不同黃酮類單體對CHO 細胞早期損 傷作用的比較研 究

劉 濤，孫 健，郭 辰，趙曉紅,*

（1.首都師范大學生命科學學院，北京 100048；2.北京聯合大學功能食品研究 院，北京 100191）

不同黃酮類單體對CHO 細胞早期損 傷作用的比較研 究

劉 濤1，孫 健2，郭 辰2，趙曉紅2,*

（1.首都師范大學生命科學學院，北京 100048；2.北京聯合大學功能食品研究 院，北京 100191）

選用竹葉中4 種黃酮單體葒草苷、異葒草苷、綠原酸和阿魏酸，在各毒性劑量下作用于中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞，通過檢測其對細胞早期損傷指標——線粒體功能變化的影響，以評估其細胞損傷作用。CCK-8檢測法測得4 種單體物質對CHO細胞的IC50值分別是：綠原酸2 726.11 μmol/L、阿魏酸1 680.28 μmol/ L、葒草苷1 889.15 μmol/L、異葒草苷2 358.56 μmol/L。在各單體IC50、1/2 IC50值、1/4 IC50值、1/8 IC50值劑量下，線粒體膜電位變化具有劑量依賴性，其中以阿魏酸降低幅度最明顯，綠原酸次 之，葒草苷和異葒草苷變化較小；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成量與作用劑量成負相關，阿魏酸致ATP生成量降低最多，葒草苷次之，綠原酸和異葒草苷影響較小；細胞色素 C的釋 放量，以阿魏酸最大，葒草苷和異葒草苷次之，綠原酸的最小。研究表明4種單體物質都對線粒體產生了一定的損傷，其中阿魏酸對線粒體影響最大，葒草苷和異葒草苷次之，綠原酸最小。

細胞色素C；線粒體膜電位；三磷酸腺苷；線粒體損傷；綠原酸；阿魏酸；葒草苷；異葒草苷

竹葉提取物是我國新開發的一類資源，其主要的生理活性成分包括竹葉黃酮及其苷類、活性多糖、礦物質及茶多酚等[1]。竹葉黃酮是由黃酮類、內酯類和酚酸類化合物組成的混合物，其中黃酮類的代表物質是葒草苷、異葒草苷，內酯類的代表物質是綠原酸、咖啡酸和阿魏酸等，這些單體物質都具有多方面的活性[2]。大量流行病學和實驗研究結果表明竹葉黃酮具有抗炎、抗氧化、防腐抗菌、預防動脈粥樣硬化等生物活性，尤其對于腫瘤的抑制具有顯著作用[3-8]。

目前關于葒草苷、異葒草苷、綠原酸和阿魏酸這4種單體物質的研究主要集中在它們有益的一面，對于有害一面的毒性評價研究資料較少，而在毒劑量下作用于正常細胞的早期損傷指標的研究更是未見報道。研究植物活性物質毒性，常用的方法主要為常規毒性評價方法和早期細胞反應實驗。常規毒性評價方法主要為動物實驗，如急性毒性、小鼠微核實驗和小鼠精子畸形實驗等，早期細胞反應研究可預測體內毒性反應，如細胞應激反應、酶活性變化、線粒體損傷。

在細胞中，線粒體不僅是能量提供中心，而且具有其他多種重要的生理功能，如控制中間代謝，鈣離子穩態，細胞增殖生長與凋亡等[9-10]。細胞的凋亡和生長的過程均需要能量，線粒體是機體產生能量的重要場所，細胞進行生命活動95%的能量來源于它。DNA的損傷造成復合酶的活性下降，直接導致ATP生成減少[11]。胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生大多數來源于線粒體，當ROS增加并超出臨界值時，就導致膜通透性的改變、膜間因子和膜上各種蛋白的釋放，從而引起細胞的轉化或死亡。存在于膜間的Cyt C是線粒體介導的細胞凋亡途徑中不可缺少的重要因子，在凋亡過程中起著關鍵作用[12]。

