重組酶FLP在弱氧化葡糖桿菌中的表達及應用

劉靜文，李天明，杜紅燕，馮惠勇*

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050000）

重組酶FLP在弱氧化葡糖桿菌中的表達及應用

劉靜文，李天明，杜紅燕，馮惠勇*

（河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050000）

本實驗借助寬宿主載體pBBR1MCS-5，構建在弱氧化葡糖桿菌（Gluconobacter suboxydans）中表達FLP重組酶的表達載體，轉化弱氧化葡糖桿菌，獲得陽性轉化子；采用兩步法RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）驗證，結果表明：flp基因在宿主細胞中轉錄表達；將pBBR1MCS-psldh-flp重組質粒轉化至帶有四環抗性的突變菌株JGDH－，PCR驗證表明帶有FTR位點的抗性標記得到有效刪除。重組酶FLP在Gluconobacter suboxydans的表達提供了一種循環使用選擇標記基因進行多個位點基因敲除或置換的方法。

弱氧化葡糖桿菌；FLP/FRT；位點特異性重組；啟動子；基因敲除

重組酶近年來成為非常普及的現代分子生物學理論研究與基因工程技術開發的重要工具，最常用的重組酶包括細菌來源的Cre和酵母來源的FLP[1]。FLP重組酶（flippase recombination enzyme）又稱轉位蛋白，其基因來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2μ質粒，編碼422個氨基酸，是一個大小約48kD的多肽單體蛋白。該蛋白作用于34bp的FRT位點（flippaserecognition targets）[2]，根據FRT識別位點的位置與方向，FLP重組酶以特定方式結合到FRT兩端的對稱序列上，誘使FRT位點產生彎曲、斷裂，從而引發完成FRT位點間基因的刪除、倒置、交換等修飾，實現DNA序列的刪除、倒位、插入和重排等反應，因此被廣泛應用于微生物、植物及動物的基因組的修飾[2-9]。弱氧化葡糖桿菌（Gluconobacter suboxydans）具有豐富的周知空間氧化還原酶類，如葡萄糖脫氫酶[10]、山梨醇脫氫酶[11]，甘油脫氫酶[12]等，可催化葡萄糖、山梨醇、甘油等生成葡萄糖酸、山梨糖和二氫丙酮等化工產品，是一類重要的工業菌[13-16]，對其進行菌種改造，獲得可產業化顯示的遺傳資源具有重要意義。但是由于其遺傳背景知識相對缺乏、有多樣的內源性質粒和廣泛的抗性譜等因素，給遺傳實驗操作帶來很大的難度。在Gluconobacter suboxydans遺傳操作體系以及對其基因組DNA進行修飾改造的技術手段等方面的研究，國內外還基本處于空白。本實驗借助寬宿主載體pBBR1MCS-5，先獲得插入終止子的重組質粒pBBR1MCS-5-ter，在此基礎上，再構建不同來源啟動子調控的f p的表達載體。

通過重組酶FLP在Gluconobacter suboxydans中的轉錄表達，同時引發FRT-FLP位點特異性重組，可以有效地去除葡萄糖脫氫酶缺失突變菌株的四環素抗性標記，提供了一種循環使用選擇標記基因進行多個位點基因敲除或置換的方法[9,17-21]，為快速、高效、方便、穩定地進行基因的修飾改造提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Trizol 美國Invitrogen公司；焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC） 生工生物工程（上海）股份有限公司；EasyScript反轉錄試劑盒、FastPfu DNA聚合酶、Hifi DNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇等常規試劑均為國產分析純。

培養基：2 g/100 mL葡萄糖、1.0 g/100 mL玉米漿、0.1 g/100 mL KH2PO4、0.4 g/100 mL硫酸銨、0.02 g/100 mL硫酸鎂、0.01 g/100 mL碳酸鈣，pH值調制6.4～6.7，121 ℃滅菌20 min；如需固體培養基，加入2.0%的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

實驗所用菌株，質粒以及相關引物的詳細信息如表1所示。

1.2 儀器與設備

Bio-Rad My CyclerTM梯度PCR儀、Bio-Rad Gel DOCXR System凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；Gene Pulser XcellTM電轉儀 美國Bio-Rad公司；Neofuge23R冷凍離心機 河南兄弟儀器設備有限公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一廠；HWS型培養箱 寧波江南儀器廠；DZKW-D水浴鍋 河北黃驊航天儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒pBBR1MCS-5-ter寬宿主載體的構建

