結(jié)球甘藍離體葉片不定芽的再生研究

黃小云，陶 鵬，王五宏，李必元，岳智臣，雷娟利，鐘新民

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，浙江杭州 310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095）

結(jié)球甘藍離體葉片不定芽的再生研究

黃小云1，2，陶 鵬1，王五宏1，李必元1，岳智臣1，雷娟利1，鐘新民1

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，浙江杭州 310021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095）

以結(jié)球甘藍強力50組培苗葉片為外植體，研究不同激素配比、苗齡對其不定芽再生的影響。結(jié)果表明，在不含任何激素以及單獨添加不同濃度的6?BA或NAA的MS培養(yǎng)基上，均不能誘導(dǎo)外植體不定芽的分化；結(jié)球甘藍離體葉片不定芽在MS＋6?BA 2 mg·L-1＋NAA 0.80 mg·L-1分化培養(yǎng)基上再生頻率最高，為79.86%，最適宜的苗齡為8 d；外植體在生根培養(yǎng)基1／2 MS＋0.30 mg·L-1NAA中，不定芽的生根效果好，生根率達100.0%，且根系生長健壯。

結(jié)球甘藍；不同激素配比；葉片；離體培養(yǎng)

結(jié)球甘藍（Brassica oleracea L.var.capitata L.）是十字花科蕓薹屬植物，是我國重要的蔬菜作物之一。近年來采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因?qū)虢Y(jié)球甘藍，已成為培育抗逆新品種的一種新手段，而建立穩(wěn)定可靠的高效離體再生體系是利用基因工程和其他技術(shù)育種的基礎(chǔ)。在結(jié)球甘藍離體培養(yǎng)研究中，以下胚軸作為外植體的研究最多［1-6］，且獲得高效高頻再生體系。葉綠體轉(zhuǎn)基因植物作為一種新型生物反應(yīng)器，具有外源蛋白表達量高和環(huán)境安全性好等優(yōu)點［7］，而葉片作為葉綠體轉(zhuǎn)基因植物最理想的外植體，研究其離體再生具有重要意義。本試驗以結(jié)球甘藍強力50（簡稱QL50）為材料，研究了不同激素配比、苗齡對離體子葉不定芽再生的影響，以期建立高效的植株再生體系，為今后通過葉綠體基因組遺傳轉(zhuǎn)化獲取預(yù)期優(yōu)良性狀的結(jié)球甘藍創(chuàng)造條件，并為進一步有效地開展結(jié)球甘藍葉綠體基因工程的研究奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為結(jié)球甘藍QL50，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，取其無菌實生苗葉片為外植體。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗培養(yǎng)

選取籽粒飽滿、大小均一的甘藍種子，用清水沖洗干凈，置于75%的酒精中浸泡30 s，用0.1%的HgCl2表面消毒5 min，最后用無菌水沖洗4次，再用滅菌濾紙吸去種子表面的水分，接種于無激素的MS基本培養(yǎng)基（蔗糖30 g·L-1＋瓊脂9 g· L-1，pH值5.8）上。于（25±2）℃、光照強度1 800 lx，16 h光／8 h暗的光周期條件下培養(yǎng)無菌苗。

1.2.2 不同激素組合試驗

試驗2種激素的不同組合，6?芐氨基腺嘌呤（6?BA）濃度為0，1，2，3，4 mg·L-1，萘乙酸（NAA）濃度為0，0.02，0.04，0.20，0.40，0.80 mg·L-1，進行完全隨機組合。在材料苗長約7 cm，切取0.3 cm×0.3 cm的葉片放入加有不同激素組合的MS分化培養(yǎng)基中。用培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)，每皿接種30個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d，觀察不定芽的分化情況，30 d后統(tǒng)計出芽情況。

1.2.3 苗齡試驗

在篩選出來的出芽較好的培養(yǎng)基上，取7，8，9，10，11，12 d苗齡的外植體接種。培養(yǎng)30～35 d，統(tǒng)計不定芽分化率。

1.2.4 不定芽生根與植株移栽

當分化培養(yǎng)基中的不定芽長到1.5～2.5 cm時，切取后接種至含不同濃度生長素的生根培養(yǎng)基（1／2MS＋0.30 mg·L-1NAA，1／2MS＋0.50 mg· L-1NAA）上直接誘導(dǎo)生根。待芽基部形成大量的毛根后，打開培養(yǎng)瓶口，煉苗4～5 d后取出小植株，洗凈根部，移栽到基質(zhì)中，一周后觀察其成活率和生長狀況。

