響應面分析法優化微生物溶菌酶微膠囊制備工藝

費國琴，寧喜斌，李曉暉*，宋 娟，李文利

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

響應面分析法優化微生物溶菌酶微膠囊制備工藝

費國琴，寧喜斌，李曉暉*，宋 娟，李文利

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

以海藻酸鈉、殼聚糖為壁材，采用響應面法試驗對微生物溶菌酶微膠囊制備條件進行優化。選取7種因素進行Plackett-Burman篩選，得出海藻酸鈉質量濃度、殼聚糖質量濃度及醋酸質量濃度是影響包埋率的3個主要因素。進一步進行最陡爬坡試驗逼近中心區域。最后，通過Box-Behnken試驗建立回歸方程，獲得主因素的最佳水平，即質量濃度分別為：海藻酸鈉2.00 g/100 mL、殼聚糖0.35 g/100 mL、醋酸0.33 g/100 mL，預測微生物溶菌酶最高包埋率為94.635%，經實驗驗證后所得的包埋率為92.10%。

微膠囊；海藻酸鈉；殼聚糖；響應面；微生物溶菌酶

微生物溶菌酶是由微生物分泌產生的，具有溶解細菌細胞壁活性的堿性蛋白質[1]，除了具有蛋清溶菌酶的優點外，其有著更為廣泛的抑菌譜及更強的抑菌效果[2-10]，因此正逐步受到研究者的重視，在食品、化工、醫療等領域具有非常廣闊的應用前景[11]。目前文獻報道較肯定蛋清溶菌酶的熱穩定性，據報道[12]，pH 3.0時，96 ℃加熱處理15 min仍能保持87%的酶活性，然而對于微生物溶菌酶，本實驗室先前發現對其濕熱90 ℃處理5 min后，酶活只能保留56.2%[13]，此外報道的多數由海洋細菌發酵產生的溶菌酶的作用范圍為5～50 ℃[14]，說明微生物溶菌酶的熱穩定性較差。為拓寬微生物溶菌酶的應用范圍，及避免某些應用方面如飼料加工中高溫擠壓過程使得酶活損失[15]，以及達到延長微生物溶菌酶的儲存穩定期或緩慢釋放的目的，將其微膠囊化是一種行之有效的方法。

目前，微膠囊壁材中海藻酸鈉和殼聚糖均為來源豐富、天然安全的多糖類物質[16-17]，大量文獻[18-20]報道了利用此兩者靜電絡合的協同效應來包埋各類芯材物質。制備海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊操作簡單、成本低廉且條件溫和，不需要有機溶劑，尤其適合于有生物活性的蛋白質類藥物[21]，因此，是包埋微生物溶菌酶良好的載體。

本實驗即以海藻酸鈉、殼聚糖作為復合壁材，采用一步法[22]制備微生物溶菌酶微膠囊，在單因素試驗基礎上，通過響應面法優化最佳制備工藝，得到最大包埋率的條件參數，以提高微生物溶菌酶在應用中的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉、氯化鈣、冰醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 國藥集團化學試劑有限公司；殼聚糖 濰坊科海甲殼素有限公司；微生物溶菌酶（酶活5000 U/mg） 沈李科貿有限公司；溶菌酶試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

蠕動泵2000A1 上海杰恒有限公司；低速攪拌器GZ120-S 上海壘固有限公司；冷凍干燥機ADL-75F 科林集團；離心機TD5A-WS 金壇市順華儀器有限公司；THZ-82恒溫水浴鍋 金壇市精達儀器有限公司；722分光光度計 上海光學儀器進出口有限公司；SE402F電子分析天平 美國奧豪斯公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物溶菌酶微膠囊的制備

