納米免疫磁分離-實時熒光聚合酶鏈式反應快速檢測海產品中副溶血性弧菌

張 蕾，曾 靜*，魏海燕，馬 丹，程晉霞，張西萌，張海予

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026；2.北京農學院，北京 102206）

納米免疫磁分離-實時熒光聚合酶鏈式反應快速檢測海產品中副溶血性弧菌

張 蕾1,2，曾 靜1,*，魏海燕1，馬 丹1，程晉霞2，張西萌1，張海予2

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026；2.北京農學院，北京 102206）

采用副溶血性弧菌單克隆抗體、納米免疫磁分離技術，結合實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，建立海產品中副溶血性弧菌納米免疫磁分離-實時熒光PCR檢測方法。副溶血性弧菌納米免疫磁珠在菌體濃度為103CFU/mL水平時，對副溶血性弧菌的捕獲率達到74%。在純培養、無需增菌情況下，該方法檢測靈敏度達到140 CFU/mL；通過134株副溶血性弧菌和74株非目標菌的測試，實時熒光PCR技術具有良好的特異性；在食品基質添加實驗中，其檢測限為2 CFU/25 g樣品，增菌時間縮短到8 h。

副溶血性弧菌；免疫磁分離；實時熒光聚合酶鏈式反應

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus，Vp）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，廣泛分布于近海區域、鹽湖及魚、貝類等海產品中，是引起食物中毒的重要病原菌，可導致患者出現腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發燒等典型胃腸炎反應，嚴重者可引起敗血癥，危及生命[1-2]。副溶血性弧菌引起的疾病已成為我國嚴重的食源性公共衛生問題之一，由該菌引發的食品中毒案例居微生物食源性疾病暴發案例之首，且呈上升趨勢[3-6]。目前副溶血性弧菌的檢驗多采用傳統方法，周期長（一般需要5～7 d）、過程繁瑣。納米免疫磁珠（nanoimmunomagnetic beads，Nano-IMB），又稱納米免疫磁性微球菌，是直徑為0.05～4 btm、具有超順磁性的微珠，表面經化學修飾后可與特異性抗體結合。其作為免疫磁性分離（nano-immunomagnetic separation，Nano-IMS）的材料，在分子、細胞和個體水平上為食源性致病菌檢測和疾病的診斷等提供新材料、新技術和新方法[7-10]。將Nano-IMS技術與實時熒光聚合酶鏈式反應（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）技術結合，可有效的富集菌體、縮短檢測時間、提高檢出率；同時，由于免疫磁珠可特異性捕獲目標菌體，有效去除核酸擴增抑制成分、提高擴增效率。本研究建立了Nano-IMS-RT-PCR檢測方法，并對該方法的特異性和靈敏度進行了驗證，旨在縮短副溶血性弧菌檢測時間、提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用菌株及編號如下：副溶血性弧菌ATCC 17802、副溶血性弧菌ATCC 1.1997、創傷弧菌ATCC 1758、河流弧菌ATCC 1.1611、擬態弧菌ATCC 1.1969、溶藻弧菌ATCC 1.1607、溶藻弧菌ATCC 1833、費尼斯弧菌ATCC 1.1612、解蛋白弧菌ATCC 1.1826、單增李斯特氏菌ATCC 15313、格氏李斯特氏菌ATCC 700545、西爾李斯特氏菌ATCC 35967、英諾克李斯特氏菌ATCC 33090、默氏李斯特氏菌ATCC 2540、伊氏李希特氏菌ATCC 19119、威氏李斯特氏菌ATCC 35897、肺炎克雷伯氏菌CGMCC 1.1736、陰溝腸桿菌CGMCC 1.57、臘樣芽孢桿菌ATCC 11778、表皮葡萄球菌ATCC 12228、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC 50001、馬紅球菌ATCC 6936、福氏志賀氏菌CMCC 51571、痢疾志賀氏菌CMCC 51252、阪崎腸桿菌ATCC 29544、枸櫞酸桿菌CMCC 48017、丙型溶血性鏈球菌CMCC 32206、乙型溶血性鏈球菌CMCC 32210、小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC 52212、大腸桿菌ATCC 25922、腸炎沙門氏菌CMCC 50041、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、鼠傷寒沙門氏菌CMCC 50115、銅綠假單胞菌ATCC 15442、糞腸球菌CGMCC 1.2135、副溶血性弧菌自分離株1～132、霍亂弧菌自分離株1～40和75。

