胱硫醚γ-裂解酶在缺氧缺血性腦病新生大鼠腎細(xì)胞凋亡中的作用

李文建 李易明 李勇 王冀 劉釗

胱硫醚γ-裂解酶在缺氧缺血性腦病新生大鼠腎細(xì)胞凋亡中的作用

李文建 李易明 李勇 王冀 劉釗

目的探討胱硫醚γ-裂解酶在缺氧缺血性腦病(HIE)新生大鼠腎臟腎細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。方法新生7 d Wistar大鼠制備HIE模型。分為假手術(shù)對照組和HIE組，于HIE后6 h、12 h、24 h和48 h處死大鼠，取腎臟組織，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測腎細(xì)胞凋亡情況;MPO檢測腎臟組織炎性損傷的程度;應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測腎細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)情況;應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡與p-JNK信號通路的關(guān)系。結(jié)果HIE組6 h腎臟陽性凋亡細(xì)胞開始增多，24 h達(dá)到高峰，各時間點(diǎn)陽性凋亡細(xì)胞均高于對照組(P＜0.05);HIE組6 h Bax陽性細(xì)胞表達(dá)開始增多，24 h達(dá)到高峰，各時間點(diǎn)陽性細(xì)胞均高于對照組(P＜0.05);HIE組6 h MPO的OD值增高，24 h達(dá)到高峰，各時間點(diǎn)OD值均高于對照組(P＜0.05);HIE組6 hp-JNK蛋白表達(dá)開始增多并24 h達(dá)到高峰;對照組CSE蛋白均高于HIE組(P＜0.05)，CSE隨時間逐漸降低。結(jié)論HIE新生大鼠腎臟細(xì)胞CSE蛋白表達(dá)降低，對腎臟細(xì)胞凋亡有抑制作用，其可能通過p-JNK信號通路實(shí)現(xiàn)的。

胱硫醚γ-裂解酶;缺氧缺血性腦病;腎臟細(xì)胞;凋亡;p-JNK

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)被認(rèn)為是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三類氣體信號分子［1］。H2S作為一種內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，可能通過抗氧化、抑制凋亡的發(fā)揮抗腦［2］、心［3］、肝［4］和腎［5］等器官缺氧缺血性損傷作用。缺氧缺血性腦病(HIE)是新生兒常見疾病之一，病死率高，其是圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致腦組織缺氧缺血性損傷［6］。HIE除腦組織缺氧缺血性損傷外［7，8］，腎臟為損傷的重要臟器之一。本研究通過在體水平實(shí)驗(yàn)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測HIE狀態(tài)下腎細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用髓過氧化物酶(MPO)活性測定腎臟炎癥損傷情況，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測腎細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)情況;應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測腎細(xì)胞凋亡信號通路與CSE蛋白表達(dá)的關(guān)系，為研究HIE新生兒腎細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD公司);大鼠MPO酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海生工公司);羊抗鼠Bax、CSE和p-JNK單抗(eBioscience公司);蛋白酶抑制劑、去磷酸化酶抑制劑和β-actin抗體(Sigma公司);Western blot試劑和標(biāo)準(zhǔn)Marker(Bio-Rad公司);流式細(xì)胞儀(BD公司);酶標(biāo)儀(美國 Invitrogen公司);蛋白電泳(Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 新生7 d Wistar大鼠，雌雄不限，共40只，隨機(jī)分為假手術(shù)對照組和HIE(6 h、12 h、24 h和48 h)組，每組8只。HIE組分離并結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，縫合皮膚，術(shù)后放回鼠籠恢復(fù)2 h;假手術(shù)對照組只予分離左側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎動脈，縫合皮膚。隨后，置于通有濕化的8%氧氣和92%氮?dú)獾幕旌蠚怏w的密閉玻璃器皿中，持續(xù)3～4 h制成新生大鼠HIE動物模型［9］。

