超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證食用貝類(lèi)中多種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素

韓 深，劉 鑫，李建輝，王珮玥，古 瑾，張朝暉*

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證食用貝類(lèi)中多種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素

韓 深，劉 鑫，李建輝，王珮玥，古 瑾，張朝暉*

（北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京 100026）

建立超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜快速篩查和確證貽貝、牡蠣、蚌類(lèi)、扇貝等食用貝類(lèi)及其制品中3種天然形式的原多甲藻酸貝類(lèi)毒素的檢測(cè)方法。樣品中的原多甲藻酸采用乙腈-水體系均質(zhì)提取，應(yīng)用改進(jìn)型QuEChERS技術(shù)凈化，在乙腈-水（含5 mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸）體系經(jīng)Acquity HSS T3柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素的基線分離。該方法基于電噴霧正離子模式，采用高分辨質(zhì)譜一級(jí)全掃描和數(shù)據(jù)依賴(lài)掃描，對(duì)食用貝類(lèi)及其制品樣品中的原多甲藻酸貝類(lèi)毒素進(jìn)行檢測(cè)。3種貝類(lèi)毒素的定量限均為10 μg/kg（RSN＞10）；在10～500 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。應(yīng)用該方法對(duì)國(guó)內(nèi)外多個(gè)地區(qū)的貝類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行了篩查及確證，其中部分樣品檢出原多甲藻酸貝類(lèi)毒素。該方法靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、快捷，適用于食用貝類(lèi)及其制品中多種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素的篩查分析。

原多甲藻酸貝類(lèi)毒素；超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜；QuEChERS

自20世紀(jì)末期，隨著全球工業(yè)化進(jìn)程飛速發(fā)展，海洋環(huán)境遭受?chē)?yán)重污染，其中由有毒赤潮產(chǎn)生的藻毒素成為污染海水養(yǎng)殖環(huán)境的新要素，嚴(yán)重威脅到水產(chǎn)品食用安全[1]。原多甲藻酸貝類(lèi)毒素（azaspiracids shellfish toxins，AZAs）是近年來(lái)先于歐洲發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新型聚醚類(lèi)生物毒素[2]，1995年在愛(ài)爾蘭Killary海灣的紫貽貝中首次被檢測(cè)到，它是一種具有6,5,6-三螺環(huán)和環(huán)胺結(jié)構(gòu)的親脂性聚醚類(lèi)海洋生物毒素[3-4]，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1。

目前已確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的原多甲藻酸貝類(lèi)毒素已有11種，其中屬AZA-1、AZA-2及AZA-3是最常見(jiàn)且毒性最大的3種[3,5]。AZAs主要引起人體胃腸道紊亂，通常在進(jìn)食12～24 h后發(fā)作，此外，AZAs還能導(dǎo)致多種器官損傷，且這類(lèi)毒素相對(duì)比較穩(wěn)定，在酸性、堿性和高溫條件都不能使其毒性降低[6]。據(jù)估算，當(dāng)攝入AZA-1劑量為23 ?g/人和86 ?g/人時(shí)，致毒概率分別為5%和95%，對(duì)人的平均致毒劑量為51.7 ?g/人[7]。2004年，由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和政府間海洋委員會(huì)共同組建了服務(wù)于漁業(yè)和水產(chǎn)品法典委員會(huì)的雙殼軟體生物毒素工作組，將原多甲藻酸歸為八大類(lèi)貝類(lèi)生物毒素之一[8]。鑒于原多甲藻酸貝類(lèi)毒素的危害性，歐盟立法機(jī)構(gòu)確立雙殼軟體動(dòng)物中AZAs的最大允許限量是160 ?g/kg[9]。

