芽孢桿菌活性多糖的分離純化及合成基因研究

韓玉竹，劉恩岐，李彥巖，劉麗莎，范 熠，李平蘭,*

（1.徐州工程學(xué)院，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221111；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物科學(xué)系，重慶 402460；4.北京市食品科學(xué)研究院，北京 100162）

芽孢桿菌活性多糖的分離純化及合成基因研究

韓玉竹1,2,3，劉恩岐1，李彥巖2，劉麗莎4，范 熠2，李平蘭2,*

（1.徐州工程學(xué)院，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實驗室，江蘇 徐州 221111；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物科學(xué)系，重慶 402460；4.北京市食品科學(xué)研究院，北京 100162）

選用自行選育的1株活性多糖高產(chǎn)菌株（Bacillus amyloliquefaciens LPL061），經(jīng)醇沉、除蛋白、透析、冷凍干燥從其發(fā)酵上清中分離得到活性多糖粗品，并采用色譜純化技術(shù)進(jìn)一步純化，得到1個中性糖組分（EPS1）和1個酸性糖組分（EPS2）。根據(jù)GeneBank中已報道芽孢桿菌產(chǎn)糖相關(guān)基因設(shè)計引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得解淀粉芽孢桿菌LPL061的5個EPS生物合成相關(guān)基因。對其功能預(yù)測分析表明這些基因主要參與EPS合成過程多糖聚合、糖基轉(zhuǎn)移、糖鏈長度控制以及多糖轉(zhuǎn)運(yùn)和輸出。

解淀粉芽孢桿菌；胞外多糖；分離純化；基因簇

胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是微生物生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的黏液或莢膜多糖；是一種包含有分支結(jié)構(gòu)的，單糖或單糖衍生物的重復(fù)單位組成的長鏈多糖；是具有廣泛生物活性和工藝學(xué)特性的天然大分子物質(zhì)[1]。多糖因具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗感染、抗消化性潰瘍、抗氧化、防衰老、降血糖血脂等多種藥理作用[2]，也因其在低濃度下良好的流變學(xué)特性和乳化特性，具有良好的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性等優(yōu)勢，越來越受到研究人員的重視，并逐漸成為現(xiàn)代生物、醫(yī)藥、食品和化工行業(yè)的研究開發(fā)重點(diǎn)，具有很大的發(fā)展?jié)摿3-4]。

目前醋酸桿菌屬（Acetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptoceus）、明串珠菌屬（Leuonostoc）和乳球菌屬（Lactococcus）等細(xì)菌胞外多糖的研究較多[5]，但大多數(shù)產(chǎn)糖細(xì)菌對生長條件要求苛刻且產(chǎn)糖量低，大大限制了活性EPS 的進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展。因此，選育培養(yǎng)條件簡單粗放、EPS 產(chǎn)量高的菌株是當(dāng)前研究的重要方向，芽孢桿菌（Bacillus sp.）能產(chǎn)生抗逆性的芽孢、生命力頑強(qiáng)、對培養(yǎng)條件要求較低，因此具有產(chǎn)糖能力的益生芽孢桿菌是獲取 EPS 的理想菌株來源。但國內(nèi)外關(guān)于芽孢桿菌EPS的研究較少，EPS的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝及具體成分的功能還不清楚，EPS合成基因簇及代謝調(diào)控鮮有報道，嚴(yán)重限制了芽孢桿菌EPS在產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。

本實驗選用自行選育的高產(chǎn)活性EPS芽孢桿菌菌株LPL061[6]，前期研究已證實所產(chǎn)EPS粗品具有免疫調(diào)節(jié)活性，且具有良好的乳化和流變特性[7]。本研究在此基礎(chǔ)上，對活性EPS粗品進(jìn)行分離純化，制備色譜級的EPS純品，并對EPS合成相關(guān)基因簇的結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行分析。結(jié)果不僅為找到高效快速利用芽孢桿菌多糖的途徑、完善產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝、弄清芽孢桿菌多糖的有效成分和功能的關(guān)系提供依據(jù)，也為探明EPS的合成機(jī)制及對多糖結(jié)構(gòu)的調(diào)控途徑、后續(xù)利用基因工程技術(shù)進(jìn)一步提高EPS產(chǎn)量提供理論依據(jù)，同時也為進(jìn)一步開發(fā)新型食品、飼料添加劑、保健產(chǎn)品提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