1.3 標(biāo)本取材 HIE后6 h、12 h、24 h和48 h后處死大鼠，去除腎臟包膜，沿矢狀正中線切開，將腎臟皮質(zhì)分為4份，分別用于流式細(xì)胞術(shù)檢測、MPO活性測定、免疫組織化學(xué)和Western blot檢測。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Annexin V凋亡檢測腎臟細(xì)胞的凋亡情況:制備1×106cells/ml腎皮質(zhì)細(xì)胞，按照BD試劑盒說明書步驟完成Annexin V-FITC/PI雙染色后，PBS洗滌后，立刻上機(jī)檢測。

1.4.2 HIE腎臟細(xì)胞MPO活性測定:取部分腎皮質(zhì)組織，用玻璃勻漿器充分勻漿，按照試劑盒說明書進(jìn)行具體步驟操作，采用分光光度法測定OD值。

1.4.3 免疫組化檢測bcl-2蛋白表達(dá):石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗(Bax單抗)，室溫孵育1 h，加試劑A-聚合物增強(qiáng)劑，室溫孵育20 min，加試劑B-酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，室溫孵育30 min，再經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水、透明和封片。

1.4.4 Western blot檢測 CSE和 p-JNK信號通路情況:將腎皮質(zhì)用剪刀剪碎，按照蛋白抽提試劑盒說明提取蛋白并進(jìn)行蛋白定量。制備的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離，再以400 mA恒流電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入一抗4℃孵育過夜，次日TBS-T洗滌3次，10 min/次，加入辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再TBS-T洗滌3次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光檢測信號。

1.4.5 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，2組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用F檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，q檢驗(yàn)進(jìn)一步對多個樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡情況 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測對照組和HIE組細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示對照組陽性凋亡細(xì)胞為3.27%，HIE組6 h腎臟陽性凋亡細(xì)胞開始增多，24 h達(dá)到高峰，各時間點(diǎn)陽性凋亡細(xì)胞仍高于對照組(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 腎細(xì)胞凋亡活性的流式細(xì)胞術(shù)檢測

2.2 HIE腎臟細(xì)胞MPO活性測定 通過大鼠MPO酶聯(lián)免疫檢測試劑盒可定量檢測腎臟組織炎性損傷的程度。HIE狀態(tài)下，腎臟組織的炎性損傷的程度明顯高于假手術(shù)對照組，24 h達(dá)到高峰(P ＜0.05)。見表1。

表1 檢測腎臟細(xì)胞MPO活性測定U/ml，±s

表1 檢測腎臟細(xì)胞MPO活性測定U/ml，±s

注:與24 h 比較，*P ＜0.05

HIE 6 h HIE 12 h HIE 24 h HIE 48 h數(shù)值 1.32 ±0.42*1.69 ±0.38*2.02 ±0.69* 3.48 ±0.89 2.78 ±0.47組別 對照組*

2.3 5組大鼠腎臟組織Bax免疫組化染色結(jié)果比較應(yīng)用免疫組化染色顯示，HIE組Bax表達(dá)量明顯升高，可見大量棕褐色顆粒，而對照組中Bax的表達(dá)極低，幾乎看不到棕褐色顆粒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在HIE后24 h Bax表達(dá)達(dá)到高峰，明顯高于其他時間點(diǎn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖2。

圖2 5組大鼠腎組織Bax蛋白表達(dá)(免疫組化×200)

2.4 Western blot測定p-JNK信號通路的變化與CSE的相關(guān)性 HIE組p-JNK蛋白表達(dá)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，其中 HIE組中，24 h p-JNK表達(dá)明顯高于其他時間段;假手術(shù)對照組CSE蛋白表達(dá)高于HIE組，且隨時間逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖3。

圖3 5組大鼠腎組織的JNK和CSE蛋白表達(dá)