目前報(bào)道的原多甲藻酸的檢測(cè)方法主要包括：生物測(cè)試法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。采用生物法進(jìn)行檢測(cè)，往往會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確[10]。液相色譜技術(shù)是分析生物毒素的一類(lèi)高效的手段，但由于AZAs毒素在波長(zhǎng)大于210 nm的范圍缺少特征吸收峰，因此目前還未見(jiàn)相關(guān)采用液相色譜分析AZAs的報(bào)道。隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)的發(fā)展和不斷完善，人們逐漸嘗試建立了一些LC-MS分析方法來(lái)測(cè)定這類(lèi)毒素[11-l6]，由于貝類(lèi)海產(chǎn)品及其制品基質(zhì)較為復(fù)雜，采用單級(jí)質(zhì)譜測(cè)定的結(jié)果可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜由于具有質(zhì)量分辨率高和精確分子質(zhì)量的功能，最近成為人們研究和應(yīng)用的新熱點(diǎn)。該方法在全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)可以根據(jù)檢測(cè)需求反復(fù)調(diào)用，因此其可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜方法無(wú)法應(yīng)對(duì)法規(guī)更新頻繁的不足；其數(shù)據(jù)依賴(lài)性掃描可以在篩查的同時(shí)，通過(guò)碎片離子進(jìn)行定性確證。

本實(shí)驗(yàn)基于QuEChERS前處理技術(shù)，運(yùn)用超高效液相色譜和高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)貽貝、牡蠣、蚌類(lèi)、扇貝等食用貝類(lèi)及其制品中3種天然形式的原多甲藻酸貝類(lèi)毒素進(jìn)行分析測(cè)定。相比低分辨率質(zhì)譜，運(yùn)用高分辨質(zhì)譜一級(jí)全掃描和數(shù)據(jù)依賴(lài)掃描進(jìn)行檢測(cè)分析，在很大程度上降低了出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的可能性，使檢測(cè)更加準(zhǔn)確。同時(shí)，采用超高壓液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離，不但節(jié)省試劑消耗，更提高了分析效率，3個(gè)毒素化合物在10 min內(nèi)可完成分析，較好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)貽貝、蚌類(lèi)等的可食用貝類(lèi)及其制品基體中3種AZAs貝類(lèi)毒素的分析與測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

貽貝、牡蠣、象拔蚌和扇貝4種食用貝類(lèi)及其制品市售。

3種原多甲藻酸標(biāo)準(zhǔn)品AZA-1、AZA-2和AZA-3（純度均≥99.0%） 美國(guó)Supelco公司（表1）；乙腈、乙酸銨、甲醇、乙酸乙酯（均為色譜純） 美國(guó)Fisher公司；甲酸（色譜純） 美國(guó)Tedia公司；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C18基質(zhì)固相分散萃取分散劑 美國(guó)Agilent公司；微纖維濾紙 美國(guó)Vicam公司；微孔濾膜（0.2 μm） 美國(guó)Whatman公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ）經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過(guò)濾。用甲醇配制3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－20 ℃條件下保存，保存期為6個(gè)月；配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)，根據(jù)要求將儲(chǔ)備液稀釋成不同質(zhì)量濃度，于－20 ℃條件下保存，工作曲線現(xiàn)用現(xiàn)配。

Orbitrap超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientif c公司；高速均質(zhì)機(jī) 美國(guó)Waring公司；離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；漩渦混勻器 德國(guó)IKA公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；Milli-Q超純水裝置 美國(guó)Millipore公司。

表1 3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品信息Table 1 Information about 3 azaspiracid standards

1.2 方法

1.2.1 色譜-質(zhì)譜條件

1.2.1.1 色譜條件

色譜柱：Acquity HSS T3柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）和水溶液（含5 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）（B）；流速：250 μL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。梯度洗脫程序：0～1 min，20%～50% A；1～6 min，50%～90% A；6～7 min，90% A；7～7.5 min，90%～20% A。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）；掃描方式：正離子掃描；鞘氣流量：35 arb；輔助氣流量：6 arb；噴霧電壓：4.8 kV；毛細(xì)管溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：30 V；透鏡電壓：55 V；分辨率：60 000；HCD相對(duì)碰撞能量：23%；鞘氣、輔助氣、C-trap碰撞氣類(lèi)型：氮?dú)狻?/p>

1.2.2 樣品前處理

由于AZAs在貝類(lèi)的肌肉和內(nèi)臟等組織中的富集程度各不相同，如AZA-1主要分布于消化腺，而AZA-3則主要分布于消化腺以外的其他組織[3]，因此在取樣時(shí)，應(yīng)取除外殼的整個(gè)部分（包含肌肉和內(nèi)臟）作為試樣，以確保樣品的均一性和代表性。

