磁性納米材料在食源性致病菌分離中應用的研究進展

黃小林，許恒毅*，熊勇華，曲 鋒，楊 林

（南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

磁性納米材料在食源性致病菌分離中應用的研究進展

黃小林，許恒毅*，熊勇華，曲 鋒，楊 林

（南昌大學 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

食源性致病菌是影響食品安全的主要因素之一。食品中污染的致病菌數(shù)量通常較少，加上其基質(zhì)復雜，常規(guī)分析方法常無法直接對致病菌進行高靈敏、高特異的檢測。經(jīng)過生物學修飾和功能化的磁性納米材料，可特異性地識別食品基質(zhì)中少量的致病菌，并通過磁場對靶細菌進行快速及高特異性的選擇性分離，實現(xiàn)了食品樣品中少量致病菌的特異性分離富集，達到了后續(xù)分析檢測的純度和數(shù)量。本文綜述了磁性納米材料在食源性致病菌分離富集中的研究進展。

磁性納米材料；食源性致病菌；分離；富集

食品安全問題一直是備受各國政府和群眾關注的焦點問題，也是關系到國計民生的重大問題。其中，由致病菌引起的食品污染問題是主要的食品安全問題之一。據(jù)報道，美國每年有7600萬人感染食源性疾病，其中有32500例住院病例和5000例致死病例，而由食源性致病菌引起的占19.4%[1]。有資料顯示，2006年我國食源性疾病監(jiān)測地區(qū)暴發(fā)食源性疾病事件共594起，累計發(fā)病13849例，死亡67例，其中由食源性致病菌引起的占48.3%[2]。就此，尋找快速檢測食源性致病菌的方法尤為迫切。然而，現(xiàn)有檢測方法對已預增菌培養(yǎng)的樣品靈敏度較高，而對目的菌數(shù)量少或者存在干擾性物質(zhì)的普通食品樣品，靈敏度低且特異性差，前期對目的菌進行預增菌或高效分離富集是實現(xiàn)快速檢測的重要前提。因此，選擇合適的分離方法，使目的菌從復雜的食品基質(zhì)中分離出來，同時清除食品基質(zhì)中干擾后續(xù)檢測的物質(zhì)，對實現(xiàn)目的菌靈敏且特異的檢測至關重要。目前常用的細菌分離方法分為選擇性和非選擇性兩類，常見的選擇性方法有基于抗體的免疫分離等，而常見的非選擇性方法有離心、過濾、交換樹脂、吸附等。表1總結(jié)了從食品中分離富集細菌的各種方法及其優(yōu)缺點。

近年來，基于磁性微球的免疫磁分離法（immunomagnetic separation，IMS）已被廣泛應用于食源性致病菌的分離，在一定程度上取代了傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)。但是受磁性微珠捕獲效率、擴散速度以及其在食品基質(zhì)中的不穩(wěn)定性等諸多因素的限制，該方法的分離效率有限。隨著納米材料合成技術(shù)的迅猛發(fā)展，納米級磁性材料的研究受到了廣泛的關注，其在細胞分離、蛋白質(zhì)分離、核酸分離和微生物分離等方面都有重要的應用。磁性納米材料與普通的磁性微珠相比，直徑從微米級減小到納米級，具有更理想的比表面積和反應動力學特征，且克服了磁性微球穩(wěn)定性差、擴散速度慢、非特異性吸附強以及易損傷目標菌等缺點，在致病菌分離富集中具有良好的應用前景。本文綜述了磁性納米材料在食源致病菌分離富集中應用的研究進展。

表1 食源性致病菌的分離技術(shù)及其優(yōu)缺點Table1 Technologies for the separation of foodborne pathogens and their advantages and disadvantages

1 磁性納米材料的生物學修飾

磁性納米材料的生物學修飾是利用磁性納米材料分離富集致病菌的前提，將生物親和分子修飾到磁性納米材料的表面，賦予其捕獲目標菌的能力，間接地“磁化”細菌細胞（磁細菌），使磁細菌在外界磁場作用下能夠從樣品液中分離。另外，經(jīng)修飾后的磁性納米材料可以獲得比單體生物分子更高的結(jié)合能力。例如，由于多個抗體分子可被修飾于磁性納米粒子上，磁性納米粒子經(jīng)抗體修飾后，與目標菌的結(jié)合能力是單獨抗體的8倍；同理，經(jīng)甘露糖修飾后，與目標菌的結(jié)合能力比單體甘露糖強200倍[19-20]。