3 討論

研究表明，內(nèi)源性H2S代謝異常與多種系統(tǒng)疾病，包括循環(huán)、消化、神經(jīng)、呼吸等系統(tǒng)疾病發(fā)生關(guān)系密切［2－5，10，11］。內(nèi)源性 H2S 通過體內(nèi)的胱硫醚 β-合酶(cystathionine beta-synthase，CBS)和胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine γ lyase，CSE)催化生成。CBS 和 CSE 的表達(dá)具有組織特異性，腎臟中同時存在CBS和CSE表達(dá)，尤以CSE表達(dá)顯著，且H2S合成水平較高。腎臟在HIE發(fā)生過程中，通過研究H2S合成酶CSE蛋白表達(dá)，判斷H2S生成有何變化以及H2S能否通過緩解腎臟氧化應(yīng)激的發(fā)生而發(fā)揮保護(hù)作用，如果H2S有保護(hù)作用，其在體內(nèi)的作用途徑和具體機(jī)制是什么等都是本文研究的問題。

為探討CSE蛋白在缺氧缺血性腦病情況下腎臟細(xì)胞凋亡中的作用，我們以HIE腎細(xì)胞為靶細(xì)胞，首先利用流式細(xì)胞術(shù)檢測HIE大鼠腎臟細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明，HIE過程中，腎臟細(xì)胞存在凋亡現(xiàn)象，且24 h到達(dá)頂峰。近來研究表明，在HIE模型中，炎癥在缺氧缺血性腦病中發(fā)揮重要作用，誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡［12，13］。經(jīng)腎臟組織MPO活性測定，進(jìn)一步證實(shí)HIE發(fā)生時，腎臟組織發(fā)生炎性損傷，且炎性損傷程度趨勢與腎細(xì)胞凋亡趨勢相一致。

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)又稱為應(yīng)激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，其是絲裂素活化蛋白激酶(Mitogen activated protein linases，MAPK)三條并行信號通路之一［14］。JNK/SAPK信號通路可被氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1)、生長因子(EGF)等激活，將信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部，使核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子c-Jun氨基末端63及73位的絲氨酸殘基磷酸化，進(jìn)而激活c-Jun而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。

在HIE大鼠模型中，通過何種信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們利用免疫印跡檢測HIE發(fā)生后腎臟細(xì)胞不同時間JNK活化和CSB蛋白表達(dá)的改變。HIE組中，24 h p-JNK蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，各時間點(diǎn)均高于對照組;而假手術(shù)對照組CSE蛋白均高于HIE組，且隨時間點(diǎn)逐漸降低。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明缺氧缺血的狀況下，炎性因子分泌增加，其做為上游因子可激活MAPK家族成員［15］，如JNK/SAPK，其通過下游的因子激活凋亡蛋白，促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡過程，造成其合成分泌的CSE含量的下降，從而其催化生成的H2S含量下降，無法發(fā)揮其抗炎作用［16］，以上結(jié)果提示JNK磷酸化有促凋亡作用以及H2S在HIE發(fā)生時，發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，本研究證實(shí)在HIE新生大鼠腎臟細(xì)胞缺氧缺血的狀態(tài)下，CSE蛋白表達(dá)下降，同時能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌增加，從而激活JNK/SAPK信號傳導(dǎo)通路，激活凋亡蛋白，引起腎細(xì)胞凋亡。

1 Li L，Moore PK.Putative biological roles of hydrogen sulfide in health and disease:a breath of not so fresh air.Trends Pharmacol Sci，2008，2:84-90.

2 Pan TT，Neo KL，Hu LF，et al.H2S preconditioning-in-duced PKC activation regulates intracellular calcium handling in rat cardiomyocytes.Am J Physiol Cell Physiol，2008，294:C169-C177.

3 劉運(yùn)平，張建新.內(nèi)源性硫化氫對心肺循環(huán)系統(tǒng)作用研究進(jìn)展.河北醫(yī)藥，2006，28:1194-1195.

4 Bosy-Westphal A，Petersen S，Hinrichsen H，et al.Increased plasma homocysteine in liver cirrhosis.Hepatol Res，2001，20:28-38.

5 Xia M，Chen L，Muh RW，et al.Production and actions of hydrogen sulfide.A novel gaseous bioactive substance，in the kidneys.J Pharmacol Exp Ther，2001，29:1355-1357.