當前對于線粒體損傷的檢測手段多種多樣。采用電鏡實驗觀察線粒體異常時的嵴型變化、基質凝縮等情況[13-14]；聚合酶 鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和核酸雜交（Southern blotting）檢測mtDNA缺失突變[15-16]；對線粒體滲透性轉換孔的檢測方法有膜片鉗技術法、活性物質標記法、分光光度法等[17]；線粒體膜電位的變化檢測可以采用JC-1探針[18]；ROS的檢測主要采用四大類方法：化學發光法、熒光探針、電子自旋共振和分光光度法[19]；目前對于ATP的檢測主要采用生物熒光技術，該法根據熒光素、熒光素酶在ATP作用下，發生熒光反應，利用熒光光度計檢測其發光強度[20]。

本實驗采用黃酮類4種單體物質綠原酸、阿魏酸、葒草苷和異葒草苷作用于CHO細胞，CCK-8實驗得到細胞存活率，計算出IC50值，以IC50值為毒性劑量上限，倍比稀釋后，1/2 IC50值、1/4 IC50值、1/8 IC50值劑量為實驗濃度，作用細胞24h后，檢測毒性劑量下4種單體對CHO細胞線粒體損傷以及細胞凋亡的影響，并比較4種單體的線粒體毒性以及發現細胞損傷的早期指標。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸、阿魏酸、葒草苷和異葒草苷 美國Sigma公司；CHO細胞株 美國GE Healthcare公司；F-12 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；青鏈霉素（Penicillin-Streptomycin，PS）、胰蛋白酶（0.25% trypsin） 美國Invitrogen公司；CCK-8 日本Dojindo公司；ROS檢測試劑盒 中國普利萊基因有限公司；ATP檢測試劑盒 中國碧云天生物技術研究所；細胞凋亡檢測試劑盒 中國寶賽生物技術有限公司；Cytochorme C單克隆抗體 中國博奧森有限公司；羰酰氰氯苯腙（carbonylcyanidem-chlorophen- ylhydrazone，CCCP） 美國Alfa Aesar公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 北京百劍空氣凈化設備廠；Forma 3110系列CO2培養箱 美國Thermo Electron公司；TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司；MLS-3750型高溫蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；5840R冷凍離心機德國Eppendorf公司；MQX200微板分光光度計 美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞增殖率測定

Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞活性檢測試劑中包括有WST-8，在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxy PMS）的作用下，細胞線粒體中的脫氫酶可以將WST-8還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan）。反應生成的甲瓚產物的數量與活細胞的數量成正比。采用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其OD值，可間接反映活細胞數量。

取指數生長期的CHO細胞，消化計數后，以5×104個/mL的細胞密度，接種于96 孔培養板（100μL/孔），置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h；棄上清，用PBS液洗1～2遍，加入90 μL/孔不含小牛血清的各濃度的樣品（實驗組），每個濃度設6 個平行，培養24 h；設置不加樣品的對照組。直接向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，輕輕混勻（注意不要在孔中生成氣泡，以免影響OD值讀數，造成結果誤差）；置于37 ℃、5%CO2培養箱培養4h；用MQX200微孔板分光光度計檢測激發波長為450nm的每孔的OD值。以無細胞的CCK-8溶液為空白組。按下式計算細胞增殖率。

1.3.2 線粒體膜電位的檢測

JC-1是一種廣泛用于線粒體膜電位檢測的陽離子脂質熒光染料，可以很好的指示膜電位的變化。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態，當線粒體膜電位較低時，它以單體的形式存在；當膜電位較高時，它以多聚體形式存在。單體的最大激發波長為514 nm，最大發射波長為529 nm，可采用流式細胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光；多聚體的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為590 nm，可被流式細胞儀的紅色（FL-2）通道檢測到熒光。

操作同流式細胞儀凋亡檢測，收集細胞，然后每管加入100 μL JC-1染色液，輕輕彈動離心管至均勻后，室溫避光孵育20 min；孵育結束后每管加入500 μL的PBS緩沖液，流式細胞儀檢測各組JC-1的熒光強度，每個樣本收集10 000 個細胞進行分析，CCCP作為陽性誘導劑處理正常細胞；數據采用Cell Quest TM軟件分析，結果以FL2/FL1（紅/綠熒光）的比值表示。

