乳酸乳球菌乳脂亞種冷凍干燥保護劑優化及其貯藏穩定性

陳俊亮，張慧蕓，田 芬，霍貴成，康懷彬

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；2.東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.杭州娃哈哈集團有限公司研究院，浙江 杭州 310018）

乳酸乳球菌是乳球菌屬最重要和最典型的1個種，包含乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種[1-2]，被用作乳品發酵劑具有悠久的歷史[3-4]，主要用于生產干酪、黃油和酪乳[5]。在乳制品發酵工業中，乳酸乳球菌可將牛奶中的乳糖發酵形成乳酸，進而產生風味物質雙乙酰和乙醛[6]，并在干酪成熟過程中，其胞內肽酶和胞外蛋白酶可促進干酪中蛋白質水解，對成熟干酪風味物質形成具有重要作用[7]。

乳酸乳球菌菌粉制備通常采用真空冷凍干燥技術，但在凍干過程中會導致部分菌體細胞的損傷或死亡，以及某些蛋白酶分子鈍化，從而造成發酵活力下降[8]。通過添加保護劑可有效地減少冷凍干燥對乳酸菌傷害，在直投式發酵劑制備過程中具有重要作用[9]。

本實驗以內蒙古自治區發酵乳中的乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326為研究目標[10]，首先采用單因素試驗和Plackett-Burman試驗設計研究不同凍干保護劑對菌體細胞存活率的影響，篩選關鍵因素，再利用最陡爬坡試驗和Box-Behnken響應面設計確定主要影響因素的最佳質量濃度，以提高真空冷凍干燥過程中菌體細胞的存活率，為開發新型干酪菌種保護劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326 乳品科學教育部重點實驗室工業微生物菌種保藏中心（KLDSDICC）。

MRS培養基：胰蛋白胨10 g/L、蛋白胨5 g/L、牛肉膏5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、吐溫-80 1mL/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸錳0.25 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L，pH 6.8，121 ℃滅菌15 min。固體培養基添加15 g/L瓊脂。

脫脂乳粉 德國 Nordmilch AG公司；海藻糖 上海華精生物高科技有限公司；VC 上海晶純試劑有限公司；蔗糖、乳糖、谷氨酸鈉、甘油 天津基準化學試劑有限公司；脫脂乳粉、海藻糖和谷氨酸鈉為食品級；其他均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

KLF2000型發酵罐 瑞士比歐生物工程公司；Christ Alpha 1-4型凍干機 德國Marin Christ公司；ES-2030型冷凍干燥儀 日本Hitachi公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海離心機械研究所；SPX-150B生化培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；HVE-50型高壓滅菌器 日本Hirayama公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養與收集

乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326經過活化后，以4%接種量接種到發酵罐中，恒溫培養至穩定期前期，在4 ℃條件下4 500 r/min離心15 min，收集菌體。

1.3.2 真空冷凍干燥工藝

用等體積0.85 g/100 mL無菌生理鹽水充分懸浮混合菌體，接著4 ℃離心收集菌體，然后等體積加入不同質量濃度的保護劑于安培瓶中；樣品先放置在-80 ℃預冷凍24 h后，再放入真空冷凍干燥機中進行凍干，通過菌體細胞存活率反映保護劑的保護效果[11]。

1.3.3 活菌計數

采用梯度稀釋平板活菌計數法[12]，恒溫培養48 h后計數。

1.3.4 菌體細胞存活率計算

1.3.5 保護劑篩選單因素試驗

選取脫脂乳粉、谷氨酸鈉、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘油、硫酸錳和VC作為凍干保護劑，將上述8 種物質用蒸餾水分別配制成以下質量濃度的溶液：乳粉、蔗糖、乳糖、海藻糖分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0 g/100 mL，甘油為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/100 mL，谷氨酸鈉1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/100 mL，VC為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g/100 mL，硫酸錳為0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 g/100 mL。脫脂乳粉115 ℃保溫殺菌10 min[13]；甘油、硫酸錳121 ℃保溫殺菌15 min；VC、蔗糖、乳糖、海藻糖、谷氨酸鈉溶液采用0.22 μm膜過濾除菌[14]，冷卻后置于4 ℃冰箱備用，以滅菌蒸餾水作為對照，測定凍干前后活菌數，計算菌體細胞存活率。

1.3.6 Plackett-Burman析因試驗

利用Design-Expert軟件進行Plackett-Burman析因設計，選擇次數為N=12的實驗，對8 種保護劑進行效應分析，每個因素分別取-1、＋1兩個水平，設定高水平為低水平的1.5 倍，響應值為凍干后的細胞存活率。

1.3.7 最陡爬坡試驗

根據析因試驗結果設計最陡爬坡試驗路徑[15]，按照一定梯度增加脫脂乳粉的質量濃度，降低海藻糖和甘油的質量濃度，其他5個因素均固定為初始質量濃度，檢測凍干后菌體細胞存活率的變化，以確定3個因素的最適質量濃度范圍。