將4 mg/mL的微生物溶菌酶溶液與一定質量濃度的海藻酸鈉溶液按1∶1（V/V）混合成100 mL均勻溶液，通過蠕動泵之末端針孔勻速滴入到一定質量濃度的氯化鈣和殼聚糖的混合醋酸溶液中，待全部滴完后繼續靜置于其中固化，隨后用蒸餾水洗滌2次，用紗布瀝干，平鋪于直徑為10 cm的玻璃皿中預凍6 h后進行冷凍干燥，將干燥后的微膠囊收集，稱質量，4 ℃保存。

1.3.2 微生物溶菌酶的檢測

取0.1 g凍干微膠囊溶解在含40 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.5）溶液的離心管中6 h，待溶脹后充分碾碎，于1 000 r/min離心3 min，將上清液稀釋50倍，用溶菌酶試劑盒測酶活。即取0.2 mL上述樣液加入到2 mL溶壁微球菌混濁液中，另設空白管和標準管，37 ℃反應15 min，冰浴終止反應，于波長530 nm處以蒸餾水調零，比色，測各管吸光度，按式（1）、（2）計算溶菌酶含量和包埋率。

式中：標準管質量濃度為2.5 μg/mL，即200 U/mL；w為每0.1 g凍干微膠囊中溶菌酶含量/μg；m1為每批次凍干微膠囊總質量/g；m2為每批次微膠囊制備前添加的溶菌酶質量/g。

1.3.3 響應面試驗設計[23-24]

1.3.3.1 Plackett-Burman試驗

一步法制備海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊工藝中涉及的參數較多，在單因素試驗基礎上，取N=7的Plackett-Burman試驗設計，對海藻酸鈉質量濃度、殼聚糖質量濃度、殼聚糖脫乙酰度、殼聚糖相對分子質量、冰醋酸質量濃度、氯化鈣質量濃度、固定化時間7個因素進行考察，每個因素分別取高、低2個水平，另設2個空白，以微生物溶菌酶的包埋率為響應值Y，平行試驗3次。

1.3.3.2 最陡爬坡試驗

響應面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實值，故只有在逼近最大包埋率后才能建立有效的響應面擬合方程[25]。根據Plackett-Burman試驗結果的因素效應設計最陡爬坡試驗，得出響應面試驗因素水平的中心點。

1.3.3.3 Box-Behnken試驗

采用Box-Behnken的中心組合設計原理，對Plackett-Burman設計篩選出的重要因素和最陡爬坡設計的試驗結果得到的中心點，進行三因素三水平的響應面分析試驗，共12個析因點和3個區域中心點（零點），每組平行試驗3次，獲得最優制備工藝。通過Minitab 16.0軟件完成本試驗設計、數據分析和模型建立。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman法篩選重要因素

取7個因素的高水平及低水平值，以微生物溶菌酶包埋率為響應值Y，試驗設計見表1，各水平取值見表2。

表1 Plackett-Burman試驗設計表Table 1 Experimental design for Plackett-Burman design

表2 Plackett-Burman試驗因素及分析結果Table 2 Analysis of variance for the experimental results of Plackett-Burman dessiiggnn

由表2可知，海藻酸鈉質量濃度、殼聚糖質量濃度、冰醋酸質量濃度此3個因素對包埋率影響顯著（P＜0.05），因此作為重要因素進行進一步優化。其他因素對結果影響不大，在進一步研究中，取脫乙酰度為90%、相對分子質量為5×105的殼聚糖，氯化鈣質量濃度取2 g/100 mL，固定化時間取45 min。

2.2 最陡爬坡試驗

基于Plackett-Burman試驗結果的因素效應設計最陡爬坡試驗，得出響應面試驗因素水平的中心點。

表3 最陡爬坡試驗設計及結果Table 3 Experimental design of steepest ascent and corresponding results

由表3可知，第3組試驗微生物溶菌酶的包埋率最大，說明最優點在第3組試驗附近，故以試驗3的條件為響應面試驗因素水平的中心點，即海藻酸鈉質量濃度、殼聚糖質量濃度、冰醋酸質量濃度分別為2.1、0.3、0.3 g/100 mL，進行下一步研究。