1.3.3 細胞內ATP的檢測

同上收集細胞，根據試劑盒操作說明書處理細胞，將裂解液在冰上完全裂解細胞后，13 000 r/min，離心10 min；離心過后的樣品置于冰上放置，取96 孔板在每孔內加入100 μL試劑盒內的ATP檢測緩沖液，靜置5 min；取上清細胞裂解液，10 μL每孔加入到緩沖液內，同時檢測不同組的蛋白濃度；迅速的采用熒光酶標儀檢測，記錄讀數，計算出每組ATP的量（μmol/μg），結果以空白組為1，其余各組用與空白組相對比較值表示。

1.3.4 Western blotting檢測細胞色素C的表達

分別采用 4種單體物質不同濃度的IC50、1/2 IC50、1/4 IC50、1/8 IC50值處理CHO細胞24h后，采用Western blotting檢測胞內細胞色素C的濃度。在將細胞按要求處理過后，分組為空白組、陽性對照組和4 種單體不同IC50值組。4 種單體處理細胞24 h后，收集細胞，4 ℃、800～1 000 r/min，離心5 min，棄去上清液，沉淀加入含有PMSF的裂解液，混勻細胞，于冰上裂解30 min，快速的4 ℃下13 000 r/min離心15 min，得到的上清液加入上樣緩沖液，煮沸后進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉至PVDF膜上。加入封閉液（1×PBST中加入5 g/100 mL的BSA），室溫搖床下封閉PVDF膜1h；加入Cyt C一抗4℃孵育過夜，PBST洗脫3 次，再與HRP標記的二抗室溫孵育1 h，PBST洗脫3 次，ECL發光液反應，顯影。應用ImageQuant RT ECL凝膠成像系統獲取蛋白條帶圖像后，Quantity One軟件進行分析，以細胞色素C與β-actin蛋白條帶的灰度值之比作為指標，再以空白對照組的灰度值得出目的蛋白表達相對于內參的定量結果。

1.4 數據處理

應用Excel進行數據整理，SPSS17.0進行描述性統計分析，所得結果用±s表示，采用t檢驗進行兩組均數比較；各樣品濃度與對照組比較采用單因素方差分析中的Dunnetts檢驗；IC50值采用回歸中概率單位分析。

2 結果與分析

2.1 4種單體物質對CHO細胞增殖率的影響

表1 不同濃度的4種單體物質對CHO細胞增殖率的影響（x±s，n=3）Table1 Effect of four substances at different concentrations on the viability of CHO cellss (x ±s，nn == 33))

4 種單體物質作用于CHO細胞24 h后，CCK-8檢測后計算得出4 種單體物質的IC50值分別是：綠原酸2 726.11 μmol/L、阿魏酸1 680.28 μmol/L、葒草苷1 889.15 μmol/L、異葒草苷2 358.56 μmol/L。由此可以看出，4種單體物質的細胞毒性都不大。由表1可知，隨著劑量的加大，細胞增殖率下降，濃度小于800 μmol/L時葒草苷處理組細胞增殖率最低；大于800 μmol/L時阿魏酸最低。IC50值越小，細胞毒性越大；增值率越大，細胞毒性越小。因此，可以得出這4 種單體物質中阿魏酸的CHO細胞毒性作用最大，綠原酸的最小。

2.2 不同劑量的4種單體對CHO細胞線粒體膜電位的影響

圖1 不同劑量下4種單體物質對CHO細胞線粒體膜電位的影響Fig.1 Effects of four substances at various doses on mitochondrial membrane potential of CHO cells

由圖1可知，由JC-1染色的細胞，經流式細胞儀收集分析，得到的散點圖包括4個象限。染色后收集細胞采用紅色的FL-2通道，線粒體膜電位較高時，細胞處于右上象限，膜電位下降的細胞處于右下象限，兩者的熒光比值就可以反應出受損細胞線粒體膜電位的下降情況。

圖2 不同劑量下4種單體物質對CHO細胞線粒體膜電位影響的比較Fig.2 Effects of four substances at various doses on mitoc hondrial membrane potential of CHO cells