1.3 不定芽再生頻率與生根率的計算

不定芽再生頻率／%＝（再生不定芽的外植體數(shù)／接種外植體總數(shù)）×100；不定芽再生系數(shù)＝外植體再生的不定芽總數(shù)／再生不定芽的外植體總數(shù)；褐化率／%＝（褐化芽數(shù)／總外植體數(shù)）×100；生根率／%＝（生根不定芽／接種不定芽數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對不定芽再生及葉片褐化的影響

2.1.1 不定芽再生

外植體接種于不同激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，5 d左右開始膨大變厚；10 d后，6?BA濃度為1，2 mg·L-1的處理膨大明顯于3，4 mg·L-1的處理，其中3mg·L-16?BA膨大最弱，但是處理10和處理15即在6?BA濃度為1，2 mg·L-1的處理比濃度為3 mg·L-1的稍弱；接種20 d后，處理10和處理15已開始出芽，大部分不定芽于接種后30～35 d產(chǎn)生，接種45 d后仍有少數(shù)不定芽的產(chǎn)生。由表1中可知，在MS培養(yǎng)基上單獨添加6?BA或NAA任何一種物質(zhì)，甘藍葉片均不能再生出不定芽，在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上，也不能再生不定芽，而同時添加6?BA和NAA的各處理均能誘導(dǎo)出不定芽（圖1中A，B），可見6?BA和NAA對于誘導(dǎo)甘藍葉片不定芽再生都是必要的。當6?BA濃度一定時，0.04 mg·L-1NAA的處理不定芽再生率最低，而0.80 mg·L-1NAA的處理不定芽再生率偏高；當NAA濃度一定時，3 mg·L-16?BA處理不定芽再生率總體偏低；而當6?BA或NAA濃度一定時，隨著NAA或6?BA濃度的增加，其不定芽再生率和再生系數(shù)大多表現(xiàn)出先高后低再高趨勢，處理15的不定芽再生率顯著高于其他處理，達到79.86%，而處理6的不定芽再生系數(shù)顯著高于其他處理，達到0.72，但不定芽再生率較低，只有18.06%。總的來看，處理15最優(yōu)，處理10次之。

表1 6?BA與NAA不同配比對結(jié)球甘藍離體葉片不定芽再生的影響

2.1.2 葉片褐化

由表2可知，當6?BA濃度一定時，褐化率隨著NAA的增大而減少，尤其是在NAA濃度為0.40 mg·L-1時，褐化率達到最低，但當NAA到0.80 mg·L-1，褐化率開始增大；當NAA濃度一定時，6?BA濃度的變化，對褐化率的影響似無規(guī)律。總的來看，除了MS＋4 mg·L-16?BA＋0.02 mg· L-1NAA這個處理外，在NAA濃度大于0.04mg· L-1的所有處理，褐化率都低于10%，而在NAA為0.40mg·L-1時，褐化率均達到最低，且在MS＋1 mg·L-16?BA＋0.40mg·L-1NAA，MS＋2mg· L-16?BA＋0.40 mg·L-1NAA，MS＋4 mg·L-16?BA＋0.40 mg·L-1NAA處理時，褐化率最低達到0。

圖1 QL50葉片離體再生系統(tǒng)的情況

表2 不同處理對結(jié)球甘藍葉片離體再生黃褐化的影響

2.2 苗齡對不定芽再生的影響

不同苗齡的葉片對再生植株的形態(tài)發(fā)生有很大影響。由表3可知，當苗齡7 d和12 d時，其再生率和再生系數(shù)均偏低，而褐化率偏高，可見苗齡偏小或偏大都不適宜甘藍葉片不定芽的再生；總的來看，當苗齡為8 d時，表現(xiàn)出再生率和再生系數(shù)最高而褐化率最低，因此最適宜苗齡為8 d。

表3 不同苗齡對結(jié)球甘藍離體葉片不定芽再生的影響

2.3 不同生長素濃度對不定芽誘導(dǎo)生根的影響

不定芽生根是植株再生必不可少的一步，有研究表明［4，5，8-11］，生根培養(yǎng)常用的是1／2MS培養(yǎng)基和NAA。由表4可知，不定芽在1／2MS＋0.3mg· L-1NAA培養(yǎng)基上效果更好；雖然2種處理不定芽的生根率均達到100%，但是NAA濃度為0.3 mg· L-1時，主根較粗且多（圖1中C），而NAA濃度為0.5 mg·L-1時，主根較少而須根多（圖1中D）。不定芽在生根培養(yǎng)基中20 d后可形成較多的不定根，此時獲得完整的再生植株（圖1中E）。再生植株經(jīng)馴化煉苗后移入營養(yǎng)缽中，套塑料袋保濕。1周后去袋，再培養(yǎng)15 d左右，移栽到大花缽中讓其充分生長（圖1中F），直至現(xiàn)蕾、開花。