胞外多糖高產(chǎn)菌株LPL061分離自康乃馨，由本實驗室分離并保存。該菌株通過形態(tài)觀察、生理生化試驗、16S rDNA同源性序列分析以及部分特異性基因序列分析，鑒定該菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[6]。

選用本實驗前期優(yōu)化后的產(chǎn)糖培養(yǎng)基：蔗糖22 g/L、酵母膏18.4 g/L，pH 7.0；發(fā)酵條件：溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min、接種量3%、發(fā)酵時間24 h，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)4.46 g/L[8]。

1.2 儀器與設(shè)備

TC-512聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）儀 英國TechNet公司；BG-Power 300電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；玻璃離子交換柱（2.6 cm ×20 cm，填裝DEAE-Sepharose Fast Flow）、玻璃凝膠過濾柱（1.6 cm×80 cm，填裝Sepharose CL-6B） 美國Pharmacia公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DHL-A電腦恒流泵、TH-500梯度混合器、BS-100A自動部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌EPS的提取

將芽孢桿菌培養(yǎng)液10 000 r/min離心10 min去除菌體細(xì)胞；取上清液加入3 倍體積無水乙醇，4 ℃醇沉過夜；10 000 r/min離心10 min收集沉淀，用少量去離子水復(fù)溶后，8 000 D透析袋4 ℃透析48 h，每8 h換1 次水，除去乙醇、小分子糖、蛋白質(zhì)、鹽等。真空冷凍干燥后得EPS粗品，避光干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 芽孢桿菌EPS的分級純化

1.3.2.1 DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分級純化

用EPS粗品配制成10 mg/mL溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾后上樣，經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow柱層析，上樣量為7 mL，依次用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.50）和0～1.0 mol/L Tris-HCl-NaCl 緩沖液線性梯度混合洗脫，流速4.0 mL/min，部分收集器收集洗脫液，每管收集8 mL，收集40 管，逐管檢測蛋白質(zhì)含量（紫外A280nm）和多糖含量（苯酚-硫酸法A490nm），按檢測值分別合并收集單一峰組分，去離子水透析、冷凍干燥。

1.3.2.2 凝膠色譜層析

將DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分級純化后凍干的樣品復(fù)溶，配制成10 mg/mL溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾后上樣，0.05 mol/L NaCl洗脫，流速30 mL/h、12 min/管，自動部分收集器收集洗脫液。逐管檢測蛋白質(zhì)含量（紫外A280nm）和多糖含量（苯酚-硫酸法A490nm），按檢測值分別合并收集單一峰組分，去離子水透析、冷凍干燥[9]。

1.3.3 多糖純度測定

1.3.3.1 紫外掃描

將EPS配成0.1 mg/mL的溶液，以去離子水為空白對照，用紫外-可見分光光度計在波長200～580 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長掃描，檢測是否有蛋白質(zhì)（280 nm）和核酸（260 nm）等雜質(zhì)吸收峰。

1.3.3.2 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法

利用K-501高效液相色譜、KS-805 Shodex糖柱、示差檢測器，在柱溫60 ℃、流速1.0 mL/min、0.1 mol/L NaNO3作流動相、樣品質(zhì)量濃度5.0 mg/mL、進(jìn)樣量 10 μL、進(jìn)樣速率15 min/個、進(jìn)樣間隔10 min的條件下檢測。

1.3.3.3 掃描電鏡觀察

取適量芽孢桿菌EPS樣品黏著于樣品臺上，置真空濺射儀內(nèi)鍍導(dǎo)電層，電子槍加速電壓為15kV，EPS粗品和分級后的純品（EPS1、EPS2）進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.3.4 EPS聚合及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的克隆