由圖2可知，阿魏酸對膜電位的影響最大，綠原酸次之，葒草苷與異葒草苷的最小，單因素方差分析4種單體在各毒性劑量下的比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 不同劑量下4種單體處理的CHO細胞線粒體膜電位變化（x±s，n=3）Table2 Change in mitochondrial membrane potential of CHO cells treated with four substances at various doses(x ±s，nn == 33))

由表2可知，4種單體物質在各自的IC50值濃度下處理CHO細胞24h后，熒光比值與空白組比較，阿魏酸呈極顯著差異，綠原酸、葒草苷和異葒草苷呈顯著性差異；在1/2 IC50值濃度處理下，阿魏酸呈顯著性相關，其他3種單體無顯著性差異；隨著濃度的下降，4種單體物質處理細胞，對其線粒體膜電位影響與空白組均無顯著性差異。

2.3 不同劑量的4種單體對CHO細胞內ATP的影響

圖3 不同劑量下4種單體物質對CHO細胞內ATP相對含量的影響Fig.3 Effects of four substances at various doses on ATP levels of CHO cells

由圖3可知，不同濃度的4種單體物質作用于CHO細胞24h后，與空白組比較，胞內ATP的生成量減少，隨濃度的降低，胞內ATP量增多，但均小于空白組。在IC50值濃度下，阿魏酸作用于細胞生成的ATP最少，相對比值為0.64，葒草苷為0.75，它們與空白組比較均呈極顯著性差異；綠原酸的最大為0.85，異葒草苷為0.81，它們與空白組比較呈顯著性差異；濃度降至各自的1/4 IC50時候，4種單體作用產生的ATP與空白組比較無顯著性差異。由此可知，4種單體物質在毒性劑量下對胞內ATP的影響，阿魏酸的最大，葒草苷和異葒草苷次之，綠原酸的最小。通過單因素方差分析比較，IC50劑量下阿魏酸與綠原酸呈極顯著差異（P<0.01），與異葒草苷有顯著性差異（P<0.05），與葒草苷無顯著性差異（P＞0.05），1/2與1/4 IC50劑量下4種單體之間比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 不同劑量的4種單體對CHO細胞細胞色素C的影響

圖4 不同劑量下4種單體物質對CHO細胞內細胞色素C的影響Fig.4 Effects of four substances at various doses on cytochrome C release of CHO cells

圖5 不同劑量下4種單體物質對CHO細胞內細胞色素C的影響Fig.5 Effects of four substances at various doses on cytochrome C release of CHO cells

由圖4、5可知，不同濃度的4種單體物質處理CHO細胞24h后，對細胞色素C的釋放具有不同的影響。綠原酸與異葒草苷的IC50、1/2 IC50、1/4 IC50、1/8 IC50下處理，與空白組比較均無顯著性差異；阿魏酸IC50濃度處理下與空白組比較具有極顯著差異，1/2 IC50濃度處理下具有顯著性差異，其余處理無差異；葒草苷在IC50濃度處理下與空白組比較具有顯著差異，其余＜濃度組處理無顯著性差異。由此可知，4種單體作用后細胞色素C釋放量，阿魏酸最大，葒草苷和異葒草苷次之，綠原酸的最小，且4種單體物質在相同毒性劑量下相互比較，均無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

本實驗探討了4種黃酮單體葒草苷、異葒草苷、綠原酸和阿魏酸對細胞早期損傷指標——線粒體功能變化的影響，實驗發現，4種單體物質處理CHO細胞24h后，在1/4 IC50值濃度下與空白組比較各線粒體損傷指標變化都無顯著性差異；在1/2 IC50值濃度下細胞色素C釋放與空白組比較無顯著性差異，膜電位變化，阿魏酸呈顯著性差異，其他單體無顯著性差異，ATP的下降阿魏酸和葒草苷呈顯著性差異，其他無顯著性差異，說明相同劑量下，ATP的變化在反應線粒體損傷方面比膜電位和細胞色素C的釋放更敏感。

氧化磷酸化發生的主要場所是線粒體，因此線粒體與ATP的合成關系密切。在一些外界因素刺激下，細胞中會出現大量過氧化物的積累，過多的氧自由基，使細胞及線粒體出現膜脂質過氧化，導致線粒體受損，功能異常，ATP生成小于分解，進一步的反應還會使膜磷脂分解[21]。線粒體膜電位、ROS和ATP的變化說明了是線粒體損傷后造成了這一系列的結果，因為它們之間存在相互關聯，這與以往文獻[21-22]報道相一致。