1.2.2.1 試樣制備

用尖銳物品將試樣去殼，將沙土及其他固體顆粒用清水沖洗去掉，瀝干后稱(chēng)取200 g洗凈的樣品，置于潔凈的密封袋中，放入－20 ℃的冰箱中保存，避免試樣間的交叉污染。

可直接食用的樣品直接稱(chēng)取即可。

1.2.2.2 提取和凈化

準(zhǔn)確稱(chēng)取制備好的試樣10 g（精確至0.01 g）于均質(zhì)杯中，分別加入25 mL 85%乙腈-水提取液，5 g無(wú)水硫酸鎂和2 g氯化鈉，在20 000 r/min條件下均質(zhì)60 s，用微纖維濾紙過(guò)濾，取10 mL濾液至離心管中，加入0.5 g C18基質(zhì)固相分散萃取凈化劑和1 g無(wú)水硫酸鎂，旋渦振蕩1 min，7 000 r/min離心5 min，取5 mL清液移至錐形瓶中，40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，以0.8 mL乙腈和0.2 mL水溶解，旋渦振蕩30 s，過(guò)0.2 μm微孔濾膜，待儀器分析測(cè)定。

1.2.3 空白實(shí)驗(yàn)及回收率實(shí)驗(yàn)

選用不含上述3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素的扇貝樣品，分別添加3個(gè)水平（50、75 μg/kg和100 μg/kg）的原多甲藻酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按上述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率結(jié)果。

選取純水代替試樣，按照上述步驟進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，原多甲藻酸貝類(lèi)毒素是一類(lèi)脂溶性聚醚化合物，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)分別考察乙酸乙酯、甲醇、乙腈3種提取液的提取效率，結(jié)果表明，乙腈的提取效率相比較好。但由于貝肉中富含大量的蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)，使用100%乙腈進(jìn)行提取時(shí)，會(huì)增加粗提液中干擾雜質(zhì)的比例，給凈化步驟增加難度，因此，實(shí)驗(yàn)還比較了85%乙腈-水體系的提取效果，結(jié)果表明，85%的乙腈-水體系的提取效果與乙腈體系相當(dāng)，但更有利于凈化，見(jiàn)表2。

表2 加標(biāo)量均為100 g/kg的牡蠣樣品在不同提取條件下3種AZAs的檢測(cè)結(jié)果（ =6）Table 2 Recovery of 3 AZAs extracted from oyster samples spiked at 100 g/kg by different methods under different conditions ( =6) μg/kg

常見(jiàn)的樣品提取方式主要有振蕩提取、均質(zhì)提取、超聲提取等，實(shí)驗(yàn)分別考察不同提取方式對(duì)提取的影響，且在同一條件下，還考察了提取時(shí)間和溫度的影響，結(jié)果表明，均質(zhì)提取的效果較好，延長(zhǎng)提取時(shí)間在一定程度上能夠幫助提高提取效率，提取溫度對(duì)效率的影響不顯著，見(jiàn)表2。

通過(guò)正交試驗(yàn)最終確定了前處理?xiàng)l件，室溫條件下，以乙腈-水溶液作為提取液，采用高速均質(zhì)儀器將樣品均質(zhì)60 s，待凈化。

2.2 分散劑和鹽的用量對(duì)提取效率的影響

QuEChERS凈化技術(shù)是一種通用性強(qiáng)、快速且簡(jiǎn)便的前處理方法，近幾年來(lái)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、毒素等檢測(cè)中[17-22]，本實(shí)驗(yàn)以貝類(lèi)樣品的基質(zhì)特點(diǎn)為基礎(chǔ)，參照QuEChERS的基本原理進(jìn)行了改進(jìn)，并得到了較為滿意的結(jié)果。

圖1 MgSO4加入量（A）和NaCl加入量（B）對(duì)4種貝類(lèi)產(chǎn)品基質(zhì)中AZA-1提取效率的影響Fig.1 Effects of the amounts of added MgSO4and NaCl on extraction efficiency of AZA-1 in 4 shellfish matrixes spiked at 100 ?g/kg

