南極磷蝦肉糜冷藏過程中蛋白水解酶的穩定性及自溶特性

丁浩宸，李棟芳，張燕平*，許 剛，徐舒展，黃天翔

（浙江工商大學 水產品加工研究所，浙江 杭州 310035）

南極磷蝦肉糜冷藏過程中蛋白水解酶的穩定性及自溶特性

丁浩宸，李棟芳，張燕平*，許 剛，徐舒展，黃天翔

（浙江工商大學 水產品加工研究所，浙江 杭州 310035）

以總蛋白酶活力為指標，研究3種自制南極磷蝦肉糜（蝦肉糜）5 ℃冷藏過程中蛋白水解酶的穩定性，并以蛋白質組分、汁液流失率為指標，結合感官評價，研究其自溶特性。結果表明：在冷藏過程中，蝦肉糜所含的消化腺蛋白酶穩定性較高，未充分漂洗的蝦肉糜受到持續的水解；蝦肉糜的自溶特性主要表現為鹽溶性蛋白、堿溶性蛋白的降解和水溶性蛋白的增加，且汁液流失率增大和感官品質劣化。未漂洗蝦肉糜的自溶現象尤為顯著，不宜冷藏保存，而2次漂洗蝦肉糜在冷藏過程中自溶特性不顯著，雖然存在一定的蛋白質組分變化和汁液流失率增加現象，但感官品質未大幅下降，因而適宜于短時間內在5 ℃進行冷藏保存。

南極磷蝦肉糜；冷藏；蛋白水解酶；自溶特性

南極磷蝦（Euphausia superba）是一類生物量巨大的海洋甲殼類動物，預估其生物量在4～15億t，被認為是地球上最大的動物蛋白庫[1-2]。作為一種具有獨特蛋白酶系統和自溶特性的水產食品資源，南極磷蝦的生化特性已受到了多方關注和研究[3-7]。南極磷蝦死亡后，蝦體中的蛋白水解酶立即被激活并引發蝦體的快速自溶，自溶作用則促進蝦體品質劣化，這被認為是南極磷蝦完全商業化加工和新型磷蝦食品開發的主要障礙[8-10]。

2010年以來，中國成功進行了數次南極磷蝦探捕并開始統籌發展磷蝦產業，對于磷蝦肌肉蛋白質的利用是目前基礎研究和產品研發的重要方向之一[11]。經采肉、漂洗、脫水和速凍獲得的南極磷蝦肉糜是南極磷蝦初級加工的重要分支產品[11]，以其為中間原料可以用于制備、生產南極磷蝦風味的水產食品和營養基料。

李學英等[12]以pH值、出肉率和可溶蛋白含量為指標對南極磷蝦0～3 ℃冷藏過程中的品質變化進行了研究；遲海等[13]對南極磷蝦0、5 ℃條件下微生物、揮發性鹽基氮和三甲胺氮指標的變化趨勢進行了研究。但國內外針對南極磷蝦肉糜的研究報道較少。而南極磷蝦肉糜的部分加工利用環節和流通零售渠道都處于冷藏溫度環境。因此，探討冷藏條件下南極磷蝦肉糜酶學特性和自溶特性的變化對其實際加工利用有一定的理論指導意義。本實驗自制3種不同的南極磷蝦肉糜，研究其在5 ℃冷藏過程中總蛋白酶活力的變化，并以蛋白質組分、汁液流失率和感官品質為指標研究其自溶特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦整蝦凍塊 遼寧省大連海洋漁業集團公司，南極磷蝦為2012年2月從南極海域捕獲并低溫凍藏，當年10月運抵實驗室進行實驗。

所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

滾筒采肉機 廣東鼎成機械有限公司；液媒速凍機大連比澤安航制冷設備有限公司；DW-40L92醫用低溫保存箱、BCD-251WBSV冰箱 海爾集團；T18 basic均質機 德國IKA公司；RC 6 PLUS冷凍離心機 美國Thermo公司；UV-2100紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；K-435消化爐、B-324凱氏定氮儀 瑞士Büchi公司；Free Zone 2.5真空冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 南極磷蝦肉糜的制備

