固相萃取-高效液相色譜法同時測定海米中10種合成色素

劉慧慧，宮向紅， 徐英江，鄒榮婕，李佳蔚，鄧旭修，張秀珍,*

（1.山東省海洋資源與環境研究院 山東省海洋生態修復重點實驗室，山東 煙臺 2 64006；2.煙臺山水海產有限公司，山東 煙臺 264006）

固相萃取-高效液相色譜法同時測定海米中10種合成色素

劉慧慧1，宮向紅1， 徐英江1，鄒榮婕2，李佳蔚2，鄧旭修2，張秀珍1,*

（1.山東省海洋資源與環境研究院 山東省海洋生態修復重點實驗室，山東 煙臺 2 64006；2.煙臺山水海產有限公司，山東 煙臺 264006）

建立固相萃取-高效液相色譜法同時測定海米中新紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、偶氮玉紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅、羅丹明B 10種合成色素的方法。海米中的合成色素用氨化乙醇提取、固相萃取柱凈化，ODS-3 C18柱為分離柱，甲醇和0.02 mol/L乙酸銨為流動相梯度洗脫，采用二極管陣列檢測器，在360 nm波長處檢測，外標法定量。10種合成色素在0.2～50 mg/L質量濃度范圍內與其峰面積成良好的線性關系；10種合成色素的檢出限為0.4～1.0 mg/kg。3個不同加標水平的回收率為74.3%～90.0%，相對標準偏差小于4.3%。該方法能同時完成10種合成色素的測定，可用于海米中合成色素的檢測分析。

固相萃取；高效液相色譜；海米；合成色素

海米又名蝦米、 干蝦仁，是著 名的海味品，有較高的營養價值，蛋白質含量高達55%，還含多種維生素。海米中最具營養價值的成分是呈紅色的蝦青素，是迄今 為止發現的最強的抗氧化劑。如果海米中的紅色成分褪去，說明蝦青素已經被氧化。因此，海米的紅色成為海米新鮮程度的指示劑。

合成色素具有色澤鮮艷、著色力強、色調多樣、成本低廉等特點。應用于食品著色的合成色素叫做食用合成色素，它們自身沒有營養且具 有毒性、致瀉性和致癌性[1]。2011年實施的GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》[2]中對允許在食品中使用的幾種合成食用色素的最大使用量及使用范圍作了明確規定。海米中禁止添加任何合成色素，但一些不法商販常將劣質海米用合成色素進行染色，以達到新鮮海米的顏色。以目前調查監測情況看，海米中胭脂紅和檸檬黃常有檢出[3]。

現行的食品中合成色素的檢測方法以飲料、糖、果汁等基質比較簡單的食品居多[4-10]，缺乏海米等干海產品的檢測方法。海米樣品蛋白質含量高且基質復雜，合成色素與蛋白質結合[11-12]，基于簡單基質食品的分析方法不能準確測定其中色素的含量。本研究以GB/T 5009.35—2003《食品中合成著色劑的測定》[13]為基礎，增加了3種紅色系合成色素，以新紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、偶氮玉紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅、羅丹明B 10種合成色素作為研究對象，建立了高效液相色譜多組分檢測方法，旨在提高檢測效率、填補海米中合成色素檢測方法的空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海米購自山東煙臺農貿市場。

新紅標準品（98.5%） 德國Fluka公司；檸檬黃、日落黃、胭脂紅對照品 國家標準物質研究中心；偶氮玉紅、莧菜紅、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅、羅丹明B標準品德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇（色譜純）、甲酸、氨水、乙醇、乙酸銨（均為分析純） 德國Merck公司、實驗用水均為超純水；聚酰胺固相萃取柱（1 g，6 mL）天津博納艾杰爾公司。

1.2 儀器與設備

U3000型高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）戴安（中國）有限公司；Milli Q Gradient型超純水儀美國Millipore公司；Labo rota 4001型旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國Organomation公司；FA25勻質器 德國Fluko公司；TGL-10C離心機 上海安亭科學儀器廠；ASPEC XL4型全自動固相萃取儀 法國Gilson公司；Talboys旋渦混合器美國Troemner公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；柱溫30 ℃；流動相為甲醇（A）和0.02 mol/L乙酸銨（B）；梯度洗脫程序1、2[13]見表1、2；進樣體積20 μL；流速1.0 mL/min。采集10種合成色素在220～600 nm波長范圍內的吸收光譜圖，以確定最佳吸收波長。

表1 流動相梯度1Table 1 Gradient elution program 1 for the separation of the pigments by HPLC

表2 流動相梯度2Table 2 Gradient elution program 2 for the separation of the pigments by HPLC