為了幫助提高提取效率，實(shí)驗(yàn)加入了無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉。無(wú)水硫酸鎂能夠幫助目標(biāo)化合物在提取溶液中更好的分散，使提取更加容易；氯化鈉則能夠使溶液體系中的水趨于相飽和，促使目標(biāo)化合物分散至有機(jī)相并有助于水和乙腈相分層，從而提高提取效率[23-27]。實(shí)驗(yàn)分別考察了無(wú)水硫酸鎂和氯化鈉的加入量對(duì)提取效率的影響，結(jié)果表明，5 g無(wú)水硫酸鎂和2 g氯化鈉的加入即能夠獲得較好地提取效率，見(jiàn)圖1。

2.3 凈化方式的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用了基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)進(jìn)行凈化處理，分析比較Florisil、C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）等幾種常用凈化劑的凈化效果[28-34]，F(xiàn)lorisil作為強(qiáng)極性吸附劑，無(wú)法去除提取液中的脂類(lèi)雜質(zhì)，AZAs的回收率偏低；GCB通常用于去除色素成分，因其可吸附較強(qiáng)的帶苯環(huán)官能團(tuán)的化合物[35]，且AZAs的結(jié)構(gòu)中含有大量苯環(huán)，因此3種AZAs的回收率小于40%；PSA能有效去除基質(zhì)中的脂肪酸和甾醇類(lèi)基質(zhì)，但考慮到PSA作為堿性吸附填料對(duì)酸性化合物有較強(qiáng)吸附作用，AZAs恰好屬于酸性化合物，因此吸附較為牢固，若要使用該類(lèi)型的凈化劑，提取時(shí)需添加一定的酸以減少損失[36]；C18可有效去除脂類(lèi)、糖類(lèi)等親脂型雜質(zhì)，對(duì)AZAs這類(lèi)化合物的適用性較好，但過(guò)量的C18也會(huì)吸附目標(biāo)化合物而使回收率降低，因此，需要對(duì)C18凈化劑的使用量進(jìn)行優(yōu)化。幾種凈化劑各有特點(diǎn)，需要在檢測(cè)靈敏度、最佳凈化效果和合理回收率之間尋求平衡點(diǎn)。因此，實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化最終確定了使用C18凈化劑（按照實(shí)驗(yàn)確定的最終前處理步驟，每20 g樣品加入1 g凈化劑），并配以1 g無(wú)水硫酸鎂可以達(dá)到較好的凈化效果。

2.4 色譜條件的優(yōu)化

圖2 3種AZAs的參考色譜圖Fig.2 Chromatograms of three AZAs standards

為了獲得目標(biāo)化合物最好的色譜分析效果，考察了乙腈-水和甲醇-水兩種混合溶劑體系作為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)化合物的色譜行為。結(jié)果表明，使用甲醇-水體系作為流動(dòng)相時(shí)，85%以上比例的甲醇才可將目標(biāo)化合物洗脫下來(lái)，當(dāng)甲醇比例達(dá)到90%時(shí)，3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素就無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離了，由于乙腈的洗脫能力較強(qiáng)，當(dāng)采用乙腈-水體系作為流動(dòng)相時(shí)，3種AZAs在7 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)基線分離，見(jiàn)圖2。

2.5 質(zhì)譜條件的確定

根據(jù)歐盟2002/657/EC指令，采用三重四極桿質(zhì)譜儀的SRM模式對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行確證需要至少兩個(gè)碎片離子，質(zhì)譜儀屬于高分辨質(zhì)譜儀，因此，僅需要一個(gè)高分辨母離子和一個(gè)高分辨子離子就可以滿足對(duì)目標(biāo)化合物的確證要求。在本研究中，將全掃描模式的母離子作為定量離子，將峰豐度最高的HCD數(shù)據(jù)依賴(lài)性掃描碎片離子作為定性離子，并與理論值進(jìn)行了對(duì)照，見(jiàn)表3。

本研究采用電噴霧離子源正離子模式，通過(guò)總離子流掃描可以看出，3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素形成的準(zhǔn)分子離子峰中[M＋H]＋峰豐度最高。采用HCD數(shù)據(jù)依賴(lài)性掃描得到多個(gè)碎片離子，形成的碎片離子中[M＋H－H2O]＋的響應(yīng)最高，因此選作為定性離子，見(jiàn)圖3。