南極磷蝦整蝦凍塊切割成小塊（5 cm×5 cm×5 cm），于10 ℃環境下半解凍至磷蝦個體易于分離。采用滾筒采肉機進行脫殼采肉，選取3 mm孔徑網狀滾筒。將采肉獲得的南極磷蝦肉糜在漂洗槽中以10倍水量的0 ℃冰水進行1～2次漂洗，每次漂洗10 min，漂洗后的南極磷蝦肉糜進行擠壓脫水。通過上述工藝分別獲得未漂洗南極磷蝦肉糜、1次漂洗南極磷蝦肉糜和2次漂洗南極磷蝦肉糜。將3種南極磷蝦肉糜（蝦肉糜）真空袋裝后液媒速凍至－30 ℃，貯藏于－30 ℃低溫冰箱備用。

1.3.2 總蛋白酶活力測定

準確稱取待測樣品，按1∶5（g/mL）加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）提取粗酶液。Folin酚法測定粗酶液總蛋白酶活力；以1%酪蛋白為底物，37 ℃水浴反應，每分鐘水解生成1 μg酪氨酸所需的酶量為一個酶活力單位（U）[9]。105 ℃烘干恒質量法測定待測樣品中干物質的質量分數。計算待測樣品總蛋白酶活力，以U/g干質量表示。

1.3.3 蛋白質組分分析

參照Hashimoto等[14]方法分離待測樣品的蛋白質組分，分離獲得非蛋白氮（non-protein nitrogen compound，NPN）、水溶性蛋白質（water-soluble protein，WSP）、鹽溶性蛋白質（salt-soluble protein，SSP）、堿溶性蛋白質（alkali-soluble protein，ASP）。凱氏定氮儀測定各蛋白質組分的總氮質量分數。

蛋白質質量分數=總氮質量分數×6.25

1.3.4 汁液流失率測定

采用離心法測定汁液流失率，取10 g待測樣品于離心管，4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min，倒去上層汁液，稱量殘余蝦肉質量，以損失汁液占待測樣品鮮質量的質量分數計算為汁液流失率。

1.3.5 感官評價

由10名評價員組成感官評價小組，對蝦肉糜樣品進行感官評價。感官評價以蝦肉糜的肉糜色澤、組織質感、水煮氣味為評價指標，各項指標為1～10分，根據表1的評分標準進行評分。取3項評價指標得分的平均值為樣品的綜合感官評分。

表1 南極磷蝦肉糜感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Antarctic krill paste

1.3.6 冷藏實驗

將3種蝦肉糜切割成片狀（厚度1 cm），在5 ℃條件下進行24 h冷藏實驗。于冷藏過程中，間隔一定時間取樣進行總蛋白酶活力測定、蛋白質組分分析、汁液流失率測定和感官評定。

1.3.7 南極磷蝦肉糜蛋白水解酶來源分析

南極磷蝦整蝦解凍至個體分開。隨機選取20尾蝦體完整飽滿的南極磷蝦（不區分雌雄和體長），沿頭胸甲后緣切開，將蝦體分為頭胸部和腹部[15]。真空冷凍干燥24 h后稱質量并計算南極磷蝦頭胸部、腹部干質占整蝦干質的比例，重復測定10次。以上述方法分離蝦體，分別測定南極磷蝦頭胸部和腹部的總蛋白酶活力，重復測定5次，并計算南極磷蝦頭胸部、腹部蛋白酶活力分別占整蝦總蛋白酶活力的比例。

1.4 數據統計

采用SPSS 13.0軟件進行數據統計分析，以one-way ANOVA分析數據，Duncan新復極差法分析平均值之間的差異。采用OriginPro 7.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 南極磷蝦肉糜冷藏過程中蛋白水解酶穩定性

