液相色譜-質譜檢測3種不同屬新鮮黃芩中8種成分

董 喆，黃湘鷺，曹 進,*，張慶生，肖盛元，Ian B. Cole，Susan J. Murch

（1.中國食品藥品檢定研究院食品化妝品檢定所，北京 100050；2.北京理工大學生命科學院，北京 100081；3.卑詩大學奧根分校科學與藝術學院化學系，大不列顛哥倫比亞 基洛納 V1V1V7）

液相色譜-質譜檢測3種不同屬新鮮黃芩中8種成分

董 喆1，黃湘鷺1，曹 進1,*，張慶生1，肖盛元2，Ian B. Cole3，Susan J. Murch3

（1.中國食品藥品檢定研究院食品化妝品檢定所，北京 100050；2.北京理工大學生命科學院，北京 100081；3.卑詩大學奧根分校科學與藝術學院化學系，大不列顛哥倫比亞 基洛納 V1V1V7）

目的：利用在線的方式，建立對3個屬的新鮮黃芩樣品中8種成分（褪黑素、5-羥色胺、吲哚-3-乙酸、金絲桃素、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、野黃芩苷）的液相色譜-質譜聯用測定方法。方法：植物樣品的勻漿與適量填料混合后，被填入相應的樣品倉，通過雜質去除，目標物質富集洗脫等步驟，用于成分測定。結果：測定黃芩樣品中8種成分，方法的檢出限及定量限條件的回收率均大于90%，重復性及穩定性相對標準偏差不大于3.1%。結論：可以用于對黃芩原料中功效成分的評價。

液相色譜-質譜法；中國黃芩；北美黃芩；南美黃芩

近年來，隨著人們生活質量的提高，對保健品的需求越來越大，黃芩因其特殊功效被制作成各類保健食品，比如養生茶、植物粉等。黃芩屬是擁有大約300多個種的一類植物，因其形態常被叫做“小圓帽”，該屬植物通常廣泛生長在溫帶地區和熱帶山地。在中國，黃芩作為一種中藥材，常以根入藥，有清熱燥濕、涼血安胎、解毒功效，已使用了幾百年[1-3]。在北美，它用于治療消化問題，還可作為一種神經鎮定劑或者溫和的鎮靜劑，用于輔助治療焦慮、抑郁、失眠等。近幾年研究發現，黃芩提取物還具有抗菌[4]、抗病毒[5]、抗腫瘤[6-7]、抗炎[8-9]、抗氧化[10-11]、免疫調節[8,12]等的作用，并可以作為輔助消化的保健食品用于日常消費[13]。現代研究表明，黃芩屬植物中含有上百種成分，其主要的有效成分為黃芩苷[14]、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類化合物[15-16]，在對黃芩藥材的評價，也是基于對有效成分的含量測定或者色譜指紋圖譜的方式進行產地來源、質量優劣以及在不同配伍中的存在狀態的評價[17-18]。但是，目前尚未見對中美不同產地來源的黃芩植物進行比較分析報道。以往的研究[19]只是利用了在線裝置對粉末植物樣品進行植物激素的測定，而沒有進行新鮮植物樣品（即含水植物組織）的處理研究。由于在新鮮植物組織進行干燥處理的過程中，常會引起物質的變化，因此，建立一種可以用于新鮮植物樣品測定的在線制備方式，對植物組織樣品進行測定，可為有效成分研究提供檢測途徑和方法。

本研究通過對3種不同屬黃芩樣品中國黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、北美黃芩（Scutellaria laterif ora L.）以及南美黃芩（Scutellaria racemosa Pers.）的新鮮組織進行在線直接制備處理，運用液相色譜-質譜方法測定其中8種成分的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種黃芩種子（中國黃芩、北美黃芩、南美黃芩）分別購自河北省安國市、加拿大Kelowna及美國佛羅里達橙縣，經卑詩大學化學系Susan J. Murch教授鑒定。

褪黑素、5-羥色胺、吲哚-3-乙酸、金絲桃素對照品、甲酸（分析純）、乙酸（分析純） 美國Sigma公司；黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、野黃芩苷 中國食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈（色譜純） 加拿大VWR公司。

1.2 儀器與設備

Alliance液相色譜、Premier LCT串聯質譜 加拿大Waters公司；Masslynx V4.0數據控制軟件 英國Micromass公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器條件

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：W a t e r s X t e r r a C18H P L C柱（100 mm×2.1 mm，3.5?m）；流動相體系：0.45%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度程序：0～5 min、100% A，5～30 min、100%～0% A，30～45 min、100% B，45～46 min、100%～0% B，46～60 min、100% A；流速：0.25 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣器溫度：20 ℃；進樣體積：10 ?L。