1.3.8 中心組合設計試驗

以菌體存活率Y為響應值，采用Box-Behnken方法進行試驗設計，根據實驗結果建立二次響應面回歸模型，以尋求最優實驗數據。實驗選用三因素三水平共17 個試驗點的響應面法試驗，其中析因部分試驗次數為12 次，中心點重復試驗次數為5 次，用以估計試驗誤差。

1.3.9 凍干菌粉的貯藏穩定性實驗

使用最佳保護劑制備凍干菌粉，將其分別放置于4 ℃和25 ℃保存12 個月，每隔30 d測定菌體細胞存活率，平行3 次實驗，檢測菌粉的貯藏穩定性[16]。

1.4 數據統計分析

所有數據均為3個重復樣品的平均值，采用SPSS13.0軟件進行統計分析，判斷彼此間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同凍干保護劑對乳酸乳球菌凍干存活率的影響

對不同質量濃度的8種保護劑及不加保護劑的對照組進行單因素試驗，通過測定乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326在凍干前后活菌數，比較不同保護劑對菌體的保護效果，結果見圖1。

表1 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 1 Plackett-Burman experimental design and corresponding response of cell survival rate

圖1 不同凍干保護劑對乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326凍干存活率的影響Fig.1 Effect of different cryoprotectants on the survival rate of Lactococcus lactis subsp.cremoris KLDS 4.0326

由圖1可知，未添加保護劑的乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326凍干存活率為7.53%，當添加8 種單一保護劑后，均對其產生保護效果。由圖中曲線變化趨勢可知，隨著保護劑添加量的增加，菌體的存活率不斷提高。當單一保護劑脫脂乳粉、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘油、谷氨酸鈉、VC、硫酸錳的質量濃度分別為8.0、10.0、10.0、8.0、4.0、3.0、0.9、0.7 g/100 mL時，菌體存活率分別達到最高值：48.26%、33.43%、31.25%、36.92%、42.02%、34.36%、18.12%和21.52%，此后繼續增加保護劑質量濃度，保護效果反而呈現降低趨勢，這是由于高質量濃度的保護劑會加速細胞內的蛋白質聚合，形成較強玻璃化結構，反而不利于菌體細胞的保存，并且復水效果不理想，因此，當保護劑質量濃度超過它們的最佳質量濃度后，菌體存活率隨著各種保護劑添加量的增加反而下降[17]。

2.2 Plackett-Burman試驗篩選主要影響因素

Plackett-Burman實驗結果見表1。利用Design-Expert軟件對表1中的細胞存活率數據進行回歸分析，得到各影響因子的偏回歸系數及其顯著性（表2）。

由表1可知，脫脂乳粉、谷氨酸鈉、蔗糖、硫酸錳對細胞存活率的影響為正效應，而其他因素產生負效應。脫脂乳粉和海藻糖對菌體存活率的影響高度顯著（P＜0.01），甘油對菌體存活率的影響顯著（P＜0.05），其他因素差異不顯著，因此選取脫脂乳粉、海藻糖、甘油3個因素作為研究對象。

表2 Plackett-Burman試驗設計各因素的效應評價Table 2 Estimated effects of Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗結果和中心試驗點的確定

根據Plackett-Burman實驗結果設計最陡爬坡試驗路徑，試驗結果如表3所示，4號試驗中脫脂乳粉、海藻糖、甘油的質量濃度分別為10.5、7.5、3.0 g/100 mL時，菌體細胞存活率達到最大值84.05%，然后隨著質量濃度的變化細胞存活率逐漸降低。結果表明，4號試驗中3個因素的質量濃度接近最大響應區域，因此將其作為中心組合試驗的中心點。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table 3 Steepest ascent experimental design and corresponding results

2.4 響應面試驗優化最佳保護劑配比

2.4.1 Box-Behnken試驗結果及回歸方程方差分析

Box-Behnken試驗結果見表4，對實驗數據進行響應面分析，回歸方程的方差分析結果如表5所示。

表4 Box-Behnken優化設計及結果Table 4 Box-Behnken design and corresponding results

將所有數據進行多元回歸擬合，獲得菌體細胞存活率對編碼自變量脫脂乳粉、海藻糖和甘油的二次多項回歸方程為：

從模型的方差分析表可知，本實驗所選用的二次多項模型具有高度顯著性（PModel＜0.000 1），失擬項不顯著（PLotoffit＝0.116 1），其校正決定系數為R2Adj＝0.984 6，說明有98.46%的菌種細胞存活率變化能由此模型進行解釋；相關系數為R2＝0.993 2，說明模型對實際情況擬合較好，可用此模型對細胞存活率進行分析和預測。

表5 回歸方程方差分析Table 5 Analysis of variance for the regression equation

2.4.2 響應面圖及等高線圖分析

利用Design-Expert軟件設計得到的響應面圖和等高線圖，可直觀地反映各因素對響應值的影響，以及在反應過程中的交互作用影響。在等高線圖中，橢圓型或者馬鞍型的等高線表示因素之間交互作用顯著，而圓型的等高線表示因素之間交互作用較弱。由圖2可知，脫脂乳粉與海藻糖、海藻糖與甘油對菌體存活率影響的交互作用高度顯著，而脫脂乳粉與甘油的交互作用不顯著。