TaqMan基因表達混合液（2×） 美國Life Technologies公司；大豆酪蛋白瓊脂培養基（trytone soya agar，TSA）、堿性蛋白胨水培養基（alkaline peptone water，APW）、腦心浸液瓊脂培養（brain-heart infusion agar，BHI）、弧菌顯色培養基 北京陸橋有限責任公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 儀器與設備

磁力架 美國Dynalco公司；7900型實時熒光定量PCR儀 美國Life Technologies公司；恒溫加熱塊、微量移液器德國Eppendorf公司；恒溫培養箱 美國3M公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1 0×磷酸緩沖溶液：8 0 g N a C l、2 9 g NaH2PO4·12H2O、2 g KCl，2 g KH2PO4，先溶于900 mL去離子水，待充分溶解后再加去離子水至1 000 mL，室溫保存，使用時進行1∶10（V/V）稀釋。

1.3.2 副溶血性弧菌納米免疫磁珠的制備

采用本實驗室制備的副溶血性弧菌單克隆抗體[11]，委托國家納米中心制備副溶血性弧菌納米免疫磁珠（Nano-IMB-Vp）。

1.3.3 Nano-IMB-Vp分離副溶血性弧菌

取2.5 mg Nano-IMB-Vp于1 mL無菌離心管中，置于磁分離架上，吸附1 min，棄上清液，用30 μL磷酸緩沖溶液重懸Nano-IMB-Vp，加入1 mL菌懸液，300 r/min條件下室溫孵育30 min，置于磁力架上吸附1 min，棄上清液，沉淀用磷酸緩沖溶液洗滌2次，每次30 s，重懸于50 μL無菌水中備用。

1.3.4 平板菌落計數

參照GB/T 4789.2—2010《食品微生物學檢驗：菌落總數測定》[12]，將副溶血性弧菌ATCC 17802接種到APW培養基，36 ℃過夜培養，制備10倍系列稀釋菌懸液。用冷卻至46 ℃的TSA瓊脂培養基傾注平皿，吸取1 mL菌懸液于無菌平皿內，36 ℃培養（24±2）h后進行計數。每個稀釋度做2個平行。

1.3.5 Nano-IMB-Vp捕獲效率的測定

按照1.3.4節方法制備參比菌株ATCC 17802菌懸液并進行平板計數。選取102～103CFU/mL的6種非目標菌株（霍亂弧菌-75、創傷弧菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）菌懸液進行捕獲率測定。取1 mL濃度為8.4×102CFU/mL的Vp菌懸液，分別與0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg和3.5 mg的Nano-IMB-Vp結合，吸附后計數上清液的菌落數，Nano-IMB-Vp捕獲后的上清液再進行菌落計數，根據以下公式計算其捕獲率。每次實驗設置3個平行，重復2次。

1.3.6 Nano-IMB-Vp捕獲特異性的測定

張蕾等[11]采用74株非目標菌對該Vp單克隆抗體進行了特異性驗證。現采用6株非目標菌（霍亂弧菌-7、創傷弧菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌）對Nano-IMB-Vp的捕獲特異性進行測定。

1.3.7 菌體DNA的提取

采用熱裂解法提取DNA，取1 mL菌懸液，10 000 r/min離心2 min，加入50 μL無菌水，沸水裂解10 min，冰浴5 min，相同條件離心2 min，上清液即為DNA模板，－20 ℃保存備用。

1.3.8 RT-PCR方法的建立

RT-PCR引物：針對副溶血性弧菌tlh基因，用Primer Express 3.0軟件設計RT-PCR引物。引物序列為：上游引物Vp-F（5’-CCGCTCATCGTCTGTCGATT-3’）、下游引物Vp-R（5’-GCACCAGACGCTGCACACT-3’）和探針Vp-T（5’-FAM-CATGTACACCCACGCATTGCGCTCTTAMRA-3’）。

25 μL反應體系：2×TaqMan基因表達混合液12.5 μL，Vp-F、Vp-R、Vp-T各0.4 μmol/L，DNA模板3 μL，無菌水6.5 μL。反應程序為：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共40個循環。