1.3.1.2 質譜條件

質譜調諧參數的優化是利用每一種物質的標準溶液，質量濃度為0.001 mg/mL，直接注射進樣調節。模式：多反應監測，正離子模式；毛細管電壓：3.00 kV；錐孔電壓：褪黑素13 V、5-羥色胺14 V、吲哚-3-乙酸10 V、金絲桃素11 V、黃芩苷17 V、黃芩素39 V、漢黃芩苷29 V及野黃芩苷20 V；提取電壓：4.00 V；RF棱鏡電壓：0.0 V；離子源溫度：150 ℃；干燥溫度：400 ℃；錐孔氣流速：100 L/h；干燥解吸氣體流速：1 000 L/h；低分子質量分離度：14.5；高分子質量分離度：15.3；離子能量1：0.4 V；進口電壓：25 V；碰撞電壓：褪黑素15 V、5-羥色胺10 V、吲哚-3-乙酸15 V、金絲桃素14 V、黃芩苷30 V、黃芩素35 V、漢黃芩苷30 V及野黃芩苷35 V；出口電壓：30 V；低分子質量分離度：15.0；高分子質量分離度：15.0；離子能量2：1.5 V；倍增器電壓：650 V；池壓力：6.92×10－4mbar。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 黃芩培育及樣品采集

3種黃芩的種子經表面滅菌處理后，在水基培養基中發芽后移植于位于加拿大卑詩大學奧根湖區的溫室中，具體培育參見文獻[20]。3個月后，分別對種苗的根、莖、葉、花進行采集，分裝于樣品管中，直接用于測定或者存放于－20 ℃待測。

1.3.2.2 樣品處理及制備

1.3.2.1 節獲得的植物組織各分為4種模式進行處理：在室溫條件下，剪碎樣品通過氮氣流進行干燥處理，研磨粉碎后，準確稱量2.0 g樣品于50 mL燒杯中，加入10 mL甲醇-0.45%甲酸（40∶60，V/V）混合溶液，超聲提取45 min，重復1次，每次萃取液經4 500×g離心10 min，獲取上清液，并以甲醇-0.45%甲酸（40∶60，V/V）溶液清洗殘渣并入萃取液，最終上清液定容至30 mL，為待測組1；直接稱取約3.0 g勻漿后新鮮組織樣品，按照組1樣品制備方式制備，為組2；另取樣品按照以往研究[19]，進行干燥后，粉末裝填處理，為組3；取樣品采用新鮮樣品處理方法，裝填后，進行處理，為組4。

1.3.2.3 新鮮樣品的在線制備

在線裝置的構建參考前期文獻[6]報道，在用于新鮮植物組織樣品測定時進行了部分改進和優化。其中樣品倉的裝填是采用均質化樣品以一定比例加入反相C18填料后，裝填入倉，利用篩板以高壓泵壓實，操作步驟見圖1所示。研究[19]表明，樣品可以在進行粉末化后，通過一定的惰性物質填充后，增加提取倉的反壓，從而加快提取的速度。而對于新鮮樣品，其不能如粉末樣品般經過顆粒篩選后進行填充并形成一定的反壓，因此新鮮植物組織樣品在4 ℃勻漿后，吸取適量勻漿，加入一定比例填料（30 ?m，C18填料）并混勻，此時的樣品狀態為半干燥，以夾心填充的方式置于樣品倉中，操作過程中，采用堵頭對樣品倉出口進行堵塞，進口利用高壓泵，以水為載體加壓（1 000～1 500 psi）1～2 min，形成的空腔以填料填實后，裝配好樣品倉，放入流路進行樣品在線處理。參見圖1。

圖1 新鮮植物樣品在線處理結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of experimental set-up for on-line fresh botanical sample treatment

2 結果與分析

2.1 檢測條件的優化

為了獲取不同種質來源黃芩的質量差異，因此選擇代表黃芩主要質量的4種活性成分，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷及野黃芩苷作為比較的基礎，另考慮其種質生長相關的4種植物神經遞質，金絲桃素、褪黑素、5-羥色胺、吲哚-3-乙酸作為生長情況評價參考加入比較。方法采用標準溶液對各個物質的母離子及子離子譜進行了優化研究，按照三離子（準分子離子及兩個碎片離子）原則對每種物質選取了兩個子離子作為定性和定量識別的依據，多反應監測選擇的離子對（括號內兩對離子對，前者為定量離子對）分別為：褪黑素（m/z 233＞174，m/z 233＞216）；5-羥色胺（m/z 177＞160，m/z 177＞115）；吲哚-3-乙酸（m/z 176＞130，m/z 176＞103）；金絲桃素（m/z 538＞413，m/z 538＞277）；黃芩苷（m/z 447＞271，m/z 447＞168）；黃芩素（m/z 271＞123，m/z 271＞169）；野黃芩苷（m/z 463＞287，m/z 463＞175）；漢黃芩苷（m/z 285＞270，m/z 285＞139），各離子對分別為對應流動相體系和碰撞狀態下的最強的兩對離子，樣品中的目標物質確定方式為，與標準品保留時間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在2%以內，其兩對離子對相對豐度比在樣品和標準品間RSD為10%以內。