圖2 各因素及交互作用對菌體存活率影響的響應面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the effects of different factors and their interaction on cell survival rate

2.4.3 驗證實驗結果

通過Design-Expert軟件進行數據分析，以獲得最大菌體存活率為目標，計算得到的最佳配方質量濃度為：脫脂乳粉10.77 g/100 mL、海藻糖7.81 g/100 mL、甘油3.31 g/100 mL，在此基礎上得到菌體細胞存活率理論預測值為89.12%。使用最佳保護劑配比進行9 組驗證實驗，菌體細胞存活率達到（87.43±1.62）%，實測值與預測值相近，說明響應面法建立的數學模型較準確可靠。

2.5 菌粉的保存穩定性實驗結果

圖3 KLDS4.0326凍干菌粉在4℃和25℃條件下保存期間菌體細胞存活率的變化Fig.3 Changes in cell survival rate of KLDS 4.0326 with storage time at 4 and 25 ℃

制備的乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326菌粉分別在4 ℃和25 ℃條件下保存12 個月，由圖3可知，隨著保存時間的增加，活菌數均呈現下降趨勢，但是25 ℃貯藏時存活率下降更明顯，在第12個月末檢測兩種保藏溫度下的活菌數分別為1.04×109CFU/g和2.19×108CFU/g，均保持較高的活菌數；兩種保藏溫度下菌體細胞的存活率分別為40.63%和8.67%，結果表明4 ℃貯藏條件下的保存效果優于25 ℃。

3 討 論

本實驗中脫脂乳粉、海藻糖、甘油、谷氨酸鈉對乳酸乳球菌乳脂亞種KLDS4.0326凍干保護效果顯著，這是因為在真空冷凍干燥過程中，乳清蛋白能在菌體外形成蛋白膜，對細胞加以保護，并可以固定凍干的酶類，防止由于細胞壁蛋白質損壞而引起的胞內物質泄漏，而且乳中其他成分（如乳糖等）同樣可以提高菌體的凍干存活率[18]。

目前主要有兩種假說解釋海藻糖穩定生物分子的機理：一種是“水替代”假說，生物體大分子由一層水膜所包圍，這層水膜對維持生物大分子的功能及結構起到至關重要的作用，當生物大分子失去維持其結構和功能特性的水膜時，海藻糖可在生物大分子失水部位以氫鍵的形式連接，形成一層保護膜以代替失去的結構水膜；另一種是“玻璃態”假說，該假說認為通過海藻糖玻璃化轉變的趨勢，導致無定形連續相的形成，在這種結構中分子運動和分子變性反應非常微弱[19-20]。

甘油屬于多元醇類，是一類應用較為普遍的凍干保護劑。由于醇和糖類相似都具有羥基官能團，均能產生“優先水化作用”以及改變體系的玻璃態轉變溫度等，因此在發揮保護效果方面與糖類具有一定共性。此外，甘油具有良好滲透能力，可進入細胞內部，與胞內大分子形成氫鍵，以取代干燥脫除的水分，從而維持蛋白質、碳水化合物及脂肪等大分子活性物質的原有結構。此外，甘油還可起到降低細胞脫水皺縮和緩解復水腫脹的效果[21]。Savini等[22]利用甘油、甘露醇、山梨糖醇及其他添加劑作為凍干保護劑對鼠李糖乳桿菌和乳酸桿菌的冷凍干燥過程進行研究，得出多元醇類作為保護劑提高菌體細胞凍干存活率效果良好，并且甘油的穩定效果最顯著。

單一保護劑實驗結果表明，VC和硫酸錳也能夠增強KLDS4.0326菌體細胞存活率，這是由于VC不僅是碳水化合物，其羥基與磷脂的磷酸基團連接形成氫鍵，從而阻止和限制細胞膜因失水而融合，而且它是一種滲透性物質，可以氫鍵形式或其他方式與膜上的磷脂極性端結合，從而取代水分保護細胞結構的完整性[23]。而硫酸錳在凍干保護劑中作為緩沖鹽，能夠滲透到細胞內部從而調節菌體內部理化平衡，同時還能與保護劑中的其他成分產生聯合作用，從而更好的對凍干菌體起到保護作用[24]。Desmons[25]在乳酸菌凍干機理研究中發現，在脫脂乳和甘油為基礎保護劑的配方中添加量為0.1%硫酸錳后，能夠使嗜酸乳桿菌凍干存活率由83%提高到92%。因此硫酸錳在凍干過程中對乳酸菌起到了重要的保護作用。

在真空冷凍干燥過程中，單一的保護劑不能滿足生產工藝要求，一般使用復合凍干保護劑。復合保護劑中各成分在冷凍干燥中均發揮著各自的作用，同時相互間又具有協同作用，只有各組分在比例和濃度達到協調時，凍干保護劑才具備最佳效果[26]。

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