氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解底物譜研究

唐 潔，曾朝懿，張 慶，史 穎

（西華大學生物工程學院，四川 成都 610039）

氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解底物譜研究

唐 潔，曾朝懿，張 慶，史 穎

（西華大學生物工程學院，四川 成都 610039）

采用富集培養法，從長期受氯氰菊酯農藥污染的果園土壤中，分離篩選得到1 株可降解氯氰菊酯的菌株N-02。經形態、生理生化特征及16S rDNA序列分析，初步鑒定為點狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）。菌株N-02在35 ℃、pH 7.5、氯氰菊酯質量濃度為20 mg/L的LB培養基中培養96 h，對氯氰菊酯的降解率達到62.31%。該菌株N-02對擬除蟲菊酯的降解譜較寬，培養96 h對20 mg/L高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯降解率分別達到40.17%、33.26%和30.45%。

氯氰菊酯；點狀氣單胞菌；生物降解；降解底物譜

氯氰菊酯（cyprmethrin，CP）等擬除蟲菊酯類農藥是目前應用較為廣泛和最有發展前景的殺蟲劑[1]，但其在自然條件下難以降解，長期施用會造成環境中的積累和農產品中的殘留[2]，盡管CP被認為是高效低毒的農藥，但其與人體接觸的相應增加會導致持續毒理學效應，嚴重威脅著人類的生存環境和身體健康；尤其是在果蔬、茶葉和水產品等食品中殘留進入人體所 造成的慢性或亞慢性毒性問題，更不可忽視[3-5]。近年來，農藥的微生物降解研究一直是國內外的研究熱點。隨著人們對生物修復理論的不斷深入，迄今為止，已報道的擬除蟲菊酯類農藥降解菌主要包括細菌、真菌、放線菌等[6-8]，如芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）[9]、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）[10]、克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）[11]、產堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）[12]、米曲霉（Aspergillusoryzae）[13]、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）[14]等。因此，通過篩選獲得更多類型的擬除蟲菊酯類農藥高效降解菌，對擬除蟲菊酯類農藥殘留的生物修復研究和應用具有十分重要的意義。本實驗以CP為靶標農藥，自長期受CP農藥污染的果園土壤中篩選得到一株能高效降解CP的菌株，并對其生理生化和16S rDNA進行了鑒定，同時對其降解底物譜進行了初步研究，以期為擬除蟲菊酯類農藥降解菌資源庫的豐富，及進一步研究擬除蟲菊酯類農藥降解途徑及生物修復提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

從長期受CP農藥污染的果園土壤中，分離篩選得到1株可降解CP的菌株N-02。

Luria-Bertani（LB）液體培養基：酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、去離子水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min；用于菌株降解CP實驗。添加2.0 g/100 mL瓊脂粉為固體培養基；用于CP降解菌N-02的保存及種子液制備。

1.2 試劑

氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯苯菊酯、氟氯氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯標準品（含量均為99.7%） 國家標準物質中心；氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、聯苯菊酯、氟氯氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯原農藥（含量均為96.8%） 南京榮誠化工公司；使用前用無水乙醇溶解配制成工作液，按照所需要濃度添加到培養基中；乙腈（色譜純） 瑞士Adamas公司；TIANamp Bacteria DNA提取試劑盒、TIANamp Fungal DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker 天根生化科技有限公司；10×PCR Buffer、dNTP mixture、Taq聚合酶 大連寶生工程公司；其余均為國產分析純試劑。

1.3 儀器與設備

高速冷凍離心機 Eppendorf公司；SHIMADZU LC20 高效液相色譜儀 日本島津公司；SHA-B水浴恒溫搖床 富華儀器有限公司；PowerPac Basic電泳儀、MyCycler PCR儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.4 降解菌的分離篩選與馴化[15]