EPS合成相關(guān)基因簇在芽孢桿菌種屬間存在較大差異，但已報道的解淀粉芽孢桿菌全基因組序列，與多糖聚合輸出相關(guān)的蛋白具有較高的保守性，因此根據(jù)GenBank中已報道的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens DSM 7，GenBank序列號：NC_014551.1）全基因組序列信息，利用Primer Premier 5.0設(shè)計多糖重復(fù)單元轉(zhuǎn)運(yùn)子（polysaccharide transporter）等引物見表1 。

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表1 引物列表Table1 List of primers

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：Taq Mix 12.5 μL、dd H2O 10.5 μL、上下游引物（表1）各0.5 μL、模板1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、退火45 s、72 ℃延伸2 min，共30 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.3.5 生物信息學(xué)分析

PCR產(chǎn)物電泳檢測后送至金唯智生物科技有限公司（北京）測序，獲得的序列相似性比較采用NCBI的BLAST軟件在線分析(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)，核酸序列分析和翻譯采用BioEdit Software Version 7.0.5.2軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌LPL061胞外多糖的分離純化

圖1 芽孢桿菌多糖的形態(tài)Fig.1 Crude EPS and two fractions

由圖1可知，芽孢桿菌上清液經(jīng)醇沉透析后獲得粗多糖呈淡棕色、片狀、水溶性良好。

多糖經(jīng)過透析去掉部分雜質(zhì)后，要想得到高純度的單一多糖組分，需進(jìn)一步的分級純化。多糖分級純化的方法很多，如柱層析法、季銨鹽沉淀法、超濾法等，考慮到EPS自身特點(diǎn)及后續(xù)功能應(yīng)用，純化時一般選用柱層析法，本實驗芽孢桿菌EPS純化經(jīng)過初試后，最終選用纖維素陰離子交換柱層析法和凝膠柱層析法，效果較好。

2.1.1 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱純化

本實驗首先選用 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱（Tris-HCl和Tris-HCl-NaCl線性梯度混合洗脫）對EPS進(jìn)行分離純化，結(jié)果見圖2。

圖2 芽孢桿菌EPS的DEAE-Sepharose Fast Flow洗脫曲線Fig.2 Anion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose fast flow of crude EPS

在DEAE-Sepharose Fast Flow洗脫時，EPS2的洗脫曲線與蛋白質(zhì)洗脫曲線有部分交叉，多糖峰與蛋白峰也并不完全重疊，表明EPS2紫外吸收檢測到的蛋白質(zhì)并不與多糖綴合，通過不收集與蛋白峰重疊的多糖收集管，可減少EPS2中蛋白質(zhì)含量。將兩個組分按洗脫曲線分別收集，對水透析48 h后冷凍干燥，得到一步純化的中性糖（EPS1：收集6～10 管）和酸性糖（EPS2：收集19～23管，23 管后因為蛋白含量太高未收集）。

EPS2的含量較高，是EPS1的8.7倍。EPS1呈純白色，EPS2呈深棕色（圖1B），兩者均呈片狀或粉末狀，水溶性良好。

2.1.2 Sepharose CL-6B柱層析

本實驗利用SepharoseCL-6B凝膠柱對EPS各組分進(jìn)一步分離純化，將從DEAE-Sepharose Fast Flow收集到的EPS1和EPS2分別配制成多糖溶液，分別利用SepharoseCL-6B凝膠柱層析進(jìn)一步純化。EPS1和EPS2的凝膠柱層析洗脫曲線見圖3。

圖3 芽孢桿菌EPS1（A）和EPS2（B）的Sepharose CL-6B 洗脫曲線Fig.3 Gel permeation chromatography on Sepharose CL-6B of EPS1 (A) and EPS2 (B)

由圖3可知，EPS1和EPS2的洗脫曲線均呈現(xiàn)對稱的單一峰，說明它們是分子質(zhì)量均一的單一組分，不含有其他糖類。采用上述陰離子交換柱和凝膠柱層析條件，反復(fù)收集EPS1和EPS2，用于純度鑒定及后續(xù)的結(jié)構(gòu)分析和功能驗證。