2.2 8種成分的線性分析

圖2 8種目標物質的樣品色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 8 analytes in sample

中國黃芩根樣品中8種成分色譜圖見圖2，每種物質建立了兩條標準曲線，分別為高、低質量濃度線性關系結果見表1。

表1 8種目標物質的線性關系及范圍Table 1 Linear relationships and ranges for 8 analytes

2.3 在線制備的優化

2.3.1 在線雜質洗脫過程

參考固相萃取的洗脫優化方式，同時兼顧8種成分的洗脫行為，其中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、野黃芩苷、褪黑素、吲哚-3-乙酸最佳洗脫液為60%甲醇溶液，而5-羥色胺為30%甲醇溶液，金絲桃素為70%甲醇。為同時測定8種成分，雜質去除分為兩段進行，首先以100%水沖洗1 min，再以25%甲醇溶液沖洗2 min，再以30%甲醇溶液洗脫至富集柱上后，切入上樣位，進行分離分析。上述最佳洗脫比例，是在該比例下，物質在2 min內可以完全洗脫至富集柱上，且不進一步洗脫流失，由于上述最佳洗脫比例差別較大，實驗中進一步研究了富集柱保留行為，發現在30%甲醇洗脫下，最難洗脫物質金絲桃素可以在6 min完全洗脫下來，同時該時間5-羥色胺在富集柱上繼續保留，而不因洗脫而流失，因此最終采用30%甲醇洗脫6 min，作為樣品制備富集時間。

2.3.2 在線制備過程的優化

前期制備研究[19]是將樣品干燥后粉末化，直接裝填或者與惰性填料混合后裝填，以增加樣品倉的反壓，從而提高了提取的效率。本實驗針對新鮮樣品，采用與填料混裝的方式，形成了制備反壓，主要優化了勻漿和填料的混合比例，比較了1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30混合比例的提取效率。經過比較發現，由于含水量及含木質素多少的不同，裝柱后加壓狀態下，形成的空腔比例存在較大的差異，因此需要補充填入填料。根據重復性比較結果得到最佳制備條件，其中根混合比例1∶15、加壓1 000 psi，莖混合比例1∶15、加壓1 200 psi，花和葉混合比例1∶25、加壓1 500 psi，在固定了上述條件后，采用2.3.1節步驟進行操作。由于8種成分在不同組織樣品中轉移趨勢一致，因此，以黃芩苷為例來說明方法效果，結果數值均已進行含水量的校正，見表2所示。

表2 4種處理方式各部分黃芩苷含量結果（ =5）Table 2 Comparative baicalin content in different plant parts of Scutellaria extracted at different ratios of homogenated samples to packing material ( = 5)

由表2可以看出，干法（組1、3）和新鮮樣品（組2、4）的測定結果存在明顯的差異，這說明干法樣品在組織干燥以及加入溶劑萃取的過程中待測成分有明顯的減少，因此，在對植物組織中有效物質的檢測中，檢測新鮮樣品可以更為有效地反映出物質成分存在的狀況。另外，由于在高反壓下提取，在線過程（組3、4）的分析周期明顯要低于離線狀態（組1、2），一般提取過程僅需要10 min，具體時間與雜質洗脫、填料的容量以及萃取柱的飽和程度等有關，而離線過程通常需要40～50 min左右。

2.3.3 質譜基質效應

在液相色譜-質譜檢測中，離子化程度直接決定了信號的有效檢出。基質效應的影響，雖然在通常液相色譜-質譜方法開發中得到了一定的考慮，但是往往很難適應較為寬泛的基質耐受范圍。在離線狀態，無論干燥樣品或者新鮮樣品進行制備，其主要基質還存在于萃取體系中，因此，在此狀態下，即使得到后期液相分離，也不能消除共存基質的干擾。與此相比，在線過程由于存在前期溶劑清洗，大部分基質并不進入后期分離分析，因此基質效應會減少很多。比較結果顯示，基質效應由高到低的情況大致為：組2＞組1＞＞組3＞組4。對于方法的檢出限，提取系統條件下，實際可檢測的數據，沒有考慮本底的干擾和基質影響，見表3、4。由于較難獲取含共存基質，而不含待測成分的本底，因此，以標準物質比較了離線和在線方法檢測的檢出限水平，可以獲得相似的檢出限數據和回收率數據（離線數據未列出）。

2.4 方法驗證

2.4.1 8種成分的檢出限及定量限

表3 8種物質的檢出限及其回收率（ =5）Table 3 Limits of detection and recoveries of 8 analytes ( = 5)