磁性納米材料生物學修飾的方法有很多，大體分為直接修飾和間接修飾兩種。直接修飾又分為物理吸附和共價偶聯(lián)。物理吸附是指蛋白質(zhì)等生物親和分子和納米材料間的疏水作用和靜電作用；共價偶聯(lián)是指先在納米材料的表面修飾硫化物、胺或者羧基，通過這些基團與生物親和分子形成共價鍵從而實現(xiàn)納米材料生物學修飾[21-22]。間接修飾則需要利用一對具有強親和力的分子，比如生物素-親和素。先用親和素包被納米材料，再將要修飾的生物親和分子標記生物素，通過生物素和親和素的結(jié)合間接達到修飾磁性納米材料的目的。

2 磁性納米材料捕獲致病菌的方式及其應用

圖1 Fe 1 Fe3O4磁性納米粒子捕獲致病菌的方式Fig.1 Ways of capturing pathogenic bacteria with magnetic Fe3O4nanoparticles

表2 磁性納米材料在食源性致病菌分離中的應用Table2 Summary of the application of magnetic nanomaterials in the separation of foodborne pathogens

磁性納米材料通過生物學修飾，獲得可以捕獲食源性致病菌的能力，再利用外界磁場從而達到分離菌體目的。表2總結(jié)了近幾年磁性納米材料在分離不同食品基質(zhì)中食源性致病菌的研究。磁性納米材料表面使用的修飾物不同，捕獲食源性致病菌的方式也不同，總結(jié)于圖1。

2.1 抗原-抗體

基于抗原抗體之間的特異性反應實現(xiàn)食源性致病菌捕獲是最常用的方式，已被廣泛應用于各種食源性致病菌的分離富集。食源性致病菌相應的抗體也是磁性納米材料最常用的修飾物。將磁性納米材料的表面包被相應抗體，利用抗體和細菌表面相應抗原間的特異性結(jié)合，將食源性致病菌和磁性納米粒子連接，致病菌被“磁化”后，在外界磁場的作用下將目標菌從成份復雜的樣品液中分離出來，便于后續(xù)檢測。Varshney等[23]通過生物素-鏈霉親和素將抗大腸桿菌抗體包被到磁性納米粒子的表面，用于捕獲牛肉樣本中大腸桿菌O157∶H7，捕獲效率達94.5%。Yang等[24]用相應抗體修飾氧化鐵納米粒子，結(jié)合實時定量聚合酶鏈式反應（realtime quantitative polymerase chain reaction，real-time qPCR），檢測牛奶樣品中的單增李斯特菌，檢測限達452 CFU/mL。Ravindranath等[25]分別制備了包被有抗大腸桿菌抗體和抗沙門氏菌抗體的功能化磁性納米粒子，用于分離雞尾酒和菠菜牛奶提取液中相應的食源性致病菌，結(jié)合紅外光譜分析，檢測限達104～105CFU/mL。Cheng等[26]使用抗大腸桿菌O157∶H7抗體包被的磁性納米粒子分離牛奶中的大腸桿菌O157∶H7，結(jié)合三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生物發(fā)光分析，檢測限達20 CFU/mL。Wang等[27]制備了兩種特異性抗體共修飾的磁性氧化鐵納米粒子用于同時分離菠菜中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，結(jié)合表面增強拉曼散射分析，檢測限達103CFU/mL。

2.2 黏附素（凝集素）-受體（糖類）

很多細菌會在其表面表達黏附素，它們能與宿主細胞表面相應受體結(jié)合，從而使細菌黏附在宿主細胞上。致病菌黏附宿主上皮細胞的機制與多種糖類有關。例如，大腸桿菌的表面可以表達產(chǎn)生多種黏附素，它們可以黏附宿主上皮細胞上的半乳糖、葡萄糖、果糖、巖藻糖、甘露糖和蔗糖等[12]。利用黏附素與受體結(jié)合的性質(zhì)，經(jīng)凝集素或糖類修飾的磁性納米粒子可特異性地結(jié)合相應的食源性致病菌。EI-Boubbou等[28]用D-甘露糖修飾的磁性納米粒子分離大腸桿菌，分離效率達88%以上。作者再結(jié)合X射線衍射、透射電鏡、熱重和紅外光譜分析，在5 min內(nèi)即可完成檢測，檢測限達104個菌體/mL。Payne等[29]用凝集素修飾的BioMag?粒子分離食品基質(zhì)中的致病菌，結(jié)果顯示，單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌最低分離起始濃度分別為大于等于10 CFU/10 g（卡蒙貝爾奶酪）、1 CFU/10 g（燉牛排）和小于10 CFU/10 g（生牛肉）。Wang Yixian等[30]制備了基于凝集素的生物傳感器，用于分離檢測食品樣品中的大腸桿菌O157∶H7，檢測限達 3×103CFU/mL。