1.3.2 標準溶液的配制

準確稱取適量的新紅、檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅、偶氮玉紅、誘惑紅、亮藍、赤蘚紅、羅丹明B標準品，用水配成質量濃度為100 mg/L的標準儲備溶液，取各儲備溶液適量，配制混合標準中間液，其中新紅、檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、亮藍、羅丹明B的質量濃度為20 mg/L，赤蘚紅的質量濃度為30 mg/L，亮藍的質量濃度為50 mg/L，4 ℃保存備用。

1.3.3 試劑的配制

提取液1（氨化乙醇）：將無水乙醇、氨水、水按7∶2∶1（V/V）比例混勻制得；提取液2（氨化乙醇）：將無水乙醇、氨水、水按6∶4∶0（V/V）比例混勻制得；提取液3：將4 mol/L尿素溶液與甲醇等體積混勻制得。

1.3.4 樣品處理

稱取2.0 g粉碎后的干海米樣品于50 mL離心管中，加入15 mL石油醚，渦動3 min，4 000 r/min離心5 min，棄上清液，肉糜中再加入15 mL石油醚，重復1次。肉糜經上述處理后置于氮吹儀，將殘余的石油醚吹干。分別加入提取液1、2、3，與樣品充分混勻，渦動提取3 min，7 000 r/min離心10 min，用脫脂棉過濾上清液，將濾液轉移入雞心瓶。對提取液用量及提取次數進行測試。將數次提取的上清液合并入雞心瓶，于55 ℃旋轉蒸發至10 mL，轉入50 mL離心管，用5 mL水洗雞心瓶，洗滌液一并轉入離心管，7 000 r/min離心10 min，上清液轉移入25 mL容量瓶中，加入0.6 mL 200 g/L檸檬酸溶液，用水定容至25 mL，混勻，備用。將固相萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，用10 mL水活化后，加入25 mL提取液，以10 mL 0.05%甲酸水溶液（V/V）淋洗小柱、10 mL 10%氨水甲醇溶液（V/V）洗脫，接洗脫液于10 mL玻璃離心管中，于55 ℃氮吹至近干。用2 mL 20%甲醇水溶液（V/V）溶解殘渣，過0.45 ?m針孔濾膜，待測。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑

10種合成色素均為水溶性，但由于海米中蛋白質含量較高，無法實現用水提取與蛋白質結合的色素。因此分別采用不同比例的氨化乙醇溶液（提取液1、2）[14-15]、尿素甲醇溶液（提取液3）[16]對海米樣品進行提取實驗。結果表明，提取液1、2、3提取效率分別為95%、87%、84%，提取液1的提取效率最高，且可以省去后續去蛋白的步驟，簡化前處理過程。原因是70%～75%的乙醇可以奪取蛋白質的水分，使蛋白質相對過量，相互吸附、凝聚。對提取液使用量和提取次數進行比較研究，結果見表3。因此本研究使用提取液1，分別用20、20、10 mL對樣品進行3次提取。

表3 提取液體積和提取次數對提取效果影響比較Table 3 Effects of extraction solvent volume and number of extraction cycles on the recoveries 10 synthetic pigments

2.1.2 固相萃取凈化效果

固相萃取凈化是目前大多數研究者采用的樣品凈化方式，與傳統的液-液萃取法相比可以提高分析物的回收率，更有效的將分析物與干擾組分分離，廣泛應用于食品安全檢測[17-23]。國標方法及相關參照文獻多采用聚酰胺粉吸附法凈化[13,24]，該方法對上樣及洗脫試劑的pH值要求嚴格，pH值的波動會影響部分合成色素的吸附及洗脫，最終影響回收率；在淋洗雜質時，含有氧雜蒽結構的化合物（如赤蘚紅）會有很大損失[25]。本研究使用聚酰胺固相萃取小柱凈化，上樣時只需在提取液中加入少量200 g/L檸檬酸以保證酸性吸附環境，10種化合物都能得到滿意的回收率。以混合標準中間液過柱的方式測試固相萃取柱對各色素成分的回收率，結果如表4所示。

表4 10種合成色素的回收率Table 4 Recoveries of 10 synthetic pigments

2.1.3 色譜分離條件

圖1 10種合成色素標準混合溶液色譜圖（2 mg/kg）Fig.1 Chromatogram of a mixture of 10 synthetic pigment standards (2 mg/kg)