1.3.9 RT-PCR方法的特異性測定

采用134株副溶血性弧菌（實驗室分離株、2株ATCC參比菌株）、41株霍亂弧菌實驗室分離株、33株非目標菌株（包括創傷弧菌ATCC 1758、河流弧菌ATCC 1.1611、擬態弧菌ATCC 1.1969、溶藻弧菌ATCC 1.1607、溶藻弧菌ATCC 1833、費尼斯弧菌ATCC 1.1612、解蛋白弧菌ATCC 1.1826），對于RT-PCR引物特異性進行測試。

1.3.10 Nano-IMS-RT-PCR方法的建立和靈敏度的確定

按照1.3.4節方法制備ATCC 17802菌懸液，選取7個連續梯度的菌懸液，每個梯度取10 mL菌液，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，用1 mL無菌生理鹽水重懸菌體，用Nano-IMB-Vp富集菌體，煮沸法提取DNA，進行RTPCR檢測（n=2）。同時，將選取的每個稀釋度菌懸液劃線接種至弧菌顯色培養基，按照GB/T 4789.7—2008《食品微生物學檢驗：副溶血性弧菌檢驗》[13]方法進行檢驗。

1.3.11 人工模擬樣品的檢測

稱取經檢測無Vp的扇貝樣品25 g于均質袋中，加入225 mL APW培養基，胃蠕動器擊拍混勻30 s，制備多份樣品勻漿液。每份勻漿液添加1 mL經梯度稀釋的Vp菌懸液，添加的菌體濃度分別為23 CFU/mL和2 CFU/mL，另設不添加Vp的樣品基質為陰性對照，36 ℃培養，在2、4、6、8、10、12 h取樣，分別采用Nano-IMS-RT-PCR、Nano-IMS結合GB/T 4789.7—2008方法、RT-PCR以及GB/T 4789.7—2008方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 Nano-IMB-Vp捕獲效率的測定

表1 Nano-IMB-Vp的捕獲率Table 1 Capture rate of Nano-IMB-Vp

隨著Nano-IMB-Vp用量的增加，捕獲效率不斷提高，當其用量為2.5、3.0 mg和3.5 mg時，捕獲效率達到74%左右，表明當磁珠用量為2.5 mg以上時，其捕獲效率沒有大幅增加。因此，后續實驗均采用2.5 mg Nano-IMB-Vp。

2.2 Nano-IMB-Vp捕獲特異性的測定

本實驗通過捕獲實驗對Nano-IMB-Vp特異性的驗證結果表明，Nano-IMB-Vp對6株非目標菌的捕獲率均在13%以下，因此Nano-IMB-Vp對6種非目標菌不存在特異性吸附。

2.3 RT-PCR方法的特異性

RT-PCR引物特異性的測試結果見表3。結果表明，所設計的RT-PCR引物具有良好的特異性，與非目標菌不存在交叉反應。

表3 RT-PCR方法特異性Table 3 Specificity of RT-PCR

2.4 Nano-IMS-RT-PCR檢測靈敏度

如圖1所示，該方法的檢測靈敏度為1.4×102CFU/mL，比傳統檢測方法高100倍。

2.5 Nano-IMS-RT-PCR檢測人工模擬樣品

在經傳統方法驗證不含目標菌的扇貝樣品中進行人工添加實驗，結果見表4。當添加菌體濃度為23 CFU/25 g樣品時，Nano-IMS-RT-PCR的檢出時間是6 h，Nano-IMS-Vp結合GB/T 4789.7—2008方法檢出時間是8 h；在不用Nano-IMB-Vp富集菌體的情況下，RT-PCR檢測方法的檢出時間是10 h，GB/T 4789.7—2008方法檢出時間是12 h。當添加菌體濃度為2 CFU/25 g樣品時，Nano-IMS-RT-PCR的檢出時間是8 h，Nano-IMS-Vp結合GB/T 4789.7—2008方法檢出時間是10 h；在不用Nano-IMBVp富集菌體的情況下，RT-PCR檢測方法的檢出時間是12 h，GB/T 4789.7—2008方法在增菌12 h時未檢出。