表3 AZA-1、AZA-2和AZA-3的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 3 UPLC-MS/MS parameters of AZAs-1, 2 and 3

圖3 扇貝樣品中添加水平為10 ?g/kg的3種AZAs參考二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS2fragmentation of 3 AZAs in scallops at spiked level of 10 ?g/kg

2.6 線性范圍、測(cè)定低限

3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素采用基質(zhì)曲線-外標(biāo)法進(jìn)行定量。用空白樣品提取液配制質(zhì)量濃度為10～500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/kg）和定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，所得相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。根據(jù)10倍信噪比（RSN）確定化合物定量限（LOQ）。樣品中3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素的LOQs均為10 μg/kg，表4列出了線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和LOQs。

表4 扇貝中AZAs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和LOQsTable 4 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and LOQs for 3 AZAs spiked in scallops

2.7 精密度和回收率

經(jīng)查閱，歐盟確立雙殼軟體動(dòng)物中AZAs的最大允許限量為160 μg/kg[9]，實(shí)驗(yàn)選用不含上述3種毒素的貝類(lèi)產(chǎn)品及其制品為空白樣品，分3個(gè)水平進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析并測(cè)定其精密度及回收率。3種AZAs在3個(gè)水平的添加回收率范圍均在76%～103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%（n=6），滿足分析的要求，見(jiàn)表5。

表5 混合貝類(lèi)樣品基質(zhì)中3種AZAs的回收率和精密度（n =6）Table 5 Recovery ranges and precision of 3 AZAs in mixed shellfish matrixes (n = 6)

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

表6 17份樣品測(cè)定結(jié)果Table 6 Results obtained by the established method for the determination of AZAs in 17 samples μg/kg

采用研究建立的方法對(duì)共17份市售和進(jìn)口貝類(lèi)產(chǎn)品及其制品進(jìn)行了測(cè)定，其中3份樣品檢出了AZAs，其中有一份樣本同時(shí)檢出了AZA-1和AZA-2，另外兩份只檢出AZA-1，但均未超過(guò)歐盟制定的安全限量標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表6。

3 3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，通過(guò)改進(jìn)QuEChERS技術(shù)和基質(zhì)分散固相萃取凈化技術(shù)可有效去除基質(zhì)中的各類(lèi)雜質(zhì)，消除干擾，采用超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定貽貝、牡蠣、蚌類(lèi)、扇貝等食用貝類(lèi)及其制品中3種原多甲藻酸貝類(lèi)毒素具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，本方法的測(cè)定低限能夠滿足國(guó)際上對(duì)該類(lèi)項(xiàng)目的限量要求，適用于分析和測(cè)定食用貝類(lèi)及其制品中原多甲藻酸類(lèi)貝類(lèi)毒素。

[1] 周名江, 于仁成. 有害赤潮的形成機(jī)制、危害效應(yīng)與防治對(duì)策[J].自然雜志, 2007, 29(2): 72-77.

[2] JAMES K J, MORONEY C, RODEN C, et al. Ubiquitous ‘benign’alga emerges as the cause of shellf sh contamination responsible for the human toxic syndrome, azaspiracid poisoning[J]. Toxicon, 2003, 41(2): 145-151.

[3] RAFAWL S, URBAN T, UWE J, et al. The role of Azadinium spinosum (Dinophyceae) in the production of azaspiracid shellfish poisoning in mussels[J]. Harmful Algae, 2011, 10: 774-783.

[4] OFUJI K, SATAKE M, MCMAHON T, et al. Structure of azaspiracid analogs, azaspiracid-4 and azaspiracid-5, causative toxins of azaspiracid poisoning in Europe[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2001, 65(3): 740-742.

[5] LEHANE M, S?EZ M J F, MAGDALENA A B, et al. Liquid chromatography-multiple tandem mass spectrometry for the determination of ten azaspiracids, including hydroxyl analogues in shellfish[J]. Journal of Chromatography A, 2004, 1024(1/2): 63-70.

[6] JAMES K J, SIERRA M D, LEHANE M, et al. Detection of five new hydroxyl analogues of azaspiracids in shellfish using multiple tandem mass spectrometry[J]. Toxicon, 2003, 41(3): 277-283.