2.3 抗生素（萬古霉素）

萬古霉素是一種糖肽類抗生素，它可以與許多種革蘭氏陽性菌形成緊密的連接，其機制是通過細胞壁上的端肽D-Ala-D-Ala的氫鍵與萬古霉素聯(lián)接[31]。一般認為，由于革蘭氏陰性菌外膜的存在，萬古霉素不能接觸到D-Ala-D-Ala端肽，因而不能識別革蘭氏陰性菌。據(jù)報道[32-33]，經(jīng)萬古霉素修飾過的磁性納米粒子同樣可以捕獲革蘭氏陰性菌，并由透射電子顯微鏡的照片猜想萬古霉素與革蘭氏陰性菌連接的機制為細菌外膜上存在缺陷區(qū)域，使部分D-Ala-D-Ala端肽暴露給萬古霉素。Kell等[31]隨后驗證了這一猜想。Gu等[32]在FePt磁性納米粒子表面修飾萬古霉素（FePt-Van），從大腸桿菌菌液中分離出菌體后再用透射電鏡觀察，檢測限達15 CFU/mL。Kell等[31]制備了萬古霉素修飾的磁性納米粒子用于同時分離水樣中革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，結(jié)果顯示，不同的致病菌間捕獲效率相差很大（7%～88%）。Wan等[34]使用萬古霉素修飾的磁性納米粒子分離磷酸鹽緩沖液中添加的海洋型硫還原型細菌（如，脫硫腸狀菌屬），結(jié)合生物傳感器，檢測限達1.8×104CFU/mL。Choi等[35]在磁性氧化鐵納米粒子表面修飾萬古霉素，并用其對臨床樣本中的細菌進行分離，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陽性菌的捕獲效率為（84.84±1.70）%，而革蘭氏陰性菌的捕獲效率為（48.48±1.79）%。Chen等[36]用表面修飾有慶大霉素的磁性納米粒子用于分離磷酸鹽緩沖液中添加的金黃色葡萄球菌，最低分離的細菌濃度為0.5×103CFU/mL。

2.4 DNA互補序列

任何細菌都有其特異性的基因片段，該基因片段的互補寡核苷酸片段可以識別樣品中的該種細菌。將寡核苷酸片段修飾后的磁性納米材料用于選擇性的分離目標DNA或RNA，再結(jié)合PCR鑒定，不僅省去樣品的預處理，靈敏度也比普通PCR提高近10 倍[37]。Amagliani等[24]用與李斯特菌素O基因序列（hlyA）互補的寡核苷酸鏈修飾磁性氧化鐵納米粒子分離牛奶樣品中的單增李斯特菌的DNA，結(jié)合PCR分析，檢測限達10 CFU/mL。筆者[38]在2010年制備了分別針對單增李斯特菌和沙門氏菌的寡核苷酸修飾的磁性氧化鐵納米粒子用于分離魚中單增李斯特菌和沙門氏菌的DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌和沙門氏菌的捕獲效率分別為（62.5±10.0）%和（70.6±7.0）%。結(jié)合多重PCR分析，檢測限達1 CFU/g。Xu Hongxia等[39]研究了不同食源性致病菌寡核苷酸修飾的磁性納米粒子在致病菌分離中的應用，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該磁性納米粒子可以快速富集相應致病菌（如，大腸桿菌O157、沙門氏菌等）。筆者進一步研究了同時使用食源性致病菌多個基因的互補寡核苷酸修飾的磁性納米粒子分離相應致病菌，結(jié)合傳感器檢測，檢測限達6×102CFU/mL。