表4 不同生長素濃度對不定芽誘導(dǎo)生根的影響

3 小結(jié)與討論

葉綠體基因工程是以葉綠體基因組為平臺進行遺傳操作，與核轉(zhuǎn)基因相比具有明顯的優(yōu)越性：外源基因的高效表達，基因的原核表達形式，無位置效應(yīng)和基因沉默現(xiàn)象，環(huán)境安全性好［12］。目前已經(jīng)有許多作物品種通過葉綠體基因工程獲得了抗除草劑、抗蟲、抗病、耐鹽耐旱的特性［13］。葉綠體轉(zhuǎn)基因植物雖是生物反應(yīng)器的理想系統(tǒng)，但葉綠體轉(zhuǎn)基因仍面臨著許多挑戰(zhàn)，高效葉片再生體系的建立更是當務(wù)之急。目前，Liu等［14］已成功進行了甘藍葉綠體轉(zhuǎn)化，這表明甘藍進行葉綠體轉(zhuǎn)基因是可行的而且具有前景，探索結(jié)球甘藍葉片離體再生體系為葉綠體轉(zhuǎn)基因奠定了基礎(chǔ)。

植物生長調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)不定芽分化的重要因素，一般來說細胞分裂素和生長素的比率決定著器官分化的類型，當細胞分裂素占優(yōu)勢時有利于芽的分化，當生長素占優(yōu)勢時有利于根的分化［15］。在蕓薹屬植物組織培養(yǎng)中能分化出再生植株的培養(yǎng)基大多采用6?BA和NAA的激素組合。本試驗中，在不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上，或只含有6?BA和NAA任一激素的培養(yǎng)基中，葉片均不能誘導(dǎo)出不定芽，而只在6?BA和NAA適宜濃度配比時能誘導(dǎo)出大量的不定芽，這說明在不定芽的誘導(dǎo)過程中，細胞分裂素和生長素都是必須的，并且要求適宜的激素配比才能高效地誘導(dǎo)外植體不定芽的產(chǎn)生，這與李光遠等［4，9-10，16-21］的試驗結(jié)果一致。

葉片的生理狀態(tài)也是影響再生的一個關(guān)鍵因素，適宜的苗齡有助于提高不定芽再生率。本研究結(jié)果表明，不同的苗齡對于不定芽再生存在差異性，苗齡偏小（7 d）或偏大（12 d）都不適宜甘藍葉片不定芽的再生，再生率低，褐化較多；當苗齡8 d時，再生率和再生系數(shù)高而褐化率最低，適宜誘導(dǎo)不定芽的再生。

根系健壯是獲得完整再生植株的重要保證，在不定根形成過程中，生長素起著主要作用［22］，1／2MS培養(yǎng)基較少的養(yǎng)分含量，反而有利于植物為了吸收營養(yǎng)而生根來適應(yīng)環(huán)境。本研究結(jié)果表明，NAA對于不定芽的生根具有良好的誘導(dǎo)效果。在1／2MS＋0.3 mg· L-1NAA處理下，不定芽生根率達到100%，且根系健壯。在生根培養(yǎng)中，應(yīng)該注意選擇長勢好的不定芽進行生根誘導(dǎo)以獲得健壯的再生植株，同時一定要洗盡根系上附著的培養(yǎng)基，以防止霉變而降低移栽成活率。當外部環(huán)境不適宜培養(yǎng)時，選擇光溫培養(yǎng)箱進行移栽培養(yǎng)會提高成活率。

愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及形態(tài)建成主要受外植體本身、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境3大因素的調(diào)控，在綜合條件適宜的情況下更易獲得再生植株。本試驗中甘藍葉片離體的再生率偏低，還有葉片褐化的現(xiàn)象。AgNO3通常作為乙烯抑制劑而在組織培養(yǎng)中使用，它可以促進外植體分化、防止褐化，從而可以較大幅度地提高再生頻率及再生芽數(shù)［23］。今后可利用AgNO3，進一步調(diào)整不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合及不同基因型葉片對再生不定芽的影響，使獲得的再生體系具有良好的通用性。

［1］ 薛紅衛(wèi)，衛(wèi)志明.甘藍下胚軸原生質(zhì)體高效成株系統(tǒng)的建立［J］.實驗生物學(xué)報，1994，27（2）：259-269.