表2 南極磷蝦肉糜冷藏過程中總蛋白酶活力的變化（x±s=5）Table 2 Changes in total proteolytic activity of Antarctic krill pastes during chilling storage (x±s , = 5)

表2所示為3種蝦肉糜在5 ℃冷藏過程中總蛋白酶活力的變化。未漂洗蝦肉糜的初始總蛋白酶活力最高，經過1～2次漂洗，蝦肉糜的初始總蛋白酶活力分別下降49.2%、74.3%。未漂洗蝦肉糜的總蛋白酶活力在5 ℃冷藏的前6 h內下降不顯著，1次、2次漂洗蝦肉糜則呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。冷藏24 h后，未漂洗、1次漂洗蝦肉糜的總蛋白酶活力分別下降為初始值的68.2%、41.6%，但蛋白酶活力數值仍較大；由此可見，磷蝦肉糜中的蛋白酶在5 ℃冷藏溫度條件下穩定性較高。2次漂洗蝦肉糜冷藏24 h后未檢出總蛋白酶活力，可能是由于其初始值較低所致。杭虞杰等[16]對南極磷蝦蛋白酶熱穩定性進行了研究，蛋白酶液4 ℃條件下保存60 min，殘留酶活力在90%以上，同樣證明了南極磷蝦蛋白酶在冷藏溫度條件下的穩定性。蛋白水解酶的穩定性使得漂洗不徹底的蝦肉糜在冷藏過程中持續處于蛋白酶的酶解作用之下，進而表現出自溶特性。

2.2 南極磷蝦肉糜蛋白水解酶來源分析

表3 南極磷蝦頭胸部、腹部的干質量比例和總蛋白酶活力分布比例（以干質量計）Table 3 Weight ratio (dry basis) and proteolytic activity ratio of cephalothorax and tail in whole Antarctic krill (dry basis)

由表3可知，南極磷蝦頭胸部干質量僅占整蝦的42.82%，但其總蛋白酶活力高達857.83 U/g干質量；而腹部的肌肉組織中所含的總蛋白酶活力僅占整蝦總蛋白酶活力的4.49%。3種自制蝦肉糜中的總蛋白酶活力均高于南極磷蝦腹部的總蛋白酶活力，可見蝦肉糜中的蛋白水解酶活力主要來源于南極磷蝦頭胸部。Kawamura等[17]將南極磷蝦頭胸部和腹部分離，發現單獨存放的腹部組織自溶緩慢，磷蝦整蝦的自溶速度近似于頭胸部，并認為這是頭胸部消化腺蛋白酶向腹部肌肉滲透所致。而南極磷蝦采肉工藝更使得磷蝦消化腺蛋白酶大量分布于蝦肉糜產品中，因此，需要對蝦肉糜中因蛋白酶引起的自溶特性高度重視。

2.3 南極磷蝦肉糜冷藏過程中蛋白質組分變化

表4 南極磷蝦肉糜冷藏過程中蛋白質組分的變化（x±s=5）Table 4 Changes in protein components of Antarctic krill pastes during chilling storage x±s , = 5)