2.2 純度檢測

2.2.1 紫外掃描

圖4 芽孢桿菌EPS1（A）和EPS2（B）的紫外光譜圖Fig.4 Ultraviolet spectra of EPS1 (A) and EPS2 (B)

為了進(jìn)一步證明經(jīng) Sepharose CL-6B 柱層析純化的兩個EPS組分是否含有核酸和蛋白質(zhì)，對其進(jìn)行紫外全波長掃描，掃描結(jié)果見圖4。紫外全波長掃描結(jié)果顯示，EPS1和EPS2在260 nm和280 nm波長處無吸收峰，表明不含核酸和蛋白質(zhì)，為均一的單一組分。

2.2.2 HPLC檢測

與填裝凝膠柱相比，配有糖柱的HPLC具有更高的分辨率，可驗證上述收集的多糖峰是否是單一組分，組分單一純度較好時HPLC洗脫曲線呈現(xiàn)單一對稱峰。芽孢桿菌EPS1和EPS2的HPLC檢測顯示為單一且對稱的從基線到基線的標(biāo)準(zhǔn)峰，表示EPS1和EPS2是純度較好且分子質(zhì)量均一的多糖組分。

2.2.3 掃描電鏡觀察

掃描電子顯微鏡被認(rèn)為是研究大分子表面形態(tài)，探明其物理特性的重要工具[10]，目前為止，還沒有利用電鏡對芽孢桿菌胞外多糖的研究。EPS粗品和分級后的純品（EPS1、EPS2）的掃描電鏡圖如圖5所示。

圖5 芽孢桿菌多糖EPSs掃描電鏡圖（×1500）Fig.5 Scanning electron micrographs of crude EPS and two fractions (×1500)

由圖5可知，EPS粗品結(jié)構(gòu)致密結(jié)實，孔隙均勻分布，該形態(tài)與Wang Yanping等[10]報道的Lactobacillus plantarum KF5所產(chǎn)胞外多糖結(jié)構(gòu)類似，此種表面形態(tài)的多糖增塑性較強(qiáng)，具有作為增塑材料開發(fā)前景。EPS1呈均勻顆粒組成的致密的繩索狀結(jié)構(gòu)，可能是由于許多分子或分子集團(tuán)聚集成束所致。EPS2聚集體呈松散疏松片狀，表面孔隙多且密，該種疏松多孔的形態(tài)具有較好的持水力，在食品工業(yè)中可作為 保水材料開發(fā)[11]。

2.3 EPS聚合及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因克隆及測序

EPS生物合成通常由一大簇基因編碼，基因 簇常單向排列，轉(zhuǎn)錄形成單個多mRNA[12]。以提取的解淀粉芽孢桿菌LPL061基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增與多糖合成輸出及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗后如圖6所示。

圖6 解淀粉芽孢桿菌LPL061產(chǎn)糖基因片段PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of eps gene cluster from Bacillus amyloliquefaciens LPL061

2.3.1 EPS A基因片段的克隆與測定

由EPS A特異性引物擴(kuò)增出546bp的片段，編碼 177 AA的蛋白質(zhì)，功能為酪氨酸蛋白激酶EPS B的調(diào)節(jié)蛋白。經(jīng)過BLAST比對，該基因序列與來自解淀粉芽孢桿菌植物亞種UCMB5036的EPS A（YP 007498753.1）98%同源；與解淀粉芽孢桿菌Y2的EPS A（CP003332.1）98%同源；與解淀粉芽孢桿菌XH7的EPS A（CP 002927.1）97%同源；與解淀粉芽孢桿菌TA208的EPS A（YP 005543320.1）的同源性為98%。