取5 g土樣置于50 mL含有CP質量濃度為100 mg/L的LB液體培養基中，在30 ℃、180 r/min富集培養5 d后，取10%轉接至新鮮LB液體培養基中并將CP質量濃度提高1倍，再繼續培養5 d如此連續轉接4 次，直至培養基中CP質量濃度提高到800 mg/L。富集培養結束后，取10%最高富集濃度的培養液離心收集菌體，并轉接到添加含100 mg/L CP的LB固體培養基中。恒溫培養箱中30 ℃，培養48 h后，挑此培養基上的單菌落連續劃線純化3 次，篩選出菌落形態規則、生長速度較快的CP可耐受菌株，降解體系中CP的殘留量通過高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）[16]檢測，空白對照為添加同質量濃度CP未接菌的培養液，按下式計算耐受菌株對CP的降解率，篩選降解率高且穩定的菌株進行傳代、涂布，直至平板培養基上的菌落形態完全一致為止，挑單菌落劃線培養，并用20%甘油于－80℃冷凍保存。

式中：ρ0為空白對照中CP殘留量/（mg/L）；ρ1為降解體系中CP殘留量/（mg/L）。

1.5 菌株的鑒定

菌株N-02生理生化鑒定參照文獻[17]方法進行。菌株16S rDNA序列的測定、系統發育分析及構建系統發育樹參考劉君寒等[18]描述方法進行。

1.6 菌株N-02降解能力測定

將菌株N-02制成菌懸液（OD600nm為1.0）按體積分數5%的接種量分別接種于CP質量濃度為20 mg/L的LB降解體系中（含0.2%吐溫-80），以添加同質量濃度CP未接菌接入相同體積無菌水的培養液作為空白對照，以35 ℃、180 r/min振蕩培養96 h，重復取樣3 次，采用HPLC法[16]分別測定空白對照及菌株N-02降解體系中CP殘留量，計算其降解率，并繪制降解過程中空白對照和菌株N-02降解體系中CP殘留量及菌體生物量（OD600nm）的變化規律。

1.7 對其他擬除蟲菊酯類農藥的降解

將菌株N-02的菌懸液（OD600nm為2.0）以5%接種量接種到分別含20 mg/L高效氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和聯苯菊酯的LB降解體系中（含0.2%的吐溫-80），于35 ℃、180 r/min培養96 h，以不接菌并添加等量無菌生理鹽水的LB作為空白對照，檢測OD600nm和擬除蟲菊酯類農藥降解率。

2 結果與分析

2.1 篩選可降解氯氰菊酯的微生物菌株按1.4節方法篩選出20株可耐受高質量濃度CP的菌株，結果見表1，從環境中篩選得到的菌株經馴化后，降解CP能力各不同，說明有些菌株雖然有良好的環境耐受能力但卻不具備相應的降解能力；其中菌株N-02在LB降解體系中對CP的降解率較好。因此，將菌株N-02作為后續實驗的研究菌株。

表1 不同菌株對氯氰菊酯降解率的影響Table1 Degradation rates of CP by different strains

2.2 菌株N-02的鑒定結果

表2 菌株N-02生理生化特征Table2 Physiological and biochemical characteristics of strain N-02

菌株N-02在LB培養基上呈表面光滑濕潤，乳白色點狀圓形菌落，結合生理生化特征（表2）及16S rDNA基因系統發育分析結果（圖1），將該菌株鑒定為點狀氣單胞菌（Aeromonas punctata），與標準菌株庫中的點狀氣單胞菌標準菌種比對，同源相似性達到99%以上。點狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）廣泛分布于自然界中。目前，該菌屬中嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）被報道可降解毒 死蜱農藥，其對毒死蜱降解率為21%[19]。該菌屬對擬除蟲菊酯類農藥的降解還未見報道，而點狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）N-02是目前首次報道可降解擬除蟲菊酯類農藥的氣單胞菌屬菌株。

圖1 菌株N-02系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain N-02

2.3 點狀氣單胞菌N-02對CP的降解過程

圖2 菌株N-02生長與CP殘留量的關系曲線Fig.2 Relationship between the growth of strain N-02 and CP residue