以G. suboxydans基因組DNA為模板，利用PCR擴增出具有終止子作用的ter基因片段，PCR反應程序為：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，退火（Tm值不同）30s，72 ℃、25 s，30 個循環；72 ℃延伸10 min。將目的基因ter和載體pBBR1MCS-5進行Hind Ⅲ和SalⅠ雙酶切，電泳驗證后回收，T4連接酶反應過夜，熱激轉化至大腸桿菌DH5α中，挑取單菌落，將轉化子經菌液PCR驗證正確后保菌備用，并由Invitrogen公司測序。

1.3.2 f p基因片段與3種啟動子融合的overlapping PCR

以pEASY-flp、pEASY-sldh、pBBR1MCS-5為模板，tufB利用長引物融合，均用PCR分別擴增出flp、psldh、ptufB和慶大（pgen）基因片段，得到的片段作為下一次PCR的反應模板，PCR反應程序參考1.3.1節。再利用重疊延伸PCR技術，選用正確引物，調整兩個模版的物質的量比，分別將sldh、tufB、gen基因啟動子片段分別作為模版1，flp基因作為模版2，二者進行搭接，克隆出帶有3種啟動子的f p基因片段，PCR反應程序參考1.3.1節。

1.3.3 f p基因重組表達質粒的構建

將目的基因和測序正確的載體pBBR1MCS-5-ter進行BamHⅠ和Pst Ⅰ雙酶切，37 ℃反應過夜，酶切產物經電泳驗證正確后使用超薄產物純化試劑盒回收后，將酶切后的融合了啟動子的flp基因分別與載體用T4連接酶16 ℃過夜連接，后將重組質粒轉入大腸桿菌DH5α中，挑取單菌落，將轉化子經菌液PCR驗證正確后保菌備用，并由Invitrogen公司測序。

表1 本實驗中采用的菌株、質粒和寡核苷酸Table1 Strains, plasmids, and oligonucleotides used in this study

1.3.4 弱氧化葡糖桿菌的轉化及轉化子驗證

將構建成功并測序正確的載體pBBR1MCS-psldh-flp、pBBR1MCS-ptufB-flp、pBBR1MCS-pgen-flp利用電穿孔轉化法分別轉入到受體細胞弱氧化醋酸桿菌中，具體方法：將10 μL打靶片段和50 μL感受態細胞輕輕混合，冰浴5 min，轉入事先冷卻的電擊杯；設置不同的電壓分別為1.25、1.5、1.8 kV/cm，固定電阻為250 Ω，電容為25 μF，電擊；電擊完后立刻向電擊杯中加入1 mL事先冷卻的種子培養基，沖洗轉移至離心管中，30 ℃、200 r/min振蕩培養5 h，收集細胞，涂于平板中。優化轉化條件，待48～72 h后出現轉化子，按照菌落PCR的方法進行驗證。

1.3.5 RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）驗證目的基因的轉錄表達

將3種載體轉入弱氧化葡糖桿菌的轉化子擴培24～48 h后，采取Trizol試劑一步法提取總RNA，具體操作參照Trizol試劑說明書。

利用北京全式金公司的EasyScript反轉錄試劑盒，兩步法進行PCR擴增。首先合成cDNA，按照說明書體系，輕輕混勻試劑，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min，然后85 ℃加熱5 min，使EasyScript RT失活。取2～4 μL反轉錄產生的cDNA作為PCR模版，進行PCR擴增，PCR反應過程參考1.3.1節。

1.3.6 去除JGDH－菌株的抗性基因

JGDH－菌是野生型中編碼GDH的基因gdh被兩端帶有FRT識別位點的四環素表達盒所替代的突變菌株。參見1.3.4節的轉化方法，將pBBR1MCS-psldh-flp重組質粒轉入受體細胞JGDH－菌中，孵育培養10h，涂布于固體培養基上，待出現菌落后，挑取菌落分別培養在含有四環素及不含四環素的培養基的微孔板中，測定菌液OD600nm值，根據生長情況篩選除去抗性的菌株。再通過菌落PCR進行驗證四環抗性的去除。