2.3 應用響應面分析法確定重要因素的最佳水平

表4 Box-Behnken試驗參數水平Table 4 Factors and levels used in Box-Behnken design

表5 響應面分析方案及試驗結果Table 5 Experimental design and results for response surface analysis

根據最陡爬坡試驗確定的響應面試驗因素水平的中心點，進行Box-Behnken試驗，因素水平編碼如表4所示，試驗設計見表5。以微生物溶菌酶包埋率為響應值Y，對表5試驗數據進行二次多元回歸擬合后，得到預測值Y對編碼自變量X1、X2和X3的二次多項回歸方程：

Y=93.047－3.219X1＋5.819X2＋5.637X3－5.668X1

2－8.463X2

2－12.071X32＋5.285X1X2＋3.973X1X3－5.798X2X3

為檢驗方程有效性，利用分析軟件進一步對其進行分析，其系數顯著性結果見表6，方差分析見表7。

表6 回歸系數顯著性分析Table 6 Results of regression analysis

表7 模型方差分析Table 7 Analysis of variance for the regression model

由表6中一次項回歸系數的絕對值大小可以到各自變量對響應值的影響程度依次為：殼聚糖質量濃度＞醋酸質量濃度＞海藻酸鈉質量濃度。海藻酸鈉質量濃度和殼聚糖質量濃度、殼聚糖質量濃度和醋酸質量濃度交互顯著（P＜0.05），海藻酸鈉質量濃度和醋酸質量濃度交互不顯著（P＞0.05）。

從表7可知，海藻酸鈉質量濃度、殼聚糖質量濃度、醋酸質量濃度的一次項和二次項對微生物溶菌酶微膠囊中的包埋率的影響是極顯著的（P＜0.01），表明試驗因素對響應值不是簡單的線性關系。另外，此模型的P＜0.05，響應面回歸模型達到顯著水平。模型的調整確定系數R2=0.924 4，表明92.44%的數據可以由這個方程解釋。失擬項P=0.116（P＞0.05），表明該模型穩定性好。因此，該二次方程能夠較好地擬合真實的響應面，來預測微生物溶菌酶微膠囊的包埋率的變化。

2.4 響應曲面及等高線分析

將表5的試驗結果經分析軟件處理，繪制其響應面曲線及等值線圖，由圖1可以看出，當醋酸質量濃度在0.3 g/100 mL不變時，海藻酸鈉質量濃度在1.5～2.7 g/100 mL之間，微膠囊的包埋率呈現先升高后降低趨勢，海藻酸鈉質量濃度和殼聚糖質量濃度兩者交互顯著。

圖1 包埋率與海藻酸鈉質量濃度、殼聚糖質量濃度的曲面圖與等值線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of alginate and chitosan concentration on microencapsulation efficiency

圖2 包埋率與海藻酸鈉質量濃度、醋酸質量濃度的曲面圖與等值線圖Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of alginate and acetic acid concentration on microencapsulation efficiency

由圖2可以看出，當殼聚糖質量濃度保持在0.3 g/100 mL時，醋酸質量濃度在0.1～0.5 mg/100 mL間，微膠囊包埋率先上升后下降。海藻酸鈉質量濃度和醋酸質量濃度交互不顯著。

圖3 包埋率與殼聚糖質量濃度、醋酸質量濃度的曲面圖與等值線圖Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of chitosan andacetic acid concentration on microencapsulation efficiency

由圖3可知，當海藻酸鈉質量濃度保持在2.1 g/100 mL時，殼聚糖在0.1～0.5 g/100 mL間，微膠囊包埋率先上升后下降。殼聚糖質量濃度和醋酸質量濃度交互顯著。

2.5 驗證實驗

為了進一步確證計算機模擬得到最佳點的值，對所得的回歸方程取一階偏導等于零并整理得：

聯立求解，得X1=－0.110，X2=0.257，X3=0.154。代入回歸方程得Y=94.635%。又由各因素編碼與其真實值之問的關系，可求得當包埋率為94.635%時，海藻酸鈉、殼聚糖、醋酸的真實質量濃度分別為2.034、0.3514、0.330 8 g/100 mL。