點狀氣單胞菌N-02生長與降解CP的關系如圖2所示，菌株N-02對CP具有較高的降解能力，菌株N-02的生長曲線和CP的降解曲線相對應。培養時間為12～36 h時，菌株N-02處于其對數生長期，并于36～48 h進入生長穩定期；在菌株迅速生長的同時，CP殘留量的減少速率最快；當菌株N-02生長進入生長衰亡期（48～72 h）時，其對CP的降解能力也逐步減弱；說明菌株N-02生長過程中能分泌作用于CP的降解酶或是將CP吸收至胞內分解使其降解。隨著培養時間的延長，在96 h時菌株N-02對20 mg/L CP降解達到62.31%，其降解效率優于已報道的部分CP降解菌[20]，表明點狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）N-02在未進行降解條件優化的情況下已具備較好地CP降解能力。

2.4 點狀氣單胞菌N-02的降解譜

表3 點狀氣單胞菌N-02對幾種擬除蟲菊酯類農藥的降解Table3 Degradation rates of several pyrethroid pesticides by Aeromonas punctata N-0

點狀氣單胞菌N-02對其他擬除蟲菊酯類農藥的降解結果見表3，點狀氣單胞菌N-02對擬除蟲菊酯類農藥的降解譜較寬，且降解率有一定差異。其中點狀氣單胞菌N-02培養96 h后對高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯降解率分別達到40.17%、33.26%和30.45%，而對氯菊酯、氰戊菊酯和聯苯菊酯的降解能力稍弱。

點狀氣單胞菌N-02對不同擬除蟲菊酯類農藥降解率的差異可能與以下原因有關：1）點狀氣單胞菌N-02對聯苯菊酯的降解效率最低，與其他擬除蟲菊酯類相比，聯苯菊酯在分子結構上最大的差別在于其醇部分3-苯氧基苯基被聯苯取代，取代后降解酶和底物的結合受到了嚴重的空間位阻的阻礙[21]。2）點狀氣單胞菌N-02對高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯的降解速率相對較快但也有差異，其原因在于高效氯氰菊酯、溴氰菊酯和氟氯氰菊酯在分子結構上的差異只是其酸部分不同，分別為二溴乙烯基、二氯乙烯基和2-氯-3,3,3-三氟甲基-乙烯基，說明酸部分取代基的不同將會影響降解酶對菊酯類農藥的降解速率[22]。

3 結 論

通過富集馴化培養法分離得到了氯氰菊酯降解菌N-02，經形態、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定為點狀氣單胞菌（Aeromonas punctata）。以20mg/L CP為靶標農藥，在LB降解體系中研究了點狀氣單胞菌N-02對擬除蟲菊酯類農藥的降解能力。結果表明：菌株N-02的生長曲線和CP的降解曲線相對應；在降解譜實驗中，由于擬除蟲菊酯類農藥結構的差異性，產氣單胞菌株N-02對不同擬除蟲菊酯的降解速率順序為：氯氰菊酯＞高效氯氰菊酯＞溴氰菊酯＞氟氯氰菊酯＞聯苯菊酯＞氰戊菊酯＞氯菊酯。

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Isolation, Identification, Degradation Characteristics of a Bacterial Strain Capable of Degrading Cypermethrin

TANG Jie, ZENG Chao-yi, ZHANG Qing, SHI Ying
(School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

A bacterial strain named N-02 capable of degrading cypermethrin was isolated from long-term cypermethrin contaminated orchard soil by using enrichment culture. Based on the morphology, physio-biochemical characteristics, and 16S rDNA sequence analysis, strain N-02 was identified as Aeromonas punctata. The degradation rate of cypermethrin was 62.31% when the strain were cultured at 35 ℃ for 96 h in LB medium containing 20 mg/L cypermethrin at pH 7.5. A wide degradation spectrum of pyrethroid by strain N-02 was observed, and the degradation rates of β-cypermethrin, deltamethrin and fluoride cypermethrin after 96 h were 40.17%, 33.26% and 30.45%, respectively.

cypermethrin; Aeromonas punctata; degradation characteristics; degradation spectrum

X592

A

1002-6630（2014）11-0160-04

10.7506/spkx1002-6630-201411032

2013-09-29

西華大學重點科研基金項目（Z1310525）；四川省教育廳自然科學一般項 目（14ZB0122）

唐潔（1982—），女，講師，博士，研究方向為食品安全。E-mail：tangjie1225@mail.xhu.edu.cn