[7] EU/SANCO. Report of the meeting of the working group on toxicology of DSP and AZP[R]. Brussels: EU/SANCO, 2001.

[8] TOYOFUKU H. Joint FAO/WHO/IOC activities to provide scientific advice on marine biotoxins (research report)[J]. Marine Pollution Bulletin, 2006, 52: 1735-1745.

[9] 進(jìn)出口食品安全局. 歐盟水產(chǎn)品法規(guī)摘編(精縮版)[S]. 2009.

[10] JAMES K J, LEHANE M, MORONEY C, et al. Azaspiracid shellfish poisoning: unusual toxin dynamics in shellfish and the increased risk of acute human intoxications[J]. Food Additive Contamination, 2002, 19(6): 555-561.

[11] OFUJI K, SATAKE M, OSHIMA Y, et a1. A sensitive and specific determination method for azaspiracids by liquid chromatography mass spectrometry[J]. Natural Toxins, 1999, 7(6): 247-250.

[12] DRAISCI R, PALLESCHI L, FERETTI E, et a1. Development of a method for the identification of azaspiracid in shellfish by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2000, 871(1/2): 13-21.

[13] LEHANE M, BRA?A-MAGDALENA A, MORONEY C, et a1. Liquid chromatography with electrospray ion trap mass spectrometry for the determination of five azaspiracids in shellfish[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 950(1/2): 139-147.

[14] MORONEY C, LEHANE M, BRA?A-MAGDALENA A, et a1. Comparison of solid-phase extraction methods for the determination of azaspiracids in shellfish by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 963(1/2): 353-361.

[15] HESS P, NGUYEN L, AASEN J, et al. Tissue distribution, effects of cooking and parameters affecting the extraction of azaspiracids from mussels, Mytilus edulis, prior to analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry[J]. Toxicon, 2005, 46(2): 62-71.

[16] LEHOTAY S J, SON K A, KWON H, et al. Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(16): 2548-2560.

[17] WILKOWSKA A, BIZIUK M. Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS methodology[J]. Food Chemistry, 2011, 125: 803-812.

[18] G?KMEN V, SERPEN A, FOGLIANA V. Direct measurement of the total antioxidant capacity of foods: the ‘QUENCHER’ approach[J]. Trends in Food Science & Technology, 2009, 20: 278-288.

[19] KOESUKWIWAT U, LEHOTAY S, MIAO S, et al. High throughput analysis of 150 pesticides in fruits and vegetables using QuEChERS and low-pressure gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(1/2): 6692-6703.

[20] SCHWARZ T, SNOW T A, SANTEE C J, et al. QuEChERS multiresidue method validation and mass spectrometric assessment for the novel anthranilic fiamide insecticides chlorantraniliprole and cyantraniliprole[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 814-821.

[21] 曲斌, 朱志謙, 陸貴萍, 等. QuEChERS-UPLC-MS/MS快速測(cè)定豬肝中20種磺胺類(lèi)藥物殘留[J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(8): 1457-1464.

[22] 王點(diǎn)點(diǎn), 石利利, 宋寧慧. QuEChERS-高效液相色譜法測(cè)定稻田土壤、糙米和秸稈中的滅草松殘留[J]. 分析實(shí)驗(yàn)室, 2012, 31(6): 1-6.

[23] 羅輝泰, 黃曉蘭, 吳惠勤, 等. QuEChERS/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定魚(yú)肉中30種激素類(lèi)及氯霉素類(lèi)藥物殘留[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2011, 30(12): 1329-1337.

[24] 劉亞偉, 董一威, 孫寶利, 等. QuEChERS在食品中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(9): 285-289.

[25] AYSAL P, AMBRUS ?, LEHOTAY S J, et al. Validation of an efficient method for the determination of pesticide residues in fruits and vegetables using ethyl acetate for extraction[J]. Journal of Environmental Science and Health Part B, 2007, 42: 481-490.

[26] 張耀海, 焦必寧, 周志欽. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合QuEChERS方法快速檢測(cè)軟包裝飲料中8種光引發(fā)劑[J]. 分析化學(xué), 2012, 40(10): 1536-1542.