為了對預測的結果進行驗證，用以上得到的最優條件進行3次平行實驗，結果見表8。

表8 試驗結果的驗證Table 8 Validation of the optimized conditions

為方便操作，分別取海藻酸鈉、殼聚糖、醋酸質量濃度為2.00、0.35、0.33 g/100 mL進行驗證，所得包埋率測量值為92.10%，與理論值接近，可見該模型可以較好的預測實際包埋情況。

3 結 論

實驗首先通過Plackett-Burman設計確定出影響微生物溶菌酶微膠囊包埋率的主要工藝參數，即海藻酸鈉質量濃度、殼聚糖質量濃度及醋酸質量濃度，再通過最陡爬坡試驗和響應面分析法對此三因素三水平得出的試驗數據進行分析，建立響應面的二次回歸擬合方程，得出最大響應值及對應的自變量編碼值，即得到海藻酸鈉、殼聚糖、醋酸的最優質量濃度分別為2.034 0、0.351 4、0.330 8 g/100 mL，包埋率為94.635%。為方便操作，質量濃度分別取海藻酸鈉2.00 g/100 mL、殼聚糖0.35 g/100 mL、醋酸0.33 g/100 mL，進行3次驗證實驗，結果得出實際包埋率為92.10%，與理論預測值基本吻合。經過優化后，微生物溶菌酶包埋率有一定提高，在實際應用中具有一定的指導意義。

[1] 張琇, 吳發興, 孫謐, 等. 海洋微生物溶菌酶體外抗菌抗病毒活性研究[J]. 中國農業科學, 2007, 40(11): 2626-2631.

[2] 盧亞萍, 潘宏濤. Aegis溶菌酶的抑菌作用及抑菌機理初步研究[J].新飼料, 2007(11): 15-17.

[3] CALLEWAERT L, van HERREWEGHE J M, VANDERKELEN L, et al. Guards of the great wall: bacterial lysozyme inhibitors[J]. Trends in Microbiology, 2012, 20(10): 501-510.

[4] 劉同軍, 徐文琳, 張玉臻. 變溶菌素研究歷史和發展前景[J]. 微生物學報, 2000, 40(2): 224-227.

[5] 鄒艷麗, 王躍軍. 海洋微生物溶菌酶的純化及性質研究[J]. 生物工程學報, 2005, 21(3): 420-424.

[6] 張玉臻. 球孢鏈霉菌溶菌酶的生產條件研究[J]. 食品與發酵工業, 1997, 23(5): 16-18.

[7] 任光文, 趙昕, 屠曉平, 等. 溶菌酶高產鏈霉菌RX-17的篩選及其特性研究[J]. 山東大學學報: 理學版, 2004, 14(3): 425-429.

[8] 李潛, 于宏偉, 郭潤芳, 等. 溶菌酶產生菌的篩選及產酶條件研究[J].河北農業大學學報, 2011, 34(1): 68-71.

[9] 張琇, 王躍軍, 孫謐, 等. 海洋細菌S-12-86的產溶菌酶條件[J]. 中國水產科學, 14(3): 425-429.

[10] 王躍軍, 孫謐, 張云波, 等. 海洋低溫溶菌酶的制備及酶學性質[J].海洋水產研究, 2000, 21(4): 54-63.

[11] 曹濤, 劉同軍, 王艷君. 微生物溶菌酶的研究及應用[J]. 中國調味品, 2011, 32(3): 23-26.

[12] 陳艷, 江明鋒, 葉煜輝, 等. 溶菌酶的研究進展[J]. 生物學雜志, 2009, 26(20): 64-66.

[13] 費國琴, 李曉暉, 寧喜斌. 等. 微生物溶菌酶酶學性質及抑菌特性研究[J]. 江蘇農業科學, 2012(9): 286-287.