［2］ 周禾，郭蓓，楊起簡.甘藍下胚軸離體培養(yǎng)直接分化成苗的研究［J］.北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1995，10（1）：12-15.

［3］ 何小蘭，吳敬音，朱衛(wèi)民，等.6?BA和AgNO3對甘藍型油菜帶柄子葉外植體不定芽再生的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2001，17（4）：211-214.

［4］ 李光遠，王宜娜，王鳳華.不同激素對結(jié)球甘藍下胚軸離體培養(yǎng)的影響［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2007，13（15）：59-60.

［5］ 李貴，陶鵬，李必元，等.結(jié)球甘藍離體下胚軸不定芽再生研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（12）：1644-1647.

［6］ 胡張華，朗春秀，劉智宏，等.甘藍型油菜下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，14（5）278-280.

［7］ 崔柳青，李一帆，潘衛(wèi)東.葉綠體基因工程研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2012（6）：1-6.

［8］ 侯喜林，曹壽椿.不結(jié)球白菜子葉離培養(yǎng)再生植株［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，17（3）：60-64.

［9］ 張高翔，張恩慧，許忠民，等.春甘藍腋芽葉片離體培養(yǎng)及植株再生技術(shù)研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2009（5）：166-170.

［10］ 許念芳，張恩慧，李殿榮，等.甘藍CMS下胚軸和子葉的離體培養(yǎng)與植株再生研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2010，38（4）：115-120.

［11］ 呂艷艷，王桂萍，沈振國，等.不結(jié)球白菜亮白葉再生體系的優(yōu)化［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（23）：93-96.

［12］ 羅昌，黃叢林，張秀海，等.葉綠體基因工程在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（24）：11968-11971.

［13］ 王金輝，李軼女，倪丕沖，等.葉綠體轉(zhuǎn)化體系研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2012（1）：1-6.

［14］ Liu C W，Lin C C，Chen J JW，et al.Stable chloroplast transformation in cabbage（Brassica oleracea L.var.capitata L.）by particle bombardment［J］.Plant Cell Reports，2007，26（10）：1733-1744.

［15］ 李浚明，朱登云.植物組織培養(yǎng)教程［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2005：255-256.

［16］ 侯喜林，曹壽椿.不結(jié)球白菜子葉離培養(yǎng)再生植株［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，17（3）：60-64.

［17］ 趙秀樞，李名揚，張文玲，等.觀賞羽衣甘藍高頻再生體系的建立［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（1）：141-148.

［18］ 呂爽，王超.結(jié)球甘藍離體培養(yǎng)的研究進展［J］.北方園藝，2004（3）：6-7.

［19］ 高乃波，劉曉光，施曼玲.雪里蕻高效再生體系的建立［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（2）：2149-153.

［20］ 王俊生，范小芳，譚光軒，等.甘藍型黃籽油菜高油品系下胚軸再生體系研究［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（1）：45-48.

［21］ 郝曉云，沈海濤，李鴻彬.甘藍型油菜下胚軸和帶柄子葉再生體系研究［J］.生物技術(shù)通報，2013，1（4）：69-74.

［22］ 王艷，曾幼玲，張富春，等.新疆甘藍型油菜下胚軸的組織培養(yǎng)和植株再生研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，42（1）：24-28.

［23］ 劉娟，湯浩茹，王小蓉，等.硝酸銀在植物離體培養(yǎng)中的應(yīng)用之研究進展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（10）：400-406.

（責任編輯：張才德）

S 635.1 < class="emphasis_bold">文獻標志碼：A

A

0528?9017（2014）01?0034?04

文獻著錄格式：黃小云，陶鵬，王五宏，等.結(jié)球甘藍離體葉片不定芽的再生研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（1）：34-38.

2013?08?22

浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項（2012C12903?6?2）；浙江省博士后科研項目（Bsh1202084）；浙江省蔬菜產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團隊項目（2009R50026）

黃小云（1989-），女，湖北孝感人，碩士，主要從事蔬菜作物遺傳育種研究工作。E?mail：yunxiaohuang1107＠126.com。

鐘新民，E?mail：zxm lly＠hotmail.com。