BLASTx結(jié)果顯示，EPS A屬于Wzz基因簇中的基因片段，其中Wzz是一類Etk-like酪氨酸激酶[13]，在多糖重復(fù)單元跨膜及聚合時作為輔助蛋白控制糖鏈長度。一種假設(shè)認(rèn)為Wzz相當(dāng)于分子計時器，控制Wzy活性，使其在聚合反應(yīng)中平衡，另外一種假設(shè)認(rèn)為起分子尺寸作用，控制Wzy與輔助蛋白狀態(tài)控制糖鏈長度[14]。

2.3.2 EPS B基因片段的克隆與測定

由EPS B特異性引物擴(kuò) 增出522bp的片段，編碼170 AA的蛋白質(zhì)，其功能為酪氨酸蛋白激酶。酪氨酸激酶（tyrosine protein kinase，TPK）是一種分布在細(xì)胞質(zhì)膜表面的酶偶聯(lián)型受體，配體與不同受體TPK結(jié)合后，受體自身發(fā)生二聚化或結(jié)構(gòu)重排，并進(jìn)一步使受體胞內(nèi)區(qū)特異的酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化或交叉磷酸化，從而激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它們在信號由胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)的過程中發(fā)揮重要的作用[15]。

經(jīng)過BLASTx分析，該基因片段與解淀粉芽孢桿菌AS43.3（YP 007187922.1）98%同源；與解淀粉芽孢桿菌CAU B946（YP 005132107.1）同源性為89%；與來自解淀粉芽孢桿菌植物亞種UCMB5036的EPS B (YP 007498753.1）99%同源。EPS B基因也是一種鏈長決定基因，輔助蛋白控制糖鏈的長度，參與糖重復(fù)單元的跨膜運(yùn)輸。

2.3.3 EPS C基因片段的克隆與測定

測序得到的基因序列如下，鏈長為1 685bp，共編碼561-AA的蛋白質(zhì)，功能為UDP-葡萄糖異構(gòu)酶。經(jīng)過BLASTx比對，該基因片段與解淀粉芽孢桿菌LL3（NC_017190.1）的EPS C 93%同源；與解淀粉芽孢桿菌DSM（NC_014551.1）的EPS C同源性為93%；與解淀粉芽孢桿菌XH7（NC_017191.1）的同源性為93%；與解淀粉芽孢桿菌TA208（NC_017188.1）的EPS C同源性為93%。

UDP-葡萄糖異構(gòu)酶屬于多糖重復(fù)單元轉(zhuǎn)運(yùn)子合成的Wzx基因序列[20]，能夠引發(fā)第一個葡萄糖轉(zhuǎn)移到脂類載體上，參與多糖重復(fù)單元在細(xì)胞內(nèi)的聚合，通過此過程控制多糖鏈的合成，目前芽孢桿菌的EPS輸出機(jī)制并不十分清楚，有文獻(xiàn)報道Wzx是一類膜整合蛋白家族，具有翻轉(zhuǎn)酶（flippase）功能，將單糖單元從細(xì)胞膜的胞質(zhì)面翻轉(zhuǎn)到外周質(zhì)空間，Wzx缺失菌株會使O-unit中間產(chǎn)物在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)積累[16]。

2.3.4 EPS E基因片段的克隆與測定

EPS E特異性引物擴(kuò)增到一個長約643bp片段，編碼1個187-AA的蛋白質(zhì)，功能為糖基轉(zhuǎn)移酶。經(jīng)過BLASTx比對，該基因片段與來自解淀粉芽孢桿菌植物亞種M27的EPS E（ZP16169290.1）100%同源；與來自解淀粉芽孢桿菌植物亞種CAUB946的EPS E（YP00513191.1）100%同源；這類蛋白參與多糖合成中的糖基轉(zhuǎn)移過程。2.3.5 EPS G基因片段的克隆與測定

EPS G特異性引物擴(kuò)增到一個長約907bp片段，編碼一個302-AA的蛋白，功能為控制跨膜蛋白的合成。經(jīng)過BLASTx比對，該基因片段與解淀粉芽孢桿菌植物亞種CAU B 946 （NC_016784.1）的產(chǎn)糖基因序列97%同源；與解淀粉芽孢桿菌I45（NC_020272.1）的產(chǎn)糖基因片段的同源性為98%；與解淀粉芽孢桿菌UCMB5036（NC_020410.1）的同源性為98%；多糖跨膜蛋白參與多糖鏈的運(yùn)輸，將合成的多糖從細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，在多糖重復(fù)單元跨膜及聚合時作為輔助蛋白控制糖鏈長度。