表4所示為3種蝦肉糜在冷藏過程中蛋白質組分的變化。未漂洗蝦肉糜的初始蛋白質組分主要為NPN和WSP，且在冷藏中呈顯著增加（P＜0.05），而SSP和ASP則呈顯著減少（P＜0.05），表現為強烈的自溶特性。1次漂洗蝦肉糜的初始蛋白質組分主要為ASP，這是由于漂洗降低了NPN和WSP所占的質量分數。但冷藏中，NPN、WSP同樣呈顯著增加（P＜0.05），SSP顯著減少（P＜0.05），表現為明顯的自溶特性。2次漂洗蝦肉糜中NPN和WSP所占質量分數較小，且24 h冷藏中的增量較小；SSP在冷藏中僅減少了39.2%，ASP無顯著變化（P＞0.05）。由此可見，2次漂洗蝦肉糜的自溶特性顯著弱于未充分漂洗的蝦肉糜。NPN主要包括游離氨基酸、寡肽及核苷酸等物質，屬于滋味物質和風味物質前體；其協同作用有助于形成復雜的風味[18]。WSP主要為肌漿蛋白和多肽，含有大量的蛋白水解酶。鹽溶性的肌原纖維蛋白對組織形態和持水力的維持起重要作用。蛋白質組分的變化從蛋白質分子的層面解釋了蝦肉糜冷藏中自溶特性的作用機理。蝦肉糜中的SSP和ASP受自溶特性影響，其降解減少會導致蝦肉糜肌肉組織狀態的劣化。Ellingsen等[7]研究同樣指出磷蝦蛋白酶會首先作用于肌肉中的SSP，將其大量水解成多肽和游離氨基酸。Kolakowski[19]研究認為南極磷蝦在自溶階段后，會進入微生物腐敗階段，進而導致氣味和風味的劣化，而蝦肉糜冷藏過程中大量增多的NPN和WSP則是有利于微生物繁殖的營養物質[20]。

2.4 南極磷蝦肉糜冷藏過程中汁液流失率變化

圖1 南極磷蝦肉糜冷藏過程中汁液損失率的變化Fig.1 Changes in drip loss of Antarctic krill pastes during chilling storage

汁液流失率是衡量肉類蛋白質持水性的指標，能反映水產品肌肉在貯藏過程中的汁液流失程度，滲出的汁液會降低商品價值[21-22]。圖1為3種蝦肉糜5 ℃冷藏中汁液流失率的變化。漂洗蝦肉糜初始汁液流失率大于未漂洗蝦肉糜，主要是由于蝦肉在漂洗中吸水所致。未漂洗蝦肉糜在冷藏中汁液流失率持續增大（P＜0.05），且冷藏24 h后汁液流失率達到53.0%。1次漂洗蝦肉糜的汁液流失率在冷藏前12 h同樣呈顯著增大（P＜0.05），而后增速減緩。2次漂洗蝦肉糜的汁液流失率在冷藏前12 h內也有所上升，之后則無顯著變化（P＞0.05）。肉類組織中肌球蛋白等結構蛋白質的質量分數和存在狀態是決定肌肉持水性的關鍵因素[23]。蛋白質結合水脫離和自由水反復凍融是水產品肌肉在冷藏、凍藏過程中出現汁液流失現象的2個主要誘因[24]。蝦肉糜中SSP所占質量分數較小是其汁液流失率初始值均較高的主要原因，而自溶特性引起的蛋白質降解則導致汁液流失率不斷增大。結合2.3節中蛋白質組分的變化，分析認為未漂洗蝦肉糜中的非NPN和WSP隨水分大量流失是其汁液流失率激增的主要原因之一。

2.5 南極磷蝦肉糜冷藏過程中感官變化

圖2 南極磷蝦肉糜冷藏過程中的感官評分變化Fig.2 Changes in sensory evaluation score of Antarctic krill pastes during chilling storage

感官評價是通過視覺、觸覺、嗅覺和味覺綜合感知食品、原料的特征和性質的科學方法，其結果具有一定主觀性，但通常接近消費者和下游加工企業的判定標準[25]。3種蝦肉糜5 ℃冷藏中感官評分的變化如圖2所示。經過漂洗的2種蝦肉糜，其初始感官評分高于未漂洗蝦肉糜，處于優級。未漂洗蝦肉糜的感官評分在冷藏的前9 h下降顯著（P＜0.05），且冷藏3 h后感官評分即低于4分，達到差級。而1次漂洗蝦肉糜的感官評分在冷藏的前6 h同樣下降顯著（P＜0.05），但冷藏24 h后感官評分仍處于良級。2次漂洗蝦肉糜感官評分在24 h冷藏中變化趨勢平緩，在12～24 h中變化不顯著（P＞0.05）。由此可見，3種蝦肉糜冷藏中的感官變化趨勢存在較大區別，直觀反應出不同蝦肉糜自溶特性的差異化。未漂洗蝦肉糜自溶特性顯著，冷藏保存會使其感官品質快速劣化，而漂洗蝦肉糜的自溶特性較弱，在短時間內適于冷藏保存，但其感官品質仍會受到不同程度的影響。