表4 8種物質的定量限及回收率（ =5）Table 4 Limits of quantification and recoveries of 8 analytes ( = 5)

根據實際信號區分，方法的檢出限和定量限分別選取的是2、5倍信噪比水平計算，結果見表3、4。

2.4.2 回收率及方法驗證

方法在檢出限及定量限附近的加標回收實驗可以看出，檢出限附近的精密度小于3.5%（n=5），回收率均在90%以上；定量限附近的精密度小于3.2%（n=5），回收率在93%以上，證明此方法可以用于黃芩屬樣品中8種物質的測定。將標準溶液滴加在惰性填料中，氮氣流下吹干后裝填入樣品倉中，按照1.3.2.1節方法進行樣品富集、測定。另外對在線樣品制備進行加樣回收實驗，4組實驗回收率均在90%以上，說明在線制備在測量的準確性上占有更好地優勢。

2.4.3 重復性及穩定性

按照在線制備的方式，進行了樣品制備，對8種物質的重復性及樣品穩定性進行了測定，測定采用中國黃芩莖配制的樣品，其中樣品中成分含量為黃芩素10 μg/g、黃芩苷10 μg/g、漢黃芩苷7 μg/g、野黃芩苷6 μg/g、褪黑素1 μg/g，5-羥色胺和吲哚-3-乙酸人為添加，添加量為1 μg/g。穩定性實驗用該樣品分別在0、3、7、10、15、24、48 h進行測定，結果見表5。

表5 8種物質的重復性及穩定性（n=5）Table 5 Repeatability and stability of the method ( n= 5)

2.5 樣品測定

由表6可見，黃芩素、黃芩苷、漢黃芩苷、野黃芩苷4種物質，在3個來源的種子培育的根樣品中均可以發現，在50批相同培育條件獲得的樣品中，以上4種物質的含量高低分別為中國黃芩＞北美黃芩＞南美黃芩，而在組織分布中，由高到低為根、莖、葉、花；金絲桃素作為一種植物神經傳輸相關的物質，僅在中國黃芩的花和葉中發現；3種神經遞質褪黑素、5-羥色胺和吲哚-3-乙酸在3類黃芩屬樣品中均可以發現褪黑素，其中中國黃芩最高，南美黃芩次之，北美黃芩最低，而5-羥色胺和吲哚-3-乙酸則僅在部分樣品中測到，其測定值較低，且不存在樣品的相關性。

表6 3個種質來源樣品檢測結果Table 6 Contents of 8 active components in fresh samples of different plant parts of three Scutellaria species

3 結 論

通過對3個種質來源黃芩中8種成分的含量測定，可以獲得來自不同地域來源的黃芩屬植物的化學定性和定量信息，同期研究中也嘗試了利用本方法對植物的不同部位，如莖、葉、花等上述物質的測定，觀察與部分地域相關的植物化學屬性，由于比較的是方法和處理過程，數據未列出。從現有的數據結果而言，新鮮組織樣品的在線檢測可以有效地反映出目標物質在分析對象中的真實含量水平。對于整體分析方法來說，盡可能減少樣品處理過程對原有樣品狀態的改變，可以更為準確地獲取待測物質的真實水平。

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Determination of 8 Components in Fresh Samples of 3 Scutellaria Species Using On-Line Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

DONG Zhe1, HUANG Xiang-lu1, CAO Jin1,*, ZHANG Qing-sheng1, XIAO Sheng-yuan2, Ian B. Cole3, Susan J. Murch3
(1. Institute of Food and Cosmetics Control, National Institutes of Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 2. School of Life Science, Beijing Institutes of Technology, Beijing 100081, China; 3. Chemistry, I.K. Barber School of Arts and Sciences, University of British Columbia Okanagan, Kelowna V1V1V7, Canada)

Objective: An on-line liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was developed to determine 8 components in fresh Scutellaria samples from three germplasm sources. Methods: Mixtures of homogenated tissue samples and appropriate amounts of packing material were packed in sample chamber. After removing matrix impurities and enriching the target analytes, 8 components in fresh Scutellaria samples were determined. Results: The recoveries were greater than 90% at the limits of detection and quantification. Meanwhile, the RSDs of repeatability and stability were less than 3.1%. Conclusion: The method developed can be used for the de termination of active components in Scutellaria samples.

liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS); Scutellaria baicalensis Georgi; Scutellaria laterif ora L.; Scutellaria racemosa Pers.

O657.63

A

1002-6630（2014）04-0131-06

10.7506/spkx1002-6630-201404027

2013-04-25

科技部國際合作課題（2011DFA31440）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK08B02）

董喆（1984—），男，助理研究員，碩士，研究方向為分析化學。E-mail：dongzh2009@163.com

*通信作者：曹進（1970—），男，副研究員，博士，研究方向為分析化學。E-mail：cao1208@gmail.com