降低（P＜0.05），到56 d時膽固醇含量為52.83 mg/100 g，LP組發(fā)酵香腸中2周后膽固醇含量沒有顯著性變化。在發(fā)酵香腸貯存56 d時，X3-2B組發(fā)酵香腸中膽固醇含量最低。工業(yè)生產(chǎn)中膽固醇含量一般在58.48～105.24 mg/100 g[19-20]之間，由此可知，菌株X3-2B對肉中膽固醇降解性能較優(yōu)良。

3 結(jié) 論

菌株X3-2B在培養(yǎng)溫度為30 ℃，pH值為5.5時膽固醇降解能力最強。在不同培養(yǎng)基中，菌株膽固醇降解率大于標(biāo)準(zhǔn)菌株LP，且各菌株在MRS膽固醇培養(yǎng)基中的膽固醇降解率最大。

菌株X3-2B在發(fā)酵香腸加工適應(yīng)溫度（15～25 ℃）、適應(yīng)pH值（5.0～6.0）條件下，有較好的膽固醇降解率，且發(fā)酵香腸水分活度、pH值、色澤與乳酸菌數(shù)都優(yōu)于對照組，在貯存56 d時發(fā)酵香腸膽固醇含量低于對照組與LP組。

綜上所述，菌株X3-2B降膽固醇性能、功能特性與發(fā)酵特性優(yōu)良，故可作為1株功能、發(fā)酵特性優(yōu)良的肉制品發(fā)酵劑。

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