3 結 論

南極磷蝦肉糜中的蛋白水解酶主要為南極磷蝦頭胸部的消化腺蛋白酶，在5 ℃冷藏條件下具有較高的穩定性，能持續作用于磷蝦肌肉蛋白質。南極磷蝦肉糜的自溶特性具體表現為鹽溶性、堿溶性蛋白質的降解，水溶性組分增加，直觀的體現為汁液流失率增大和感官品質劣化。不同加工方式獲得的南極磷蝦肉糜因其蛋白水解酶活力的差別而呈現出差異化的自溶特性強度。在3種自制磷蝦肉糜中，2次漂洗蝦肉糜感官評分最高且在5 ℃冷藏中自溶特性較弱，但要工業化生產高品質的南極磷蝦肉糜，仍需要深入研究漂洗工藝的優化及酶抑制劑的使用。

[1] SUZUKI T, SHIBATA N. The utilization of Antarctic krill for human food[J]. Food Reviews International, 1990, 6(1): 119-147.

[2] 陳雪忠, 徐兆禮, 黃洪亮. 南極磷蝦資源利用現狀與中國的開發策略分析[J]. 中國水產科學, 2009, 16(3): 451-458.

[3] SJ?DAHL J, EMMER A, VINCENT J, et al. Characterization of proteinases from Antarctic krill (Euphausia superba)[J]. Protein Expression and Purification, 2002, 26(1): 153-161.

[4] LOCATI G A, ESPECHE M E, FRAILE E R. Changes in the bacteriological chemical and sensory characteristics of Antarctic krill (Euphausia superba) during storage at 0-2 degrees C[J]. Revista Argentina de Microbiología, 1980, 12(2): 44-51.

[5] 遲海, 李學英, 楊憲時, 等. 解凍方式和條件對南極磷蝦品質的影響[J].食品與機械, 2011, 27(1): 94-97.

[6] 楊峰, 遲海, 楊憲時, 等. 復配保鮮劑對南極磷蝦保鮮及品質的影響[J].食品與發酵工業, 2012, 38(7): 190-195.

[7] ELLINGSEN T E, MOHR V. Biochemistry of the autolytic processes in Antarctic krill post mortem[J]. The Biochemical Journal, 1987, 246(2): 295-305.

[8] OSNES K K, MOHR V. Peptide hydrolases of Antarctic krill, Euphausia superba[J]. Comparative Biochemistry Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1985, 82(4): 599-606.

[9] ANHELLER J E, HELLGREN L, KARLSTAM B, et al. Biochemicaland biological profile of a new enzyme preparation from Antarctic krill (E. superba) suitable for debridement of ulcerative lesions[J]. Archives Dermatological Research, 1989, 281(2): 105-110.

[10] CHEN Y C, JACZYNSKI J. Gelation of protein recovered from whole Antarctic krill (Euphausia superba) by isoelectric solubilization/ precipitation as affected by functional additives[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(5): 1814-1822.

[11] 劉建君. 加速開發南極磷蝦資源打造戰略性新興產業[J]. 遼寧經濟, 2011(1): 78-82.

[12] 李學英, 遲海, 楊憲時, 等. 南極磷蝦冷藏過程中的品質變化[J]. 食品科學, 2010, 31(20): 464-468.

[13] 遲海, 李學英, 楊憲時, 等. 南極大磷蝦0、5和20℃貯藏中的品質變化[J]. 海洋漁業, 2010, 32(4): 447-453.

[14] HASHIMOTO K, WATANABE S, KONO M, et al. Muscle protein composition of sardine and mackerel[J]. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 1979, 45(11): 1435-1441.