2 結果與分析

2.1 終止子ter基因擴增

圖1 1 terter基因PCR產物PCRFig.1 PCR amplified products of ter gene

實驗以G. suboxydans基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得有終止子作用的ter基因片段，如圖1所示，目的條帶大小與已知序列相同，說明終止基因ter擴增成功。

2.2 重組質粒pBBR1MCS-5-ter的構建

將目的基因ter和載體pBBR1MCS-5進行Hind Ⅲ和Sal Ⅰ雙酶切，電泳驗證后回收，經過酶切連接轉化，挑選陽性轉化子，進行質粒PCR驗證，驗證結果如圖2所示，條帶位置與上述PCR擴增片段大小一致，說明目的基因ter已插入載體pBBR1MCS-5中，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，比對測序結果正確，說明構建成功。

圖2 質粒PC Rtteerr基因的插入Fig.2 PCR validation of insertion of the ter gene

2.3 重疊延伸PCR融合啟動子與f p基因

圖3 3種啟動子基因與f pf p基因PCR產物PCRFig.3 PCR amplified products of three promoter genes and f p gene

實驗采用重疊延伸PCR技術，選擇相應的引物和模版，tufB利用長引物融合，另外分別擴增出flp、psldh、ptufB和pgen基因片段，如圖3所示。其中，啟動子psldh基因片段大小為191 bp，啟動子pgen基因大小為276 bp，不同引物擴增的flp基因大小為1 300 bp左右，與已知序列大小相同。

以上一步PCR擴增的結果為模版，等量混勻后，利用Hifi DNA聚合酶分別用各自引物進行PCR搭接，獲得各自的目的片段，如圖4所示。

圖4 3種啟動子與ff pp基因PCR搭接結果Fig.4 PCR overlap products from three promoter genes and f p gene

2.4 融合啟動子基因psldh、ptufB、pgen的flp基因重組質粒的構建

將搭接成功的3種基因片段利用超薄瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與空質粒pBBR1MCS-5-ter經過酶切連接轉化，挑選陽性轉化子，提質粒后分別利用引物SLDHF/FLPR、TUFBF/FLPR、GENF/FLPR驗證構建好的載體pBBR1MCS-psldh-flp、pBBR1MCS-ptufB-flp、pBBR1MCS-pgen-flp，驗證結果如圖5所示，條帶位置與設計一致，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，比對測序結果正確，說明構建成功。

圖5 3種質粒的PCR驗證Fig.5 PCR validation of three plasmids

2.5 flp基因在弱氧化葡糖桿菌中的轉錄表達及RT-PCR驗證

分別將成功構建的質粒pBBR1MCS-psldh-flp、pBBR1MCS-ptufB-f p、pBBR1MCS-pgen-f p利用電轉化轉入到目的菌株弱氧化葡糖桿菌中，經過48～72h后長出單菌落。菌落PCR驗證篩選出陽性轉化子。為驗證3種啟動子控制的flp基因在宿主中的轉錄表達情況，利用Trizol法提取含有3種弱氧化醋酸桿菌陽性克隆的RNA，利用電泳驗證所提RNA的完整性，28S和18S條帶清晰可見，進行RT-PCR結果如圖6所示，PCR所得片段分別與陽性對照位置相同，并且弱氧化葡糖桿菌本身RNA并沒有擴增相應條帶，說明sldh、tufB、gen啟動子都可被弱氧化葡糖桿菌識別，有效啟動f p基因的轉錄表達。

圖6 含3種質粒的弱氧化葡糖桿菌RT-PCR驗證Fig.6 RT-PCR validation of Gluconobacter suboxydans with three plasmids

2.6 利用flp在弱氧化葡糖桿菌的表達去除JGDH－菌株的抗性基因

將pBBR1MCS-psldh-flp重組質粒轉入受體細胞JGDH－菌中。由于四環素抗性基因兩端的FRT位點同向，FLP在JGDH-菌中表達后，將FRT位點間的四環素抗性基因刪除，FLP/FRT刪除JGDH-菌株的四環抗性基因的作用機理，如圖7所示。