2.5 螯合反應

脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的重要組分，其中類脂A有大量的磷酸基團，用金屬氧化物（氧化鈦、氧化鋯或氧化鋁）包被磁性納米粒子，通過金屬氧化物與磷酸基團間的螯合反應，可與待測樣品中革蘭氏陰性菌形成復合物，在外界磁場的作用下可將食源性致病菌從成分復雜的待測液中非選擇性分離出來，消除樣品基質(zhì)的干擾[40]。Chen等[40]在磁性氧化鐵納米粒子的表面包被二氧化鈦，利用脂多糖和金屬氧化物的螯合作用捕獲尿樣中的大腸桿菌、志賀氏菌和假單胞菌，磁分離富集菌體后經(jīng)胰蛋白酶水解，再次磁分離除去磁性納米粒子，最后用基質(zhì)輔助激光解吸-電離質(zhì)譜法（matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS）鑒定蛋白序列，根據(jù)蛋白庫中的信息確定細菌的種類。該方法是一種快速（耗時15 min）、特異性強（可區(qū)分兩株不同的大腸桿菌）、靈敏（檢測限達104個細胞/mL）的分離檢測方法。2010年，筆者[41]使用表面修飾有二氧化鈦的磁性氧化鐵納米粒子分離細菌混合液中的目標致病菌，隨后分離到的致病菌在紫外燈照射下結(jié)合二氧化鈦的滅菌作用，15 min內(nèi)可以抑制99.9%以上的目標菌的生長。

3 結(jié) 語

如何從復雜的食品樣品中高效特異地分離出數(shù)量極少的食源性致病菌，從而實現(xiàn)對目標菌高靈敏和高特異的檢測，一直是食品安全領域的一大瓶頸。現(xiàn)今，磁性納米材料合成技術(shù)迅猛發(fā)展，以及其各方面性能的不斷完善，已被廣泛應用于食源性致病菌的分離富集。自從磁性納米材料應用于食源性致病菌分離以來，其快速（省去增菌培養(yǎng)的過程）、高效（捕獲效率高）和消除雜質(zhì)干擾的能力均給人們帶來巨大驚喜。但在基于磁性納米材料的食源性致病菌分離方面，仍存在一些問題值得研究：1）盡管磁性納米材料捕獲食源性致病菌的方式很多，但是能夠?qū)崿F(xiàn)高特異性捕獲的不多，尋找可與致病菌特異性結(jié)合的生物親和分子（如，適配體等）并將其應用于致病菌的磁分離值得探究；2）磁性納米材料對細菌潛在的毒性問題；3）就微米級磁性材料而言，納米級磁性材料分離食源性致病菌存在分離速度慢、磁場要求高的缺陷，怎樣通過生物反應放大系統(tǒng)（如，生物素-

親和素系統(tǒng)）實現(xiàn)磁細菌信號的級聯(lián)放大，通過增大致病菌的磁性納米材料結(jié)合容量，在較低的磁場強度下就能實現(xiàn)磁細菌的分離并減少磁分離時間值得研究；4）目前常用的免疫磁分離方法大多屬于靜態(tài)分離方法，存在分離體積小（1～1.5 mL）的缺陷，導致濃縮倍數(shù)低，從而造成磁富集效率不高，因此，探討大體積（如15、50 mL）磁細菌快速分離具有重要的科學意義和實踐價值。

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Research Progress on Magnetic Nanomaterials for Separation of Foodborne Pathogenic Bacteria

HUANG Xiao-lin, XU Heng-yi*, XIONG Yong-hua, QU Feng, YANG Lin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Foodborne pathogenic bacteria are one of the major factors that influences food safety. Pathogens in limited numbers are not easy to directly detect with high sensitivity and specificity in food matrices via routine analytical methods. Magnetic nanomaterials with biological modification and functionalization can specifically recognize foodborne pathogenic bacteria in food samples. Target bacteria can be separated selectively with rapidity and high specificity by a magnetic field, which realizes the specific separation and enrichment of low numbers of pathogens in food samples, providing enriched pathogens with higher purity and quantity for further study. This paper reviews recent progress in applying magnetic nanomaterials for the separation and enrichment of foodborne pathogens.

magnetic nanomaterials; foodborne pathogenic bacteria; separation; enrichment

Q93

A

1002-6630（2014）11-0280-06

10.7506/spkx1002-6630-201411056

2013-06-10

國家自然科學基金面上項目（31271863）；國家自然科學基金青年科學基金項目（81201691）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAK10B06）；2012年度高等學校博士學科點專項科研基金項目（20123601120005）；江西省教育廳科技基金資助項目（GJJ13093）

黃小林（1988—），男，碩士研究生，研究方向為免疫磁分離。E-mail：hxl19880503@163.com

*通信作者：許恒毅（1981—），男，副研究員，博士，研究方向為食品安全與食品生物技術(shù)。E-mail：kidyxu@163.com