[15] 鄭福麟. 南極大磷蝦生物學分析和鮮度評定[J]. 海洋漁業, 1986(4): 152-154.

[16] 杭虞杰, 李學英, 楊憲時, 等. 南極磷蝦蛋白酶分離純化及部分性質研究[J]. 食品與發酵工業, 2011, 37(10): 92-95.

[17] KAWAMURA Y, NISHIMURA K, IGARASHI S, et al. Characteristics of autolysis of Antarctic krill[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1981, 45(1): 93-100.

[18] SOLMS J. The taste of amino acids, peptides, and proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1969, 17(4): 686-688.

[19] KOLAKOWSKI E. Changes of non-protein nitrogens fractions in Antarctic krill (Euphausia superba Dana) during storage at 3 ℃ and 20 ℃[J]. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung A, 1986, 183(6): 421-425.

[20] 沈月新. 水產食品學[M]. 北京: 中國農業出版社, 2005: 75-77.

[21] 陳韜. 宰后肌肉蛋白質和組織結構變化與冷卻豬肉持水性的關系研究[D]. 南京: 南京農業大學, 2005.

[22] 洪惠, 朱思潮, 羅永康, 等. 鳙在冷藏和微凍貯藏下品質變化規律的研究[J]. 南方水產科學, 2011, 7(6): 7-12.

[23] 宋小勇. 文蛤和波紋巴非哈蛋白質冷凍變性及其防止的研究[D]. 湛江: 廣東海洋大學, 2006.

[24] 鄒明輝, 李來好, 郝淑賢. 凡納濱對蝦蝦仁在凍藏過程中品質變化研究[J]. 南方水產科學, 2010, 6(4): 37-42.

[25] 勵建榮, 李婷婷, 李學鵬. 水產品鮮度品質評價方法研究進展[J]. 北京工商大學學報: 自然科學版, 2010, 28(6): 1-8.

Stability of Proteolytic Enzymes and Autolysis Characteristics of Antarctic Krill Paste during Chilling Storage

DING Hao-chen, LI Dong-fang, ZHANG Yan-ping*, XU Gang, XU Shu-zhan, HUANG Tian-xiang
(Institute of Aquatic Products Processing, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310035, China)

Three different kinds of Antarctic krill pastes were prepared. The total proteolytic activity was adopted as an index to study the stability of proteolytic enzymes in Antarctic krill pastes during chilling storage at 5 ℃. Furthermore, the autolysis characteristics of Antarctic krill pastes were also investigated via analysis of protein components, drip loss and sensory quality. The results indicated that the proteolytic enzymes of Antarctic krill pastes which originated from its digestive organs were stable during chilling storage. The Antarctic krill paste prepared without sufficient rinsing was under durative state of autolysis during storage. The autolysis characteristics of Antarctic krill pastes mainly embodied in protein degradation, rise of drip loss and deterioration of the sensory quality. The Antarctic krill paste prepared without rinsing was not suitable for storage at refrigerated temperature, since its autolysis phenomena were particularly remarkable. However, the autolysis characteristics of Antarctic krill paste prepared by rinsing twice were not significant. The sensory quality was not seriously deteriorated though protein degradation and rise of drop loss still existed. Therefore, the Antarctic krill paste being rinsed twice was suitable for storage at refrigerated temperature within a short period of time.

Antarctic krill paste; chilling storage; proteolytic enzyme; autolysis characteristics

TS254.4

A

1002-6630（2014）04-0200-05

10.7506/spkx1002-6630-201404041

2013-05-23

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目；浙江工商大學研究生科技創新項目（1110XJ1512119）

丁浩宸（1988—），男，碩士，研究方向為水產品加工。E-mail：dinghaochen1988@126.com

*通信作者：張燕平（1962—），女，副教授，學士，研究方向為水產生物化學。E-mail：zhangyanping@zjgsu.edu.cn