表4 扇貝模擬樣品檢測結果Table 4 Results obtained by Nano-IMS-RT-PCR for the detection of spiked blank samples

3 討 論

利用具有良好特異性的Vp單克隆抗體制備Nano-IMB-Vp，確定了在菌體濃度為103CFU/mL時，Nano-IMB-Vp用量為2.5 mg/mL時，對Vp的捕獲效率達到74%。采用6株非目標菌株對Nano-IMB-Vp的特異性進行了進一步驗證，結果顯示非目標菌的吸附率在13%以下，為非特異性吸附。使用2株ATCC Vp菌株、132株本實驗室分離的菌株、41株自分離霍亂弧菌和33株非目標菌對RT-PCR方法的引物進行了特異性驗證，結果表明所設計的RT-PCR引物具有良好的特異性，與弧菌屬內和屬外的非目標菌均不存在交叉反應。在純培養條件下，Nano-IMS-RT-PCR方法的檢測靈敏度為140 CFU/mL。基質添加實驗結果表明，在低添加水平，即每25 g樣品中添加2 CFU Vp時，Nano-IMS-RT-PCR方法的增菌時間只需8 h，Nano-IMS-RT-PCR結合GB/T 4789.7—2008方法的增菌時間需要10 h，RT-PCR方法縮短了4 h，而在不使用Nano-IMB-Vp富集菌體的情況下，增菌12 h時GB/T 4789.7—2008方法未檢出。由以上結果得出：Nano-IMBVp可以高效、特異性富集副溶血性弧菌，本研究所建立的Nano-IMS-RT-PCR方法縮短了檢測時間。

Nano-IMB不僅可以富集目標菌體，亦可有效的去除PCR反應抑制劑，如樣品中存在的酚類化合物、脂肪、糖原或微生物代謝產物，這些物質抑制Taq聚合酶的活性，致使RT-PCR檢測靈敏度降低[14-17]。但IMS技術本身也存在一些較難克服的問題，例如用于包被磁珠的單克隆抗體的效價，在抗體批次間易出現波動，直接影響Nano-IMB對目標菌的捕獲率；其次在不同的標本性狀及雜菌污染程度下，Nano-IMB和目標微生物間的相互作用在一定程度上會受到影響，降低捕獲率[18]，如雜菌污染較多的牛肉類制品就不宜采用IMS技術分離目標菌[19-25]。

本研究將納米免疫磁珠與RT-PCR技術相結合，經實驗證實，適用于含有食品基質的增菌液檢測。下一步將進行大批量實際樣品檢測，以充分驗證Nano-IMS-RT-PCR檢測方法在實際檢測工作中的應用價值和應用前景。

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A Novel Method of Nano-Immunomagnetic Separation-Real Time-Polymerase Chain Reaction for Detecting Vibrio parahaemolyticus in Seafoods

ZHANG Lei1,2, ZENG Jing1,*, WEI Hai-yan1, MA Dan1, CHENG Jin-xia2, ZHANG Xi-meng1, ZHANG Hai-yu2
(1. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China; 2. Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

A novel method using monoclonal antibody of Vibrio parahemolyticus, nano-immunomagnetic separation (Nano-IMS) plus real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) was established for detecting Vibrio parahemolyticus in seafoods. The nano-immunomagnetic beads (Nano-IMB) created showed a capture rate for Vibrio parahemolyticus of 74% at a bacterial concentration of 103CFU/mL. The sensitivity of Nano-IMS-PCR was 140 CFU/mL under pure culture conditions without enrichment. The RT-PCR method was highly specific for 134 Vibrio parahemolyticu and 74 non-target bacteria. The detection limit of the method reached 2 CFU/25 g in artificial food samples. The enrichment time was shortened to 8 h.

Vibrio parahaemolyticus; nano-immunomagnetic separation; real time-polymerase chain reaction

TS207.4

A

1002-6630（2014）04-0107-04

10.7506/spkx1002-6630-201404022

2013-05-15

國家質檢總局公益性行業科研專項（201110034）；國家質檢總局科技計劃項目（2009IK184）

張蕾（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與控制。E-mail：zlei8765@163.com

*通信作者：曾靜（1963—），女，研究員，博士，研究方向為食品微生物學。E-mail：zengj@bjciq.gov.cn