3 討 論

芽孢桿菌內(nèi)生芽孢、繁殖能力強(qiáng)，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，又是自然界中廣泛存在的非致病細(xì)菌，對人畜無害，不污染環(huán)境。本實驗室的成員在前期工作中篩選到1株高產(chǎn)活性多糖的芽孢桿菌菌株[6]，芽孢菌株LPL061對環(huán)境要求不嚴(yán)，在貧瘠的培養(yǎng)基、很寬的溫度范圍（10～50℃）、pH值（3～10）、10%NaCl均能正常生長；對其產(chǎn)糖條件進(jìn)行了優(yōu)化[8]，確定了EPS的提取方法，提取的粗EPS已證實具有良好的乳化和流變特性，及免疫調(diào)節(jié)活性[7]，具有發(fā)展為藥物或保健產(chǎn)品的潛力，為開展芽孢桿菌活性EPS合成基因簇及EPS分級純化以備后續(xù)研究分子特性打下堅實基礎(chǔ)。

本實驗經(jīng)過離心、醇沉、除蛋白、透析、DEAESepharose Fast Flow陰離子柱層析，芽孢菌株LPL061的培養(yǎng)基上清中分離到兩組分胞外多糖（EPS1和EPS2），EPS1和EPS2在Sepharose CL-6B凝膠柱上顯示均一組分，結(jié)合紫外光譜、高效液相分析結(jié)果表明，EPS1和EPS2為不含蛋白質(zhì)的多糖類物質(zhì)。EPS2的含量較大，是EPS1的8.7倍。EPS粗品為淡棕色，分級純化后的EPS1呈純白色，EPS2呈深棕色，均呈片狀或粉末狀，水溶性良好。電鏡掃描結(jié)果表明，EPS粗品結(jié)構(gòu)致密結(jié)實，孔隙均勻分布，該形態(tài)與Wang Yanping等[10]報道的Lactobacillus plantarum KF5所產(chǎn)胞外多糖結(jié)構(gòu)類似，此種表面形態(tài)的多糖增塑性較強(qiáng)，具有作為增塑材料開發(fā)前景。EPS1呈均勻顆粒組成的致密的繩索狀結(jié)構(gòu)，可能是由于許多分子或分子集團(tuán)聚集成束所致。EPS2聚集體呈松散疏松片狀，表面孔隙多其密，該種疏松多孔的形態(tài)具有較好的持水力，在食品工業(yè)中可作為保水材料開發(fā)[11]。本實驗結(jié)果可為后續(xù)芽孢桿菌多糖的基本特性研究及多糖的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考依據(jù)。