6 Perlman M，Shah PS.Hypoxic-ischemic encephalopathy:challenges in outcome and prediction.J Pediatr，2011，158:51-54.

7 Gunn AJ，Thoresen M.Hypothrmic neuroprotection.Neuro Rx，2006，3:154-169.

8 Yang D，Nemkul N，Shereen A，et al.Therapeutic administration of plasminogen activator inhibitor-1 prevents hypoxic-ischemic brain injury in newborn.J Neurosci，2009，29:8669-8674.

9 Vannucci RC，Vannucci SJ.Perintal hypoxic-ischemic brain damage:E-volution of an animal model.Dev Neurosci，2005，27(2/4):81-86.

10 Partlo LA，Sainsbury RS，Roth SH.Effects of repeated hydrogen Sulfide，(H2S)exposure on learning and memory in the adult rat.Neuro Toxicology，2001，22:177-189.

11 Furnea J，Springfielda J，Koeniga T，et al.Oxidation of hydrogen sulfide and methanethiol to thiosulfate by rat tissues:a specialized function of the colonic mucosa.Biochem Pharmacol，2001，62:255-259.

12 Wixey JA，Reinebrant HE，Spencer SJ，et al.Efficacy of post-insult minocycline administration to alter long-term hypoxia-ischemia-induced damage to the serotonergic system in the immature rat brain.Neuroscience，2011，19:184-192.

13 張耕，侯亞利，趙自剛，等.腸淋巴途徑在二次打擊致大鼠腎功能衰竭中的作用.中國微循環(huán)，2007，11:353-355.

14 Blachon S，Bellanger S，Demeret C，et al.Nueleo-cytoplasmic shuttling of high risk human Papillomavirus E2 proteins induces apoptosis.J Biolchem，2005，280:36088-36098.

15 Wang XJ，Kong KM，Qi WL，et al.Interleukin-1 beta induction of neuron apoptosis depends on p38 miftogen-activated protein kinase activity after spinal cord injury.Acta Pharmacol Sin，2005，26:934-942.

16 Gadalla MM，Snyder SH.Hydrogen Sulfide as a Gasotransmitter.J Neurochem，2010，113:14-26.

The role of cystathionine γ lyase in the apoptosis of renal cells of neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy

LI Wenjian*，LI Yiming，LI Yong，et al.*Department of Immunology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China

ObjectiveTo investigate the effect of cystathionine γ lyase on apoptosis of renal cells of neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE)，and to explore its action mechanism.MethodsThe Wistar rats(7 －day age)were prepared as HIE model，which were randomly divided into sham － operation control group and HIE group.The rates were executed at 6h，12h，24h，48h after HIE to obtain kidney tissues.The apoptosis condition of renal cells was detected by flow cytometry，the degree of inflammatory injury of renal tissue was observed by MPO，Bax protein expression was determined by immunohistochemistry，and the correlation between renal cell apoptosis and p-JNK signaling pathway was analyzed by Western Blot.ResultsIn HIE group，positive apoptosis cells were increased at 6h and peaked at 24h，and the positive apoptosis cells in different time points were significantly higher than those in control group(P ＞0.05).The OD value of MPO in HIE group was increased at 6h，which reached peak at 24h，and the OD value in different time points was significantly higher than that in control group(P ＜0.05).The expression levels of p-JNK protein were increased at 6h and peaked at 24h.The expression levels of CSE protein in control group were significantly higher than those in HIE group(P ＜0.05)，furthermore，which were gradually decreased with the time going on.ConclusionThe expression levels of CSE in renal cells of neonatal rats with HIE are decreased，which has inhibitory effect on renal cell apoptosis，which may be realized through p-JNK signaling pathway.

cystathionine γ lyase;HIE;renal cell;apoptosis;p-JNK

R 742.8

A

1002－7386(2014)14－2085－03

10.3969/j.issn.1002 －7386.2014.14.001

050017 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研室(李文建)，臨床學(xué)院(李易明、李勇、劉釗)，教務(wù)處(王冀)

劉釗 050031 河北醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院;E-mail:liwenjian969@sohu.com

2014－01－11)