[14] 王躍軍, 孫謐, 張云波, 等. 海洋低溫溶菌酶的制備及酶學性質[J].海洋水產研究, 2000, 21(4): 54-63.

[15] 焦炳華, 穆軍, 許強芝, 等. 海洋微生物來源新抗生素的研究[J]. 抗感染學, 2004(1): 1-9.

[16] WANG Wei, LIU Xiudong, XIE Yubing, et a1. Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cell implantation[J]. Materials Chemistry, 2006, 16: 3252-3267.

[17] SINHA V R, SINGLA A K, WADHAWAN S, et al. Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs[J]. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2004, 274(1): 1-33.

[18] MURATA Y, MAEDA T, MIYAMOTO E, et al. Preparation of chitosan-reinforced alginate gel beads: effect of chitosan on gel matrix erosion[J]. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 1993, 96: 139-145.

[19] 劉袖洞, 于煒婷, 王為, 等. 海藻酸鈉和殼聚糖聚電解質微膠囊及其生物醫學應用[J]. 化學進展, 2003, 20(1): 126-139.

[20] 裴哲, 朱啟忠, 韓雷強, 等. 微膠囊法固定平菇半纖維素酶[J]. 江蘇農業學報, 2010, 26(4): 838-842.

[21] 胡劍峰, 黃建恒, 司徒粵, 等. 海藻酸鈉/殼聚糖包酶微膠囊的制備及釋放機理[J]. 化工進展, 2011, 28(增刊2): 234-238.

[22] 熊何健, 馬玉嬋, 吳國宏. 茶多酚的提取及微膠囊化工藝研究[J].食品科學, 2005, 26(10): 137-140.

[23] FRANCES F, SABU A, NAMPOOTHIRI K M, et al. Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the production of α-amylase by Aspergillus oryzae[J]. Biochemical Engineering Journal, 2003, 15(2): 107-115.

[24] FAN Yaoting, LI Chenlin, LAY Jiunn, et al. Optimization of initial substrate and pH levels for germination of sporing hydrogen producing anaerobes in cow dung cordially, compost[J]. Bioresource Technology, 2004, 91: 189-193.

[25] 楊唐儀, 李朝霞, 丁成. 響應面法優化海藻酸鈉-殼聚糖-粉末活性炭生物微膠囊制備工藝[J]. 化學通報, 2011, 74(3): 252-258.

Optimization of Preparation Conditions for Microbial Lysozyme Microcapsule by Response Surface Methodology

FEI Guo-qin, NING Xi-bin, LI Xiao-hui*, SONG Juan, LI Wen-li
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

In this work, response surface methodology (RSM) was applied to optimize the conditions for preparing microbial lysozyme microcapsule by using sodium alginate and chitosan as coating materials. First, Plackett-Burman design (PBD) was used to evaluate the effects of seven preparation conditions on the microencapsulation efficiency of microbial lysozyme, and the concentrations of sodium alginate, chitosan and acetic acid were identified as main affecting factors. Then the steepest ascent method was adopted to access the optimal region of the significant factors. At last, the optimal conditions for microcapsule preparation were obtained from the regression equation established using Box-Behnken experimental design as follows: sodium alginate, 2.00 g/100 mL; chitosan, 0.35 g/100 mL; and acetic acid, 0.33 g/100 mL. Under these optimal conditions, the maximum predicted microencapsulation efficiency was 94.635% and the experimentally measured value was 92.10%.

microcapsule; alginate; chitosan; response surface method; microbial lysozyme

TS201.3

A

1002-6630（2014）04-0011-05

10.7506/spkx1002-6630-201404003

2013-03-03

上海市教育委員會科研創新項目（10YZ126）；上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）；上海海洋大學博士啟動基金項目（A-2400-09-0146）

費國琴（1988—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：feiguoqin0528@163.com

*通信作者：李曉暉（1975—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：xhli@shou.edu.cn