如何提高胞外多糖產(chǎn)量一直是研究的熱點(diǎn)，利用基因工程調(diào)控代謝合成途徑也是實現(xiàn)該目的的重要手段。隨著許多全基因組序列的相繼測定，EPS合成基因簇也被逐步解析，如嗜熱鏈球菌Sfi6、鼠李糖乳桿菌ATCC9595等[16-19]。不同種屬菌株產(chǎn)生的EPS結(jié)構(gòu)多種多樣，但由重復(fù)單元組成多糖的生物合成途徑卻很類似，即通過糖基轉(zhuǎn)移酶將單糖從糖核苷酸順序性轉(zhuǎn)移到脂類載體上合成重復(fù)單元，隨后在蛋白作用下聚合及輸出形成多糖[20]。EPS的生物合成是在多糖基因簇中的調(diào)節(jié)基因控制下，由多基因共同作用完成，大多數(shù)細(xì)菌EPS基因簇均由調(diào)控、鏈長決定、重復(fù)單元合成和聚合輸出4個區(qū)域構(gòu)成，但不同種屬的EPS合成基因差異很大[21]。本實驗根據(jù)GenBank中已報道的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens DSM 7，GenBank序列號：NC_014551.1) 全基因組序列信息，利用Primer Premier 5.0設(shè)計產(chǎn)糖相關(guān)基因的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得解淀粉芽孢桿菌LPL061的5個EPS生物合成相關(guān)基因。對各基因功能預(yù)測分析表明這些基因主要參與EPS合成過程多糖聚合、糖基轉(zhuǎn)移、糖鏈長度控制以及多糖轉(zhuǎn)運(yùn)和輸出。本實驗可為解淀粉芽孢桿菌胞外多糖生物合成基因的結(jié)構(gòu)和功能的闡明提供信息，后續(xù)可以利用同源交換，對相關(guān)基因進(jìn)行基因阻斷實驗，驗證基因的功能，利用基因工程技術(shù)提高胞外多糖的產(chǎn)量，同時也為通過改變胞外多糖的結(jié)構(gòu)組成及分子量來改善EPS的工藝特性提供依據(jù)。由于芽孢桿菌結(jié)構(gòu)及基因簇信息報道較少，芽孢桿菌LPL061糖基轉(zhuǎn)移酶基因的排列順序與多糖一級結(jié)構(gòu)的對應(yīng)關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究證實，利用高通量測序等手段獲取菌株LPL061的完整EPS基因簇也會對解析芽孢桿菌產(chǎn)糖機(jī)制及發(fā)揮益生功能提供幫助。

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Separation and Purification of Exopolysaccharides from Bacillus amyloliquefaciens and Bioinformatic Analysis of Exopolysaccharide Biosynthesis

HAN Yu-zhu1,2,3, LIU En-qi1, LI Yan-yan2, LIU Li-sha4, FAN Yi2, LI Ping-lan2,*
(1. Jiangsu Key Laboratory of Food Resource Development and Quality Safety, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221111, China; 2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 3. Department of Animal Science, Rongchang Campus, Southwest University, Chongqing 402460, China; 4. Beijing Academy of Food Sciences, Beijing 100162, China)

In this paper, lyophilized crude exopolysaccharides (EPS) were isolated by ethanol precipitation, deproteination and dialysis from the cell-free culture supernatant of Bacillus amyloliquefaciens LPL061, demonstrated to be able to produce high amounts of EPS, and fractionated into two peaks by anion exchange chromatography on DEAE-Sepharose fast flow column, named as EPS1 and EPS2. The high yield and favorable proportion of EPS1 and EPS2 were obtained in optimized medium (pH 7.0) containing 22 g/L sucrose and 18.4 g/L yeast extract when B. amyloliquefaciens LPL061 was cultivated at 28 ℃ at 220 r/min for 24 h. The specific primers of EPS A, EPS B, EPS C, EPS E and EPS G were designed according to the conservative gene sequences of B. amyloliquefaciens DSM 7 from GenBank (accession number: NC_014551.1). The bioinformatic alignment and analysis from GeneBank database searching showed that the 5 genes had high homology with the EPS biosynthetic genes of Bacillus amyloliquefaciens reported in NCBI, respectively. We acquired 5 gene sequences such as repeat unit transporter (Wzx). Functional prediction analysis of open reading frames indicated that these 5 genes were involved mainly in polysaccharide chain length determination, polymerization and export.

Bacillus amyloliquefaciens; exopolysaccharides; isolation and purification; gene cluster

TS201.3

A

1002-6630（2014）11-0179-06

10.7506/spkx1002-6630-201411036

2014-01-08

江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實驗室資助項目（SPKF201301）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（2011303014-4）；國家自然科學(xué)基金面上項目（31271827；31101760）；北京市自然科學(xué)基金項目（5122018）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目（XDJK2011C034）；西南大學(xué)博士基金項目（2013Bsr06）

韓玉竹（1982—），女，講師，博士，研究方向為微生物活性代謝產(chǎn)物。E-mail：63214419@qq.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail： lipinglan@cau.edu.cn