作為胞內的能量工廠，90%的ATP通過氧化磷酸化在此產生。在這個過程中，氧化呼吸鏈障礙會造成“電子漏”，生成的O2會被氧化成超氧陰離子，因此它是胞內大多數ROS的來源。另一方面，存在于氧化呼吸鏈上的細胞色素C負責將電子由復合物Ⅲ傳遞到復合物Ⅳ[23]，細胞色素C的結果可以看出不同劑量處理改變并沒有其他指標那么明顯，這或許是因為它的釋放具有其他的控制因素，同時它的釋放在ROS產生，以及ATP下降之后，但是從凋亡結果仍可以看出線粒體損傷參與了CHO細胞凋亡過程的發生。

本實驗第一次比較了4種黃酮類單體的線粒體毒性，得出結論為：阿魏酸的線粒體毒性最大，綠原酸的最小。線粒體相關指標與細胞凋亡率的比較看出，這4種物質作用于CHO 細胞后，線粒體調控了凋亡的發生，它們不僅僅導致了ROS的過量產生，還引起了ATP、膜電位的下降和細胞色素C的增多，然后通過凋亡等反應去應對線粒體損傷造成的各種細胞功能障礙。

線粒體與細胞凋亡之間存在著千絲萬縷的聯系，線粒體膜電位、ATP、細胞色素C的這些變化當不處于細胞所能調控的范圍之內，細胞將啟動保護功能除去這些受損的線粒體甚至細胞，以保證組織和機體的正常生命活動，但是目前的一些探索也僅僅只是停留在淺層，相互之間更深的聯系還有待進一步的研究。

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Comparison of Early Damage of CHO Cells in the Presence of Different Flavonoid Monomers

LIU Tao1, SUN Jian2, GUO Chen2, ZHAO Xiao-hong2,*
(1.School of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China; 2.Research Institute for Science and Technology of Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

The cytotoxicity of four types of flavonoid monomers, namely chlorogenic acid, ferulic a cid, orientin and isoorientin on Chinese hamster ovary (CHO) cells wa s detected and compared by CCK-8 test and the IC50values were calculated by Exact Probability. The mitochondrial membrane potential, the production of ATP and the release of cytochrome C were used as the parameters to indicate early cellular damage. The results showed that IC50of chlorogenic acid, ferulic acid, orientin and isoori entin was 2 726.11, 1 680.28, 1 889.15 and 2 358.56 μmol/L, respectively. At experimental doses of IC50, 1/2 IC50, 1/4 IC50, and 1/ 8 IC50for these four monomers, the change of mitochondrial membrane potential was in a dose-dependent manner. Meanwhile, ferulic acid resulted in the largest decease in mitochondrial membrane potential, followed by chlorogenic acid, orientin and isoorientin. The production of ATP was negatively correlated with the dose of f avonoids, which was inhibited by ferulic acid, orientin, chlorogenic acid and isoorientin in this decreasing order. In the case of cytochrome C release, the decreasing order was ferulic acid, orientin, isoorientin and chlorogenic acid. In summary, all the four f avonoids can result in mitochondrial damage at higher or lower levels. Ferulic acid has the highest mitochondrial toxicity, followed by orientin, isoorientin and chlorogenic acid. The change of mitochondrial function may be considered as an index of early cellular damage.

cytochrome C; mitochondrial membrane potential; adenosine triphosphate; mitochondrial damage; chlorogenic acid; ferulic acid; orientin; isoorientin

Q946.8；Q255

A

1002-6630（2014）11-0223-06

10.7506/spkx1002-6630-201411045

2013-10-25

北京市教委科技發展計劃重點項目（KZ201211417041）

劉濤（1987—），男，碩士研究生，研究方向為細胞生物學。E-mail：Lionat711@sina.com

*通信作者：趙曉紅（1961—），女，研究員，博士，研究方向為食品功能與毒理學。E-mail：xiaohong@buu.edu.cn