[27] 郭萌萌, 李兆新, 譚志軍, 等. 分散固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中的8種青霉素殘留[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2011, 30(9): 969-975.

[28] 劉茜, 劉曉宇, 邱朝坤, 等. 基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法測(cè)定鯽魚(yú)肌肉中殘留的辛硫磷[J]. 色譜, 2009, 27(4): 476-479.

[29] 耿志明, 李鵬, 陳明, 等. 基質(zhì)固相分散-高效液相色譜法測(cè)定魚(yú)肉中磺胺類(lèi)藥物殘留[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 22(3): 310-312.

[30] 張毅, 岳振峰, 藍(lán)芳, 等. 分散固相萃取凈化與液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中8類(lèi)禁用藥物殘留[J]. 分析化學(xué), 2012, 40(5): 724-729.

[31] 李廣慶, 馬國(guó)輝. 固相萃取技術(shù)在食品痕量殘留和污染分析中的應(yīng)用[J]. 色譜, 2011, 29(7): 606-612.

[32] CHU Xiaogang, HU Xiaozhong, YAO Huiyuan. Determination of 266 pesticide residues in apple juice by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography-mass selective detection[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1063(1/2): 201-210.

[33] VALSAMAKI V I, BOTI V I, SAKKAS V A, et al. Determination of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls in chicken eggs by matrix solid phase dispersion[J]. Analytica Chimica Acta, 2006, 573/574: 195-201.

[34] ANASTASSIADES M, LEHOTAY S J, ?TAJNBAHER D, et al. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J]. Journal of AOAC International, 2003, 86(20): 412-431.

[35] WIEST L, BULETé A, GIROUD B, et al. Multi-residue analysis of 80 environmental contaminants in honeys, honeybees and pollens by one extraction procedure followed by liquid and gas chromatography coupled with mass spectrometric detection[J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218(34): 5743-5756.

[36] LI Jianhui, LIU Xin, HAN Shen, et al. Analysis of ochratoxin A in wine by high-resolution UHPLC-MS[J]. Food Analytical Methods, 2012, 5(6): 1506-1513.

Rapid Profiling and Confirmation of Azaspiracids in Edible Shellfishes by Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

HAN Shen, LIU Xin, LI Jian-hui, WANG Pei-yue, GU Jin, ZHANG Zhao-hui*
(Testing Center, Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)

An ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometric method (UHPLC-LTQ/ Orbitrap) was developed for the rapid profiling and confirmation of 3 natural azaspiracids (AZAs) (AZA-1, AZA-2 and AZA-3) in edible shellfishes including mussels, oysters, clams and scallops as well as related products. Samples were homogeneously extracted with acetonitrile-water. The diluted supernatants were then purif ed with a modif ed QuEChERS method. The separation was performed on an Acquity HSS T3 column (150 mm × 2.1 mm, 1.8 μm) by gradient elution with acetonitrile in water containing 5 mmol/L ammonium acetate and 0.1% formic acid. The high-resolution mass spectrometry was carried out by means of electrospray ionization in positive ion mode (ESI＋). The AZAs were detected by high-resolution MS under full scan and data-dependent scan modes, respectively. The limits of quantif cation (LOQ, RSN> 10) were 10 μg/kg for all the 3 AZAs. The calibration curves showed good linearity within the concentration range of 10 μg/L to 500 μg/L with correlation coeff cients (R2) more than 0.99. Shellf sh samples from home and abroad were prof led and conf rmed by the established method. AZAs were found in some samples. Therefore this method is easy, sensitive, reproducible and eff cient, and can be applied to prof le and conf rm AZAs in edible shellf shes and related products.

azaspiracids shellf sh toxins; high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry; QuEChERS

O657.6

A

1002-6630（2014）04-0116-06

10.7506/spkx1002-6630-201404024

2013-03-25

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011IK193；2012IK145）；國(guó)家質(zhì)檢總局質(zhì)檢行業(yè)公益性科研專(zhuān)項(xiàng)（201210029）

韓深（1981—），男，工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：hansh@bjciq.gov.cn

*通信作者：張朝暉（1968—），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：zhangzhh@bjciq.gov.cn