為實現多組分的同時檢測，采用250 mm色譜柱進行分離。該類物質分離常用甲醇（A相）和乙酸銨（B相）為流動相，當兩者初始體積比為2∶8時，新紅和檸檬黃出峰時間過早，且二者重合；將甲醇和乙酸銨溶液初始體積比調整為1∶9時，新紅和檸檬黃分離效果好，且不受樣品基質干擾。采用梯度洗脫方法1，先使用低有機相使新紅和檸檬黃分離，22 min后迅速增大甲醇比例，使10種合成色素在40 min內分離完全，提高了分離效率。10種合成色素標準物質色譜圖見圖1。

2.1.4 檢測波長

采集10種合成色素的吸收光譜圖，多個化合物具備2個主 要吸收波段，一個吸收峰在250 nm左右，另一個吸收峰在450～600 nm波長之間，最大吸收波長如表5所示。選擇波254 nm為檢測波長，10種合成色素標準品在該波長處響應值較高，但海米樣品在該波長下雜峰很多，干擾目標化合物的測定。由于10種化合物的最大吸收波長不能兼顧，故適當犧牲部分化合物的響應值，選擇360 nm為檢測波長，在該檢測波長下，基線平穩，且方法檢出限能夠滿足檢測要求。

表5 合成色素的最大吸收波長Table 5 Maximum absorption wavelengths of the pigments

2.2 標準曲線和檢出限

表6 色素各組分標準曲線方程、線性范圍及檢出限Table 6 Calibration equations, linear ranges and detection limits of the pigments

圖2 海米樣品（A）、加標海米樣品（B，2 mg/kg）色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank (A) and spiked samples (B, 2 mg/kg) of dried shrimp

在0.2～50 μg/mL范圍內，10種合成色素的質量濃度與其峰面積呈良好線性關系，相關系數、線性方程如表6所示。在海米樣品中添加適量混合標準中間溶液，按1.3節方法處理，10種合成色素 檢出限為0.4～1.0 mg/kg。海米樣品、加標海米樣品色譜圖如圖2所示。

2.3 回收率、精密度

表7 加標回收率和精密度Table 7 Recoveries and precision (RSD) for spiked dried shrimp samples

在空白海米樣品中添加適量混合標準中間溶液，制成3個水平的加標樣品，每個水平6個平行。按1.3節方法進行回收率實驗。加標樣品中10種合成色素含量、回收率及相對標準偏差見表7。

3 結 論

本研究建立了海米中10種合成色素的高效液相色譜測定方法。干海米樣品用氨化乙醇（無水乙醇∶氨水∶水為7∶2∶1，V/V）提取，經聚酰胺固相萃取柱凈化后濃縮測定。10種合成色素在0.2～50 mg/L范圍內，其質量濃度與峰面積線性關系良好，方法檢出限為0.4～1.0 mg/kg。在添加水平1～10 mg/kg范圍內，回收率在74.3%～90.0%，相對標準偏差小于4.3%。實驗表明，本方法靈敏、準確，能夠滿足海米中合成色素測定需要。

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Simultaneous Determination of 10 Synthetic Pigments in Dried Shrimps Using Solid-Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography

LIU Hui-hui1, GONG Xiang-hong1, XU Ying-jiang1, ZOU Rong-jie2, LI Jia-wei2, DENG Xu-xiu2, ZHANG Xiu-zhen1,*
(1. Shandong Province Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 2. Yantai Shanshui Seafood Co. Ltd., Yantai 264006, China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the simultan eous determination of 10 synthetic pigments (new red, lemon yellow, sunset yellow, carminum, azorubin, amaranth, allura red, light blue, erythrosine and rhodamine B) in dried shrimps. Samples were extracted using aminated ethanol and cleaned up on a solid phase extraction column. The chromatographic separation was achieved on an ODS-3 C18column using a mobile phase consisting of me thanol and 0.02 mol/ L ammonium acetate by gradient elution. Ten synthetic pigments were detected by a diode array detector at t he wavelength of 360 nm and quantified by an external standard method. There was a good linear correlation between the concentrations of 10 synthetic pigments and their peak areas in the range of 0.2–50 mg/L. The detection limits of 10 synthetic pigments were 0.4–1.0 mg/kg. The recoveries were in the range from 74.3% to 90.0% and the RSDs were less than 4.3%.

solid phase extraction; high performance liquid chromatography; dried shrimps; synthetic pigments

O657.72

A

1002-6630（2014）04-0170-04

10.7506/spkx1002-6630-201404035

2013-05-28

山東省“水生動物營養與飼料”泰山學者崗位項目；山東省科學技術發展計劃項目（2012GHY11517）；煙臺市科技發展計劃項目（2012134）

劉慧慧（1981—），女，助理研究員，碩士，研究方向為水產品質量安全。E-mail：liuhh615@ 163.com

*通信作者：張秀珍（1964—），女，研究員，學士，研究方向為水產品質量安全與標準化。E-mail：zxz0535501@126.com