圖7 FLP/FRT的作用機理Fig.7 The action mechanism of FLP/FRT

挑取轉化子單菌落擴培，將其分別接入無抗培養基和含四環抗性的培養基中，培養一段時間后，測定菌液OD值，該菌在無四環抗性培養基中生長，在四環抗性培養基中不生長。挑取上述已初步驗證的無抗性基因的單菌落，利用引物TETYF/TETYR進行菌落PCR驗證，結果如圖8所示，只有沒有轉化pBB1MCS-psldh-flp的JGDH－菌株有1 100 bp左右的條帶（四環抗性基因），進一步說明pBB1MCS-psldh-flp轉入JGDH－菌株后，FLP有效表達，在FLP/FRT重組系統作用下四環抗性標記被刪除。并通過多次在無抗性的培養基上傳代，去除pBBR1MCS-psldh-flp質粒，得到穩定的無任何抗性標記的JGDH－菌株。

圖8 抗性標記去除的PCR驗證Fig.8 PCR validation of the removal of resistance markers

3 討 論

寬宿主載體pBBR1MCS-5可在多種宿主中克隆表達，具有其特有的優越性；而目前Gluconobacter suboxydans適用基因操作的工具有限，肖蘇珂等[22]發現該質粒在Gluconobacter suboxydans中能夠很好地克隆表達。本實驗利用該質粒的優點，同時為其插入具有終止作用的ter基因，構建了適用于Gluconobacter suboxydans的表達載體pBBR1MCS-5-ter。

通過重疊延伸PCR技術分別獲得含有sldh、tufB、gen基因啟動子片段的flp基因，與改造的寬宿主載體pBBR1MCS-5-ter連接、轉化獲得重組質粒，再電轉化至弱氧化葡糖桿菌中。有研究發現[18]，經分離得到多個具有啟動子功能的DNA片段上具有典型的細菌啟動子保守序列（－35和－10區），被命名為Lhp啟動子，該啟動子可被Gluconobacter suboxydans識別；本實驗受控于sldh、tufB、gen啟動子的重組質?？杀籊luconobacter suboxydans識別，并都能有效啟動flp基因的轉錄表達，拓展了Gluconobacter suboxydans遺傳操作系統的調控原件。

FLP是來自釀酒酵母2μ質粒編碼的特異性重組酶，蓋穎[23]、劉香利[24]、單曉昳[9]等已發現FLP重組酶通過FLP/FRT重組系統在原核大腸桿菌及植物中能有效識別并刪除重組位點FRT之間的基因。本實驗借助構建的Gluconobacter suboxydans的表達載體，通過FLP重組酶在Gluconobacter suboxydans中轉錄表達，可以將葡萄糖脫氫酶缺失突變菌株的四環素抗性標記去除，這樣既能夠改善該系統去除選擇標記的效率和穩定性，同時能夠循環使用選擇標記基因進行敲除或置換多個位點基因，為快速、高效、方便、穩定地進行Gluconobacter suboxydans基因的修飾提供了有效工具，同時為Gluconobacter suboxydans基因改造方面的進一步研究提供參考，這方面的研究還未見報道。

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Expression and Application of Recombinase FLP in Gluconobacter suboxydans

LIU Jing-wen, LI Tian-ming, DU Hong-yan, FENG Hui-yong*
(College of Biological Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050000, China)

In this paper, the broad-host vector pBB1MCS-5 was used to construct an expression vector for flippase recombination enzyme (FLP). The expression vector was transformed into Gluconobacter suboxydans, and the positive transformants were screened. The results of validation using a two-step RT-PCR method showed that f p was transcribed and expressed in the host cell. The pBBR1MCS-psldh-f p recombinant plasmid was transformed into tetracyclic-resistant JGDH－mutant strains, and PCR verification showed that the sites with FTR resistance marker had been effectively removed. Recombination FLP expression in Gluconobacter suboxydans provides a method that circularly uses the selectable marker gene to knock out or replace multiple locus genes.

Gluconobacter suboxydans; FLP/FRT; site-specif c recombination; promoter; gene knock-out

Q789

A

1002-6630（2014）11-0204-05

10.7506/spkx1002-6630-201411041

2013-07-17

劉靜文（1988—），女，碩士研究生，研究方向為代謝工程。E-mail：liujingwen_1988@126.com

*通信作者：馮惠勇（1967—），女，教授，碩士，研究方向為代謝工程與酶的定向進化。E-mail：fenghuiyong@163.com